METOODE . KROMATOGRAFI UNTUK ANALISIS — MAKANAN | Abdul Rohman, M.Si., Apt » Ibnu Gholib Gandjar, DEA, Afi 000285Metode Kromatografi Untuk Analisis Makanan Penulis: Abdul Rohman, M.Si., Apt Prof. Dr. Ibnu Gholib Gandjar, DEA., Apt Rancang Sampul: Digi Art Yogya _ Tata Aksara: Dimaswids Cetakan I: November 2007 Penerbit PUSTAKA PELAJAR Celaban Timur UH 11/548 Yogyakarta Telp. 62274381542, Faks. 62274383083 E-mail: pustakapelajar @telkom.net BN: 978-979-1277-93-8__ EE Ee TEORI DAN PRAKTEK KROMATOGRAFI A. KROMATOGRAFI GAS Kromatografi merupakan teknik pemisahan dengan menggunakan fase diam dan fase gerak. Kromatografi dapat digunakan untuk tujuan analisis kualitatif dan analisis kuantitatif, serta dapat digunakan untuk tujuan preparatif. Kromatografi gas (KG) merupakan salah satu jenis kromatografi yang menggunakan gas sebagai fase gerak- nya. Sementara itu, fase diamnya dapat berupa zat padat (dikenal dengan kromatografi gas-padat, KGP) atau berupa zat cair yang diikatkan pada pendukung padat (dikenal dengan kromatografi gas-cair, KGC). Syarat suatu senyawa dapat dianalisis dengan KG adalah senyawa tersebut harus bersifat mudah menguap (volatil). Oleh karena itu, senyawa-senyawa yang bersifat tidak mudah menguap (non volatil) harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang mudah menguap dengan cara derivatisasi. Sebagai contoh, asam lemak bebas kurang Metode Kromatografi Untuk Analisis Makanan 1nanya supaya dapat dianalisis i il; kare ee seat k harus diderivatisasi deng asam lema Moat menjadi bentuk esternya. ™ Peralatan kromatografi gas yang umum terdiri atas: as pembawa; ruang suntik sampel; kolom yang diletakkan ce oven yang dikontrol secara termostatik; sistem deteksi dan pencatat (detektor dan recorder); serta kom. puter yang dilengkapi dengan perangkat pengolah date Skema peralatan kromatografi gas dapat dilihat pada gambar 1.1. alat penyuntik sistem pengontrol aliran gas | sampel detektor amplifier |twbans suntik = : | ee aa fu aliran pemecah (pemanas kolom) Gambar 1.1. Skema pe (sumber: Keali eralatan kromatografi gas. ley and haines, 2003) Gas pembawa biasan: mempunyai kapasitas a diabaikan) seperti heli: ya berupa gas permanen yang dsorpsi yang sangat rendah (dapat Sistem kromatografi gas. wa tergantung pada penggunaanspesifik dan jenis pembawa dapat memp uhi dalam KGC dan dapat memodifikasi s¢ Penggunaan hidrogen sebagai gas pembawa dih karena bersifat mudah terbakar dan peraturan penggu- naannya yang sangat ketat. Helium merupakan tipe gas pembawa yang sering digunakan (merupakan pilihan utama) karena memberikan efisiensi kromatografi yang lebih baik (mengurangi pelebaran pita), akan tetapi harganya mahal. Nitrogen merupakan gas yang paling sering digunakan, karena selain harganya murah juga mampu memberikan pemisahan analit dengan baik. Stabilitas dan reprodusibilitas kecepatan alir gas pembawa merupakan syarat yang harus dipenuhi untuk tercapainya pemisahan dengan kromatografi gas. Beberapa jenis injektor telah dikembangkan untuk tujuan menghantarkan sampel yang telah teruapkan menuju kolom KG dengan pelebaran pita awal yang sesempit mungkin. Tempat masuk (inlet) sampel yang sering dirujuk dengan injektor atau lubang injeksi dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok utama, yaitu injektor penguapan (vaporization injector) dan injektor pada kolom (on column injector). Injektor penguapan menggunakan suhu yang tinggi untuk menguapkan sampel-sampel cair dengan ccpat. Biasanya digunakan semprit (syringe) untuk menghantar- kan sampel ke dalam lubang injeksi yang telah dipanaskan. Dalam kasus ini, sampel akan menguap secara cepat, lalu | bercampur dengan gas pembawa, dan sampel akan _ dipindahkan ke dalam kolom. Beberapa bagian sampel yang tidak mudah menguap 3 Metode KromatografiUmtuk Analisis Makananakan tertinggal di injektor atau di muka kolom schin ’ residu-residu sampel yang sulit menguap ini akan men ee tori alat KG, karenanya dibutuhkan pencucian “ae membersihkannya. Pada injektor dalam kolom (on column injector), sampel dimasukkan secara langsung ke dalam kolom. Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap. Jika menggunakan injcktor penguapan, maka dikhawatirkan akan terjadi peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi (pirolisis). Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisah- an karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen yang sangat penting pada KG. Ada 2 jenis kolom pada KG, yaitu kolom kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column). Kolom kromatografi gas dapat dipanasi dengan suhu tetap (jenis pemisahan isotermal) dan dengan suhu yang berubah-ubah (dengan suhu terprogram). Pemisahan de- ngan kolom yang dipanaskan pada suhu terprogram mempunyai keuntungan, yakni mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran yang mempunyai titik didih pada kisaran yang luas dan juga mampu mempercepat keseluruhan waktu analisis, karena senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi akan terelusi lebih cepat. Suhu kolom merupakan salah satu parameter yang menentukan dalam analisis dengan KG, sehingga pengaturannya secara cermat merupakan pertimbangan yang utama. Fase diam cair pada kolom KG harus memenuhi be- berapa persyarata tara lain: mempunyai tekanan ce stabilitas kimia yang tings’be viskositasnya relatif renda terhadap komponen-komponen dalam sar dipisahkan; dan mempunyai kapasitas pembasaham y bagus, baik pada permukaan pendukung yang lemban (inert) atau pada dinding kolom yang bersifat lembam. Panjang kolom kemas dibatasi sampai 3 meter karena tingginya tekanan uap yang dibutuhkan untuk menjaga kecepatan alir gas pembawa. Pendukung padat yang di- basahi dengan fase diam cair dicirikan dengan kapasitas adsorpsi yang rendah dan dengan luas permukaan yang luas. Pendukung yang lembam akan meningkatkan simetrisitas puncak dan tidak menganggu partisi analit antara gas pembawa dengan fase diam. Efisiensi kolom yang tinggi akan diperoleh jika meng- gunakan pendukung berdiameter sempit. Diameter pendukung padat yang umum adalah antara 80-120 mesh (125-177 um). Banyaknya fase diam yang dilapiskan pada fase diam pada umumnya antara 1%-10 %, dan yang pal- ing tinggi dijumpai adalah 30%. Karena kapasitas pemisahannya yang tinggi, kolom kapiler (disebut juga dengan kolom tabung terbuka atau open tubular column) sering digunakan untuk analisis bahan makanan. Permukaan dalam kolom kapiler dilapisi dengan lapisan tipis fase diam. Kebanyakan fase diam diikatkan secara silang atau secara kovalen pada permukaan silika lebur. Banyaknya fase diam pada kolom ditandai dengan ketebalan lapisan yang besarnya antara 0,1-5 um. Retensi solut dalam kolom sebanding dengan ketebalan lapisan fase diam. Semakin tebal lapisan fase diam, semakin lama Solut tertahan dalam kolom; begitu juga sebaliknya. Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat Metode Kromatoarati 11... abersifat non polar, polar, atau ea oo — a i | polar yang paling banyak Eee anvadalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-5) dan fenil 5%. metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SES2; CPSIL-8), Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50%-metilpolisiloksan 50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19); sementara itu, fase diam yang polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB- WAX; CP-WAX; Carbowax-20M). Jenis fase diam akan menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam campuran. Seorang analis harus memilih fase diam yang mampu memisahkan komponen-komponen dalam sampel. Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom, tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang akan berinteraksi dengan molekul-molekul solut yang keluar dari kolom. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fase diam dan fase gerak. Pada garis besarnya, detcktor KG termasuk detektor diferensial, yakni respon yang kcluar dari detektor mem- oukan hubungan yang linier dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang terpisah. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik komponen-komponen oleh KG disajikan oleh detektor sebagai deretan luas pun- cak terhadap waktu. Kromatogram pada waktu tambat ee retensi) tertentu dapat dimanfaatkan untuk analisis kualitatif, sementara itu luas Puncak dapat digunakansebagai data kan dengan senyawa baku. ] dengan instrumen yang kompleks, misalnya GC MS, maka kromatogram akan disajikan dalam bentuk lain. Dari sejak dipakainya KG sebagai salah satu teknik analisis fisika-kimia, para ilmuwan telah berhasil meng- operasikan berbagai macam detektor KG antara lain: detektor hantar panas (Thermal Conductivity Detector = TCD); detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector = FID); detektor tangkap elcktron (Electron Capture Detector = ECD); detektor nitrogen-fosfor (Nitrogen Phosphorus Detector = NPD); detcktor fotometri nyala (Flame Photo- metric Detector = FP1D); detektor hantar elektrolitik (Elec- trolytic Conductivity Detector = E1LCD); detektor fotoionisasi (Photoinization Detector = PID); detektor selektif massa (Mass Selective Detector = MSD); detektor infra merah (In- frared Detector = IRD); detektor emisi atom (Atomic Emis- sion Detector = AED); detektor ionisasi helium (Helium Ion- ization Detector = HID); detektor kemi-luminesensi redoks (Redox Chemiluminescence Detector = RCD); dan detektor ionisasi termoionik (Thermoionic Ionization Detector (TID). Dasar Kromatografi Gas Distribusi solut antara fase gerak dan fase diam ditentukan oleh konstanta distribusi K,,; yang didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solut dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm). cnet (1-1) Jadi, semakin besar nilai K, maka migrasi solut semakin lambat; dan semakin kecil nilai K,, migrasi solut semakin Be Metode Kromatografi Untuk Analisis Makanan &cepat, Solut akan terelusi menurut perbandingan distri businya. Jika perbedaan perbandingan distribusi solyt cukup besar, maka campuran-campuran solut akan mudah dan cepat dipisahkan. Hubungan antara retensi, suhu kolom, dan sifat-sifat solut digambarkan oleh: In K, = -AG/RT K,, = konstanta distribusi; AG® = perubahan energi bebas Gibbs untuk penguapan senyawa dari fase diam; T = suhu kolom (derajad kelvin); dan R = konstanta gas ideal. Persamaan (1-2) menunjukkan bahwa perbedaan- perbedaan energi bebas Gibbs menghasilkan perbedaan distribusi solut. Lamanya waktu yang diperlukan suatu solut keluar dari kolom disebut dengan waktu retensi (t,). Rasio partisi, yang juga disebut dengan faktor kapasitas (k’) merupakan banyaknya waktu yang diperlukan oleh solut keluar dari kolom, relatif terhadap fase gerak. (1-2) (1-3) t, = waktu retensi solut ‘\, = waktu retensi fase gerak dank’ = faktor kapasitas. : Faktor pemisahan atau selektifitas (a) untuk pemisah- an 2 komponen senyawa A dan senyawa B dirumuskan dengan: a=42 atau otete (1-4) i as k’ * rasio partisi puncak yang terelusi lebih awaltre Resolusi didefinisikan sebagai perbed waktu retensi 2 puncak yang saling berdekatan (At, ta) dibagi dengan rata-rata lebar puncak (W, + W, sebagaimana dalam gambar 1.2. )/2 2At, Rs =(w,+V +W,) stvaaseestaceqeonresssester |” AlgO) Dari persamaan (1-5), dapat diketahui bahwa yang sangat berpengaruh terhadap pemisahan suatu komponen adalah: waktu retensi masing-masing solut (tz, dan t,,) serta lebar puncak masing-masing komponen yang dipisahkan (W, dan W,). Nilai Rs harus mendekati atau lebih besar dari 1,5 karena pada nilai Rs ini akan memberikan pemisahan puncak yang baik (base line resolution). tan tne /-—are: i M i Vy \ >a i iy \ Gambar 1.2. Pengukuran resolusi 2 p Puncak yang berdeckat: (Sumber: Kealy and Haines, 2002) a lempeng teoretis (theoritical plate number, N) in kapasitas pemisahan kolom kromatografi. tode Kromatografi Untuk Analisis Makanan 9Tidak ada lempeng-lempeng dalam kolom kroma; meskipun demikian konsep ini meminjam teori yang telah sukses digunakan untuk mencirikan kinerja kolom. N dirumuskan dengan: t, : waktu retensi solut 6, : simpangan baku lebar puncak Dalam prakteknya, lebih mudah untuk mengukur baik lebar puncak (W,) ataupun lebar setengah puncak (W,,.); dan 2 persamaan berikut (persamaan 1-7 dan 1-8) diturunkan dari persamaan (1-6) di atas: t te > N=16G) (1-7) 5,54(2_)? IN FAT) eessneeteceetueen (1-8) Aspek-aspek teoritis dan Penggunaan praktis kromatografi gas dapat dilihat di teferensi-referensi yang berkaitan dengan kromatografi. B. KROMATOGRAFI CAIR Kromatografi cair metode kromatografi yang mana f. eee adalah cairan dan fase diamnya berupa ‘an organik atau anorganik. Sesuai dengan ben