EKPRESI TROMBOMODULIN PLASENTA PADA ABORTUS BERULANG

Abstrak

Latar belakang :
............berhubunngan dengan insufisiensi trofoblas dan defek koagulasi. Trombomodulin
adalah protein antikoagulan pada endotel yang terlibat dalam kontrol hemostasis dan
inflamasi pada pembuluh darah dan juga sebagai kofaktor dari jalur antikoagulan vitamin C.

Pembahasan :
Kami mengevaluasi ekpresi trombomodulin pada jaringan plasenta dan abortus spontan
berulang dan aborsi normal sebagai kontrol. Penentuan mRNA trombomodulin
menggunakan real time kuantifikasi PCR. Pengurangan kadar ekpresi trombomodulin
ditemukan pada kelompok abortus berulang dibandingkan kontrol (berkurang 1,82 kali)
pengurangan ekspresi trombomodulin pada kelompok abortus spontan sebesar 45% (dari
kelompok kontrol Delta CT) dibandingkan kelompok kontrol.

Kesimpulan :
Kami tidak dapat menyatakan saat ini arti dari pengurangan ekpresi trombomodulin pada
jaringan plasenta. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan jalur biologis dari
trombomodulin terhadap fisiopatologi trofoblas dan biologi reproduksi.

Latar Belakang

Trombomodulin (TM) adalah reseptor glikoprotein yang terdiri atas 559 residu asam amino
dan terekspresikan terutama pada permukaan endotel pembuluh darah dan sinsititrofoblas
plasenta. Trombomodulin tersusun atas domian struktural yang berbeda yaitu modul lectin
N-terminal, daerah hidrofobik, 6 molekul EGF berulang, daerah yang kaya Ser/Thr, daerah
transmembran dan ekor sitoplasmik yang pendek. Reseptor membran terglikosilasi ini untuk
mengaktifkan faktor koagulasi IIa pada trombomodulin endotel intak membentuk kompleks
dengan trombin yang bertanggungjawab mengubah protein C menjadi protein C teraktivasi.
Kompleks trombomodulin-trombin menyeimbangkan spesifitas substrat trombin, bagian
prokoagulannya dihilangkan, dan meningkatkan konversi protein C menjadi protein C
teraktivasi. Protein S dan protein C teraktivasi membelah melalui mekanisme proteolitik
faktor koagulasi Va dan VIIIa teraktivasi : semua proses kompleks ini menginaktifkan
kompleks enzimatik yang membuat faktor koagulasi Xa dan trombin menjadi aktif. Jika faktor
inhibitor koagulasi darah trombomodulin tidak terdapat pada sel-sel trofoblas plasenta tikus,
terjadi penundaan morfogenenesis plasenta yang fatal, menyebabkan kegagalan embrio
karena aktivasi faktor inisiasi jaringan dari koagulasi darah menurun pada hubungan fetus-
ibu. Selain itu, TM menggabungkan respon fibrinolitik dan anti-inflamasi yang juga tidak
bergantung pada protein C dan trombin. Analisis pada tikus coba yang berbeda
menunjukkan ....... dan fungsi organ spesifik terhadap TM, sebagian besar khususnay
terdapat pada pembuluh darah plasenta. Pada tikus coba ini, ekpresi keparahan dan
fenotipik trombomodulin sangat bervariasi dan tergantung pada interaksi antara faktor
genetik sekunder atau lingkungan. Strain tikus mutan ............... pentingnya aspek trombofilia
dan trombosis pada manusia.

Fungsi TM berada pada dua jaringan yang berbeda yaitu pada jaringan ektra-embrionik non-
endotel, yang dibutuhkan untuk fungsi yang lebih sesuai apad awal pembentukan plasenta,
pada pembuluh darah endotel embrionik .............. menyebabkan koagulopati konsumtif
letal.

Pembahasan

Berdasarkan latar belakang tersebut, kami melakukan penelitian kasus terkontrol prospektif
yang mengukur ekpresi gen trombomodulin pada jaringan plasenta yang berasal dari
abortus berulang spontan dan abortus yang disengaja melalui teknik kuantitatif Real-Time
PCR untuk menjelaskan peran trombomodulin terhadap abortus pada manusia.

Jaringan trofoblas diperoleh selama proses pembedahan uterus pada 11 wanita yang
mengalami abortus berulang dan 20 dari wanita hamil primipara sehat yang melakukan
terminasi kehamilan sesuai umur gestasi. Abortus berulang didefenisikan sebagai terjadinya
abortus berulang tiga kali berturut-turut sebelum gestasi berumur 20 minggu.
Pada kelompok abortus berulang yang diambil hanya pasien yang mengalami abortus (<12
jam) yang telah berada di rumah sakit untuk penanganan abortus.

Semua wanita yang terlibat dalam penelitian memiliki menstruasi teratur dengan panjang
siklus <35 hari. Riwayat klinis detail tiap pasien dicatat dan hanya wanita yang tanggal
menstruasinya pasti mengikuti penelitian. Kriteria eksklusi spesifik untuk semua wanita yang
mengikuti penelitian adalah hamil karena teknologi reproduksi berbantu, diabetes
gestasional, diabetes melitus, riwayat merokok dan hipertensi, proteinuria, gangguan ginjal,
hepatik kardiovaskular, dan penyakit endokrin, gangguan metabolik dan infeksi baru atau
memiliki riwayat semua infeksi. Lebih jauh, wanita yang terlibat penenlitian tidak menderita
gangguan tiroid, gangguan kongenital atau trombofilik turunan atau anomali kromosom atau
fetus dan uterus lainnya.

Tidak satupun wanita yang memiliki gambaran klinis non-obstetrik terhadap sindrom
antifosfolipid (seprti riwayat trombosis, trombositopenia autoimun, lupus eritomatosus
sistemik atau kondisi autoimun lainnya). Semua wanita hasil uji antikoagulan lupusnya
negatif dan antibodi antikardiolipin kurang dari 20 IgG phospholipid-binding unit. Selain itu,
tidak satupun wanita yang mengkonsumsi obat reguler termasuk obat-obatan antihipertensi
atau MgSO4 sebelum dan setelah penelitian dan tidak satupun kontrol yang mengkonsumsi
kontrasepsi oral; hanya asam folat (400 µg/hari) dan menjalani diet yang sama untuk semua
kelompok.

Sejak trimester pertama sejumlah sel tipe lainnya terdapat dalam stroma vilus plasenta
seperti fibroblas, miofibroblas, sel-sel otot halus, perisit dan sel-sel endotel seperti juga
sel-sel darah fetus dan ibu yang berpotensi sebagai kontaminan, jaringan berasal dari
kuretase dicirikan dengan menggunakan antibodi samapi antibodi sitokeratin spesifik untuk
7 isoform untuk memperoleh purifikasi trofoblas tingkat tinggi.

Semua spesimen disimpan beku dalam nitrogen cair dan simpan pada suhu -80°C sampai
digunakan. Lama waktu yang digunakan untuk proses adalah kurang dari 10 menit.
Penelitian dilakukan berdasarkan prinsip Deklarasi Helsinki yang telah direvisi tahun 2001.
Penelitian ini disetujui oleh komisi etik lokal dan informed consent diberikan kepada semua
wanita yang mengikuti penelitian. Potongan jaringan beku (20-40 mg) dihomogenisasi dalam
larutan bufer dan RNA total diekstraksi menggunakan RNA isolation kit (Promega, Madison,
WI). Sampel RNA diuji menggunakan absorpsi ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm
untuk menentukan konsentrasi RNA. Kualitas dan konsentrasi sampel RNA selanjutnya
dikonfirmasi dengan elektroforesis pada gel agarosa 1% terdenaturasi. 2 µg RNA
ditranskripsi terbalik dalam volume total 25 µl selama 60 menit suhu 37°C dengan M-MLV
Reverse Trancriptase (Promega, Madison, WI) menngunakan nonamer random agar
diperoleh DNA komplemen (cDNA). cDNA digunakan untuk real time kuatitatif PCR.
Untuk menghindari hasil uji false-positive ditambahkan amplifikasi dari DNA genom
terkontaminasi pada preparasi cDNA, primer yang dipilih mengapit intron dan efisiensi pCR
diuji dan ditemukan hasilnya mendekati 1. Berikut adalah primer yang digunakan :
5’CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’ (maju), 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’ (terbalik)
untuk β-aktin, dan 5’-TAACGAAGACACAGACTGCGATT-3’ (maju) dan
5’-ACCTTGACCTCGTGGGCTAG3’ (terbalik) untuk trombomodulin. Gen yang dijalankan untuk
duplikasi menggunakan pewarna SYBR hijau. Semua sampel yang diperoleh dari setiap
kehamilan diuji 3 kali menggunakan referensi gen β-aktin untuk menormalkan data
untukmengkoreksi variasi kualitasdan kuantitas RNA. Untuk meningkatkan akurasi dari
normalisasi, gen penjaga kedua (GADPH) digunakan. Tidak terdapat perbedaan yang
signifikan pada kadar ekspresi trombomodulin dengan menggunakan kontrol endogen
tambahan. Deteksi langsung terhadap produk PCR dengan pengecatan SYBR hijau yang
mengikat DNA untai ganda setelah setiap siklus. Pengukuran ini kemudian diplot versus
jumlah siklus. Parameter Ct (batas siklus) didefenisikan sebagai jumlah siklus di mana tanda
fluorosens tredeteksi di atas batas yang teramati. Produk-produk real-time PCR juga
dielektroforesis pada gel agarosa 2% dan ukuran intensitas aplikasi yang diharapkan
dievaluasi (gambar 1). Perubahan lipatan pada ekpresi gen relatif dihitung dengan rumus
2-Δ(ΔCt) di mana ΔCt = Ct (thrombomodulin) - Ct (bactin) dan Δ(ΔCt) = rata-rata ΔCt (plasenta
patologis) – rata-rata ΔCt (plasenta normal). Dilakukan uji Mann-Whitney U digunakan untuk
membandingkan data dari kontrol dan plasenta patologis. Perbedaan dianggap signifikan jika
p <0,05. Hasil yang diperoleh sebagai “perubahan kelipatan” pada ekpresi relatif gen dari
kelompok plasenta patologis dibandingkan kontrol. Semua nilai ekpresi gen adalah nilai rata-
rata ΔCt ± standar deviasi, median ΔCt serta kuartil pertama dan ketiga. Kedua kelompok
dibandingkan untuk usia ibu dan usia gestasi, karakteristikpasien yang mengikuti penelitian
dilaporkan dalam tabel 1. Pengurangan kadar ekspresi trombomodulin terdapat pada
kelompok abortus berulang dibandingakn kontrol (berkurang 1,82 kali) dibandingkan
ekspresi trombomodulin pada kelompok abortus spontan yang berkurang 45% (dari
kelompok kontrol ΔCt) yang sebanding dengan kelompok kontrol (gambar 2).

Trombomodulin merupakan protein yang terlibat dalam koagulasi, kanker dan

embriogenesis. Perubahan proses koagulais menyebabkan kegagalan plasenta prekoks,
tetapi beberapa penelitian menekankan bahwa trombomodulin memiliki kemampuan
anti-inflamasi melalui mekanisme baik dependen protein C maupun independen. Aktivasi
jalur koagulasi menyebabkan loop umpan balik positif yang mengandung penekanan
trombin yang diperantarai dari aktivasi trombomodulin yang dependen protein C : hal ini
menunjukkan hubungan yang tepat antara koagulasi dan inflamasi yaitu dua proses yang
saling meningkatkan satu sama lain menyebabkan kerusakan vaskular plaenta awal. Dalam
kehamilan, fibrinolisis dikontrol oleh plasenta dan endotel maternal, keduanya merupakan
penyebab utama beberapa gangguan patologis obstetrik. Beberapa penelitian telah
membahas bahwa kadar trombomodulin plasma dapat menyebabkan kerusakan endotel
vaskular plasenta pada bayi lahir berat rendah. Sebaliknya, beberapa penelitian berfokus
pada peran trombomodulin dalam kapabilitasdan invasivitas sel untuk melakukan intravasasi
dan ekstravasasi selama invasi lokal.

Dalam penelitian ini kami menemukan ekspresi trombomodulin pada jaringan plasenta
berkurang pada wanita yang mengalami abortus spontan berulang berdasarkan Real-Time
kuantitatif PCR.

Hasil penelitian ini memastikan pengamatan bahwa hilangnya fungsi trombomodulin

menyebabkan kematian awal embrio pasca implantasi, yang mendasari ekpresi
trombomodulin pada sel-sel plasenta non-endotel dibutuhkan untuk awal fungsi plasenta
yang normal. Dengan hipotesis ini, ketiadaan trombomodulin pada endotel pembuluh darah
dapat menyebabkan aktivasi berlebihan dari sistem koagulasi darah embrionik. Kami tidak
dapat menyatakan saat ini secara pasti manfaat dari berkurangnya ekpresi trombomodulin
pada jaringan plasenta. Penelitian lebih lanjut dibutuhkan diperlukan untuk menjelaskan
jalur biologis dari trombomodulin terhadap fisiopatologi dan biologi reproduksi trofoblas.