LAPORAN PRAKTIKUM BIOSAINS DAN BIOTEKNOLOGI

ISOLASI RNA

ALEXANDER FERNANDO
196070122011006
Dual Degree

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK KELAS DUAL DEGREE

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2020
 BAB 1
PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Ribonucleic acid atau yang disingkat sebagai RNA adalah molekul polimerik
yang tersusun atas rantai polinukleotida. RNA bersama memiliki peranan penting
dalam proses coding, decoding, regulasi dan ekspresi gen. Dalam central dogma
genetika molecular, RNA erat kaitannya dengan sebagai perantara antara kode-
kode informasi pada DNA dengan eksrpesi yang diwujudkan menjadi protein yang
fungsional. Meskipun banyak memiliki persamaan dengan DNA, RNA memiliki
perbedaan dengan DNA, antara lain yaitu: (1) bagian pentosa RNA adalah ribosa,
sedangkan bagian pentosa DNA adalah dioksiribosa. Gula ribose memiliki gugus
hidroksil (-OH) yang terikat pada cincin pentose di posisi 2’, hal ini mengakibatkan
RNA lebih labil secara kimiawi karena penurunan energi aktivasi untuk hidrolisis;
(2) RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi tidak
mengandung timin, sebagai gantinya RNA mengandung basa urasil; dan (3) Bentuk
molekul RNA adalah rantai tunggal sementara DNA berbentuk heliks ganda;
(Shukla, 2014).
Tabel 1. Perbedaan DNA dan RNA

RNA berdasarkan fungsinya dapat dibagi menjadi berberapa kelompok

termasuk diantaranya, mRNA, tRNA, rRNA, dan bentuk rna lainnya. Messenger
RNA atau mRNA berperan sebagai intermediate antara gen dan proses sintesis
protein. Transfer RNA atau tRNA berperan sebagai adaptor antara kodon di mRNA
dan molekul asam amino pada proses sintesis protein. Ribosomal RNA atau rRNA
bergabung dengan protein untuk membentuk protein, sebagai situs dari sintesis
protein. Selain itu, terdapat juga berberapa kelompok RNA lainnya meliputi small
nuclear RNA (snRNA), Small interfering RNA (siRNA), dan Micro RNA (MiRNA)
(Cooper dan Hausman, 2009).
Isolasi adalah prosedur yang digunakan untuk memisahkan suatu bagian dari
bagian lain dengan tujuan tertentu. Isolasi RNA digunakan untuk memisahkan RNA
dari zat lain sehingga dihasilkan RNA murni. Pentingnya isolasi RNA salah satunya
adalah sebagai parameter biokimia sel untuk mempelajari level transkriptomik
suatu organisme. Pada praktikum ini, digunakan prosedur isolasi RNA
menggunakan prosedur standar reagen TRIzol. Namun, proses isolasi RNA
terbilang sulit untuk dilakukan dikarenakan berberapa penyulit salah satunyar
RNAse. RNAse merupakan kelompok enzim yang mudah ditemukan dilingkungan
dengan fungsi memecah RNA. Hal ini menyebabkan, isolasi RNA harus dilakukan
secara hati-hati dan menggunakan teknik aseptik yang baik. Salah satu cara yang
dapat dilakukan untuk memastikan hal ini adalah dengan memberikan cairan
DEPC/Diethylpyrocarbonate pada alat dan bahan yang akan digunakan (Johnson,
2012).

1.2 TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi RNA dan mengetahui
konsentrasi/kemurnian RNA yang terdapat pada sampel.
 BAB 2
PROSEDUR PRAKTIKUM

2.1 BAHAN
1. TRIzol Reagent
2. Sampel Darah
3. Kloroform
4. Isopropanol
5. Ethanol 75%
6. Larutan SDS atau air bebas Rnase
7. DEPC/Diethylpyrocarbonate
8. Alkohol spray

2.2 ALAT
1. Vacutainer tutup ungu (EDTA/Ethylenediaminetetraacetic)
2. Tabung Eppendorf 1,5 ml steril
3. Mikropipet
4. Tip 200 µl dan 1 ml steril
5. Tabung Eppendorf 50 ml steril
6. LAF/Laminary Air Flow
7. Mesin sentrifugasi
8. NanoDrop Spechtrophotometers
9. Bunsen + spirtus
10. Timer
11. Handscoon
12. Masker

2.3 METODE
2.3.1 Persiapan sebelum bekerja dengan Laminar Air Flow
- Semua alat yang digunakan diberikan cairan DEPC untuk
menghilangkan RNase sebelum digunakan untuk isolasi RNA
 - Sebelum bekerja dengan LAF, gunakan handscoon dan masker lalu
semprotkan alkohol ke handscoon
- Nyalakan bunsen dan lewatkan bagian tutup dari sampel ataupun reagen
ke dekat api sebelum membuka dan menutup
2.3.2 Homogenisasi
- Mengambil sampel darah dari vena cubiti
- Sampel darah dimasukkan ke vacutainer berisi EDTA sebagai
antikoagulan
- 500 µl darah dari vacutainer dicampurkan dengan 500 µl Tri Reagent
dalam tabung Eppendorf 1,5 ml. Hindari mencuci sel sebelum
memasukan TRI reagent karena dapat mendegradasi mRNA.
2.3.3 Separasi
- Homogenasi sampel dengan 100 µl kloroform (dimasukan 100 µl
kloroform/ 500 µl Tri Reagent)
- Tutup tabung Eppendorf sampel dengan rapat dan campurkan sampel
secara cepat dan kuat selama kurang lebih 15 detik
- Biarkan sampel selama 10-15 menit dalam suhu ruang
- Sentrifugasi sampel 12.000 g selama 15 menit pada suhu 4oC. Sampel
akan terpisah menjadi 3 lapisan yaitu, organic phase atau phenol-
chloroform phase berwarna merah, interphase, dan aqueous phase yang
tidak berwarna

Gambar 1. Fase Cairan pada Tahapan Seperasi

- Pindahkan dengan hati-hati aqueous phase ke tabung 1,5 ml steril. Hati-
hati karena dapat mengkontaminasi kemurnian sampel
2.3.4 Presipitasi RNA
- Tambahkan 250 µl isopropanol (dimasukan 250 µl isopropanol/ 500 µl
Tri Reagent) ke tabung sampel
- Biarkan sampel di suhu ruang selama 5-10 menit
- Sentrifugasi dengan 12.000 g selama 8 menit pada suhu 4-25oC
- Sampel RNA atau presipitat akan terpisah menjadi bentuk pellet di sisi
bagian bawah tabung
2.3.5 Pencucian RNA
- Buang supernatan dan cuci pellet RNA dengan ethanol 75%
- Sentrifugasi dengan kecepatan 7.500 rpm selama 5 menit pada suhu 4-
25oC. Tambahkan minimal 500 µl etanol 75% per 1 ml Tri Reagent
yang digunakan pada proses homogenisasi awal
2.3.6 RNA Solubilization
- Buang etanol dan keringkan pellet RNA di ruangan (air-dry) selama 3-5
menit. Jangan mengeringkan pellet RNA secara total karena dapat
menurunkan solubilitas sampel serta jangan pula menggunakan
sentrifugasi
- Tambahkan larutan SDS atau air bebas RNAse untuk RNA solubilization
2.3.7 Pengukuran
- Dilakukan pengukuran kadar dan kemurnian RNA dari sampel dengan
NanoDrop Spectrophotometers
 BAB 3
HASIL

Isolat RNA yang diperoleh berbentuk kristal padat berwarna putih yang
terletak di dasar dari tabung Eppendorf. Isolat kemudian dilarutakan kembali
menggunakan air yang bebas RNAse untuk perlakuan selanjutnya. Adapun
Spektrofotometer NanoDrop digunakan untuk mengetahui konsentrasi/kemurnian
RNA yang terdapat pada sampel. Hasil dari Spektrofotometer NanoDrop
ditunjukan pada Tabel 2.

Tabel 2. Hasil Konsentrasi/ kemurnian RNA menggunakan

Spektrofotomenter NanoDrop
Sampel 1 Sampel 2

Konsentrasi 1579,1 ng/ µl 2322,7 ng/ µl

A230 2,374 A 3,505 A

A260 2,016 A 3,024 A

A280 1,182 A 2,121 A

A320 0,042 A 0,121 A

A260/A230 0,846 0,858

A260/A280 1,732 1,451

 BAB 4
PEMBAHASAN

Proses isolasi RNA pada praktikum ini menggunakan TRIzol reagent. Reagen
ini menggunakan prinsip ekstraksi Acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform
(AGPC). AGPC merupakan Teknik esktraksi yang banyak digunakan pada biologi
molekuler. Teknik ini memerlukan waktu yang lebih lama dibandingkan column-
based system namun memiliki keunggulan dalam puritas dan kuantitas RNA yang
tinggi. Tahapan pertama dalam proses isolasi RNA adalah Homogenisasi.
Homogenesasi dilakukan untuk mencapurkan sampel darah dengan TRI reagent
yang tersusun atas guanidium thiocyanate dan acidic phenol. Guanidium
thiocyanate, yang berada pada TRI reagent, digunakan untuk membantu proses
denaturasi protein (salah satunya RNAse). Setelah itu, ditambahkan chloroform
pada sampel dan dilakukan sentrifugasi. Penambahan chloroform membantu
sepeasi fase organic dan aqueous. Sampel kemudian akan terbagi menjadi 3 lapisan
yaitu:
1. Organic Phase: lapisan paling bawah berwarna merah. Pada lapisan ini,
terdapat komponen protein dan lipid
2. Interphase: Lapisan tengah yang berada di antara organic phase dan
aqueous phase. Pada lapisan ini umunya mengandung DNA dan debris
seluler
3. Aqueous phase: Lapisan paling atas yang tidak berwarna. Pada lapisan ini
dapat ditemukan RNA
Untuk Purifikasi RNA, pH pada tahapan ini dipertahankan dalam suasana
asam (sekitar pH 4-6). Hal ini dilakukan agar DNA tidak ikut terlarut pada fase
aqueous dan berada pada interphase atau bahkan fase organic(Umumnya DNA
terlarut pada pH 7-8).
Setelah itu, fase aqueous yang telah dipindahkan pada tabung baru
ditambahkan isopropanolol untuk proses presipitasi RNA. Prinsipnya adalah
purifikasi RNA dengan isopropanolol sebagai anti-solvent. RNA merupakan
molekul polar disebabkan backbone fosfatnya yang bermuatan. Bila berikatan
dengan ion positif (misalnya Na+, NH4+, dan Li+), molekul RNA dapat membentuk
garam dan terpresipitasi menjadi bentuk padat. Namun, pelarut air (aqueous phase)
mencegah molekul RNA untuk berinteraksi dengan molekul muatan positif.
Sehingga, isopropanolol yang kurang polar dibandingkan air digunakan sebagai
anti-solvent yang mengakibatkan distrupsi pada interaksi air-RNA. Hal ini
mengakibatkan RNA dapat membentuk ikatan ionik yang stabil dengan ion muatan
positif dan terpresipitasi menjadi bentuk kristal padat. Proses pencucian dilakukan
untuk semakin meningkatkan kemurnian RNA pada sampel (Russel dan Sambrok,
2001).

Gambar 2. Gambaran sampel setelah dilakukan proses separasi dan

presipitasi (Shahidalien, 2019)

Spektrofotometer NanoDrop digunakan untuk mengetahui kemurnian RNA

yang telah diisolasi. Spektrofotometer ini dapat mendeteksi absorbansi sampel
dengan jumlah yang sedikit (kuran lebih 2µl). Asam nukleat (RNA dan DNA)
memiliki absorbansi maksimal pada 260 nm. Sementara itu, protein dan senyawa
fenolik umumnya memiliki absorbansi maksimal pada 280 nm dan pelarut organik
pada 230 nm. Rasio 260/280 digunakan untuk mengetahui keberadaan dari protein
dan komponen fenolik pada sampel. Rasio mendekati 1,8 dianggap sebagai DNA
murni sedangkan rasio mendekati 2,0 dianggap sebagai RNA murni. Sementra itu,
rasio 260/230 digunakan untuk mengetahui keberadaan dari komponen pelarut
organik yang tidak diinginkan seperti phenol, guanidine HCl, dan guanidin
thiocyanate. Rasio yang masih dapat diterima adalah 2,0-2,2 sehingga apabila
angka yang didapatkan dari sampel lebih tinggi atau rendah maka mungkin terjadi
kontaminasi sampel (DeNovix, 2014).
 Pada percobaan yang dilakukan konsentrasi sampel yang diperoleh untuk
sampel 1 dan sampel 2 berturut-turut adalah 1579,1 ng/µl dan 2322,7 ng/µl. Namun,
didapatkan bahwa rasio 260/280 dari sampel 1 adalah 1,732 sedangkan sampel 2
adalah 1,451. Kedua hasil ini menunjukan bahwa kedua sampel bukanlah RNA
murni karena rasio untuk dapat dikatakan sebagai sampel RNA murni harus
mendekati 2,0. Selain itu, rasio 260/230 pada sampel 1 dan 2 berturut-turut adalah
1,732 dan 1,451. Kedua hasil ini menunjukan adanya kontaminasi dengan nilai
yang lebih rendah dari 2,0-2,2.
Chomczynski dan Sacchi (2006) menjelaskan kemungkinan kesalahan
mengapa terjadinya rasio 260/280 yang rendah. Beberepa kemungkinan yang
terjadi diantaranya:
1. Sampel RNA kemungkinan didilusi pada air dengan pH suboptimal.
Kekuatan ionic yang lemah akan meningkatkan absorbansi pada Panjang
gelombang 280 nm
2. Homogenisasi atau lisis inkomplit pada sampel
3. Fase aqueous terkontaminasi dengan fase organic
4. Pelet RNA kurang terlarut sempurna
Berdasarkan pengamatan dalam praktikum, kemungkinan kesalahan paling
besar yang terjadi adalah terkontaminasinya fase aqueous dengan fase organic. Hal
ini berkaitan dengan error yang dilakukan oleh operator pemula. Namun, untuk
permasalahan ini dapat dicegah dengan secara hati-hati memindahkan fase aqueous
tanpa menyentu interphase dan fase organic. Jika sampel yang didapatkan adalah
RNA murni, terdapat beberapa kemungkinan metode yang dapat digunakan untuk
analisis RNA. Beberapa diantaranya adalah, Northern Blotting, RNase Protection
Assay, DD-PCR, RT-PCR, atau metode-metode lainnya (Moustafa dan Cross,
2015)
 DAFTAR PUSTAKA

Chomczynski, P. and Sacchi, N., 2006. The single-step method of RNA isolation
by acid guanidinium thiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-
something years on. Nature protocols, 1(2), pp.581-585.

Cooper, G.M. and Hausman, R.E., 2009. Protein synthesis, processing, and
regulation. The Cell. A Molecular Approach. ASM Press, Washington DC,
pp.309-352.

DeNovix. 2014. Purity Ratios. Technical Note 130.

Johnson, Mary. RNA Extraction. Mater Methods, 2012, 2:201.

Moustafa, K. and Cross, J.M., 2016. Genetic approaches to study plant responses
to environmental stresses: an overview. Biology, 5(2), p.20.

Russell, D.W. and Sambrook, J., 2001. Molecular cloning: a laboratory

manual (Vol. 1, p. 112). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory.

Shahidalien. 2019. Isolation of RNA from Blood Principle Protocol and Functions
of Reagents, (Online), https://howbiotech.com/isolation-of-rna-from-blood-
principle-protocol-and-functions-of-reagents/, diakses pada 16 Februari
2019.

Shukla R.N., 2014. Analysis of Chromosome. Agrotech Press.

 LAMPIRAN

Homogensisasi Sampel TRI reagent

Pengambilan Fase Aqueous pada Analisis menggunakan

Sampel Spektofotometer NanoDrop

Hasil Spektrofotometer NanoDrop Hasil Spektrofotometer Nanodrop

Sampel 1 Sampel 2