Isolasi dan Penyimpanan Kultur

Mikroba
 Culturing microbes
The Five “I’s
1. Innoculation: Producing a pure culture
2. Isolation: Colony on media, one kind of microbe, pure
culture
3. Incubation: growing microbes under proper
conditions
4. Inspection: Observation of characteristics (data)
5. Identification: use of data, correalation, to ID
organism to exact species
 Innoculation
Innoculation: Producing a pure culture
Introduce bacteria into a growth medium using “aseptic technique” to prevent
contamination. Tools: Bunsen burner, loop. Needle, etc.
Innoculation
 Isolation
Isolation: Colony on media, one kind of microbe,
pure culture: isolation on general and special
“differential media”

General growth media: NA (Nutrient Agar), TSA

(Trypticase Soy Agar)

Differential: Mac, EMB (Eosin Metilen Blue), SS (Starch

Salts)
These have dyes, salts, inhibiting
agents : see differences on plates
Isolation
 Isolation
Streak Plates
 Isolation
Differential medium: Mac, EMB, SS
These have dyes, salts, inhibiting
agents : see differences on plates
 Incubation
• Incubation: Allow organisms to grow under the optimal
conditions
• Temperature, with or without oxygen etc
 Inspection
• Inspection: Observation, description
• Colony Morphology, Microscopic examination (grams stain)
• Systematic recording of “DATA”
Isolasi mikroba
Prinsip dasar
Memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang
berasal dari campuran bermacam-macam mikroba
Kriteria dalam pemilihan mikroorganism
 Karakteristik nutrisi mikroba
 Temperatur optimum mikroba
 Produktivitas microba

Prosedur isolasi tergantung pada:

-Jenis mikroba yang akan diisolasi
- Biaya yang tersedia
- Waktu
Metode isolasi mikroba

Serial dilution, streak plate method, pour

plate/spread plate method, selective media, and
differential media
Isolasi mikroba
Isolasi mikroba
Preservation dan storage
Prinsip dasar

 Tujuannya untuk menjaga • Secara umum

strain mikroba pada media
tanpa adanya perubahan
pada morfologi, fisiologi
dan genomnya.
mikroorganisme
dapat tumbuh dengan
baik pada medium
yang dibuat mirip
dengan habitat aslinya
Macam
 On solid or liquid media
 Under mineral oil
 Under sterile water Penyimpanan jangka pendek
 Preservation in silica gel
 Preservation in soil

 Freeze drying
Penyimpanan jangka
 Cryopreservation
panjang
Peremajaan berkala

 Disimpan di lemari es sehingga • Dapat terjadi perubahan

mengurangi frekuensi sub
kultur
 Mudah dan murah untuk
dilakukan
 Ideal untuk skala kecil
genetik
• Peluang terjadi kontaminasi
• Terjadi kekeliruan pemberian
label

Peremajaan dengan cara memindahkan atau memperbarui biakan

mikroba dari biakan lama ke medium tumbuh yang baru secara
berkala, misalnya sebulan atau dua bulan sekali.
 under mineral oil
penyimpanan dalam minyak mineral
Kultur pada agar miring kemudian ditambahkan mineral
oil

Untuk menghindari dehidrasi dan memprlambat aktifitas

metabolisme dan pertumbuhan

Kekurangan : • Dapat terjadi mutasi jika minyak

yang digunakan tidak tepat
• Dapat terjadi kontaminasi dari
spora mikroba pada air maupun
udara
Protokol.…

 Penyiapan medium agar miring

 Penyediaan minyak mineral atau parafin cair steril
 Menumbuhkan mikroba yang akan disimpan dalam tabung
agar miring selama 24-48 jam dan memeriksa kemurnian
biakan untuk menghindari kontaminasi
 Setelah mikroba tumbuh baik, parafin cair steril dimasukkan
ke dalam botol secukupnya, sehingga permukaan parafin atas
berada 10-20 mm di atas permukaan medium agar
 disimpan pada suhu ruang atau di kulkas
Under steril water
penyimpanan dalam aquades steril
Tidak semua jenis bakteri dapat disimpan
menggunakan teknk ini

Bakteri berbentuk batang dan Pseudomonas dapat disimpan

cukup lama dalam akuades steril pada suhu ruang atau
suhu 10-15oC
Protokol…

 Akuades steril disiapkan dalam botol

 Mmindahkan bakteri dari kultur agar miring menggunakan
jarum ose
 Botol ditutup rapat dan disimpan di suhu ruang atau suhu
10-15oC
 Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan stok isolat dilakukan
secara rutin
Preservation in silica gel
Protokol
 Gel silika sebanyak 3-4 g dimasukkan ke dalam botol tutup berdrat ukuran
25 ml
 Di atas gel silika dilapisi kapas atau slag wool setebal 1 cm
 Di atas lapisan kapas diletakkan 20-50 manik-manik porselin
 Botol dibuka tutupnya dan disterilkan dengan oven kering suhu 160oC selama
1-2 jam
 Mikroba yang akan disimpan berumur sekitar 24-48 jam dalam kultur cair
 Manik-manik porselin dituangkan ke dalam tabung reaksi yang berisi biakan
mikroba
 Manik-manik yang basah oleh suspensi bakteri dikembalikan ke dalam botol
dan ditutup rapat dan disimpan di suhu ruang atau di suhu pendingin
Preservation in soil
penyimpanan dalam tanah steril
• terutama berguna • Murah
untuk fungi,
Streptomyces spp., dan • Disimpan pada suhu
bakteri yang ruang
membentuk spora • Stabilitas genetik
seperti Bacillus spp. mikroba dapat
dan Clostridium Spp
dan Rhizobium spp dipertahankan
Freeze drying (Lyophilization)

 Tujuan dari metode ini adalah untuk mengurangi aktifitas metabolik sel
dan menjaga sel dalam keadaan dorman namun tetap hidup
 Disimpan pada suhu -20oC
 Metode dehidrasi vakum dengan sublimasi es pada tekanan
rendah
 Kandungan air sisa harus sekitar 2% untuk menjaga viabilitas sel
 Sesuai untuk bakteri, jamur berspora, dan ragi, tetapi tidak sesuai
untuk mikroalga eukariot
 Awal fase stasioner
 Mahal
Cryopreservation

 Penurunan temperatur pada suhu - 130oC-196oC

 Faktor penting dalam “cryopreservation”:
penentuan kondisi pertumbuhan optimum pada saat penghilangan air
selama pendinginan,
“cryoprotectant yang digunakan, umumnya gliserol atau dimetilsulfoksida
 Liquid nutrogen
 Dapat bertahan dalam waktu yang sangat lama
 Mahal
Protokol.….

 Siapkan spora atau suspensi sel dalam 10% (v/v) gliserol

 Pipet 0,5 mL suspensi sel ke dalam 2 mL “cryotubes”
steril
 Dinginkan pada freezer dengan laju yang terkontrol
sampai –50oC. Laju pendinginan umumnya -10oC/min
 Pindahkan ke dalam freezer penyimpanan nitrogen cair
Perbandingan beberapa teknik preservasi
Biaya Stabilitas

Metode Material Tenaga Ketahanan genetik

Transfer periodik rendah tinggi ± 6 bulan buruk

Minyak rendah sedang 2-20 th buruk

Air steril rendah sedang 2-5 th sedang

Tanah steril rendah sedang 5-7 th sedang

Silika gel rendah sedang 5-7 th baik

“Freeze-drying” tinggi tinggi 4-40 th baik

(awal)

Kriogenik tinggi rendah infinite baik