IMUNOSEROLOGI

TEKNIK DETEKSI ANTIGEN-ANTIBODI DENGAN PRINSIP

AGLUTINASI

A. PENGERTIAN ANTIGEN ANTIBODI

Antigen merupakan substansi yang dapat menginduksi respon imun.
Substansi tersebut dapat berupa lipopolisakarida (LPS) yang dimiliki oleh
bakteri Gram negatif, lipoteichoic acid (LTA) yang dimiliki oleh bakteri
Gram positif, flagella, DNA, toksin, dan lain-lain (Madigan et al, 2009).
Bagian antigen yang dapat berinteraksi dengan antibodi disebut epitop atau
antigen determinant. Berikut bahan yang dapat dianalisis sebagai antigen
dalam immunoassay (Murphy, 2012):
• Mikroba patogen dan toksin mikroba
• Toksin tanaman dan hewan
• Protein spesifik atau senyawa lain yang berstruktur spesifik
• Senyawa obat (narkotik, psikotropik)
• Senyawa pestisida
Antibodi atau imunoglobulin adalah protein terlarut yang diproduksi oleh sel
B sebagai respon terhadap antigen (Madigan et al, 2009). Setiap antibodi
dapat terikat secara spesifik pada antigen tunggal. Di dalam tubuh antibodi
memiliki tiga fungsi, yaitu netralisasi, opsonisasi, dan aktivasi komplemen
(Murphy, 2012). Antibodi dapat melakukan netralisasi dengan cara
mengenali antigen pada patogen secara spesifik sehingga mencegah patogen
berikatan atau menempel pada sel inang. Antibodi juga dapat menyelimuti
tubuh patogen dengan cara mengenali antigen yang berada di permukaan
patogen secara spesifik sehingga mempermudah proses fagositosis. Peristiwa
tersebut dikenal dengan sebutan opsonisasi. Selain itu, antibodi dapat
mengaktivasi kumpulan protein yang disebut dengan komplemen.
Komplemen tersebut dapat meningkatkan proses inflamasi, opsonisasi, dan
pelisisan sel.

1
Berdasarkan perbedaan lokasi dan fungsinya imunoglobulin dibagi menjadi 5
kelas, yaitu IgA, IgD, IgE, IgG, dan IgM (Gambar 1.2). Dari kelima jenis
tersebut, IgG dan IgM merupakan antibodi yang paling banyak ditemukan.
IgM merupakan antibodi yang diproduksi tubuh sebagai respon awal (primer)
terhadap kehadiran antigen sedangkan IgG merupakan antibodi yang
diproduksi tubuh sebagai respon sekunder. Jika dibandingkan dengan IgM,
IgG memiliki kekuatan pengikatan atau afinitas yang lebih kuat terhadap
antigen (Madigan et al, 2009).

2
 IgG terdiri dari empat polipeptida, yaitu dua rantai berat (heavy chain) dan
dua rantai ringan (light chain) (Gambar 1.3). Heavy chain merupakan protein
yang memiliki ukuran sekitar 65 kDa sedangkan light chain memiliki ukuran
sekitar 25 kDa (Murphy, 2012). Berdasarkan variasi dan fungsinya IgG
terdiri dari dua bagian, yaitu variable region (Fab) dan constant region (Fc)
(Murphy, 2012). Fab merupakan daerah yang bersifat variatif (berbeda-beda
pada setiap antibodi) dan berfungsi untuk mengenali antigen (tepatnya pada
bagian epitop) secara spesifik sedangkan Fc merupakan daerah yang bersifat
konstan (sama pada setiap antibodi) dan dapat dikenali oleh fagosit.

B. INTERAKSI ANTIGEN-ANTIBODI
Semua metode immunoassay berdasarkan pada reaksi spesifik dan sensitif
antara antigen dan antibodi. Pengikatan antara antibodi dan antigen
tergantung pada interaksi non kovalen yang bersifat reversible (Darwish,
2006). Terdapat lima jenis interaksi yang terlibat pada pengikatan antigen
dan antibodi, yaitu ikatan hidrogen, gaya elektrostatik, Van der Waals, dan
ikatan hidrofobik (Koivunen and Krogsrud, 2006). Perubahan kecil pada
struktur antigen dapat mempengaruhi kekuatan interaksi antibodi dengan
antigen. Terdapat tiga faktor yang mempengaruhi interaksi antigen dengan
antibodi, yaitu afinitas, aviditas, dan reaksi silang (cross reactivity)
(Koivunen and Krogsrud, 2006). Afinitas merupakan pengukuran kekuatan
ikatan antara antigen dan antibodi. Avidity ditentukan oleh afinitas antibodi

3
 terhadap epitop, jumlah sisi pengikatan per molekul antibodi, dan pengaturan
geometrik komponen yang berinteraksi. Reaksi silang merupakan interaksi
pengikatan yang terjadi antara antibodi dengan epitop yang sama pada
molekul yang berbeda (Gambar 1.4)

C. JENIS IMUNOASSAY
Berdasarkan jenis reaksi yang terjadi immunoassay terbagi menjadi dua,
yaitu reaksi primer dan sekunder.
1. Reaksi Primer
 Radioimmunoassay (RIA)
Pengujian antibodi atau antigen yang memanfaatkan pengikatan
secara langsung. RIA menggunakan label berupa senyawa radioaktif,
biasanya 125I. Pada RIA, antigen dalam sampel akan terikat pada
permukaan microplate dan akan dikenali oleh antibodi berlabel
(Darwish, 2006). Immunoassay jenis ini sudah jarang digunakan
karena berbahaya.
 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Mendeteksi keberadaan antigen atau antibodi yang terimobilisasi
dalam sumur menggunakan antigen atau antibodi spesifik yang
terkonjugasi dengan enzim (Darwish, 2006). Pengikatan antigen
dengan antibodi dideteksi melalui perubahan warna substrat menjadi
produk. ELISA terbagi menjadi empat jenis, yaitu langsung (direct),
tidak langsung (indirect), kompetitif, dan sandwich. Hasil ELISA
dapat dideteksi menggunakan spektrofotometer

4
  Immunofluorescence Assays (IFA)
Pada IFA, antibodi spesifik yang digunakan harus dikonjugasikan
dengan pewarna fluorescent (Koivunen and Krogsrud, 2006). IFA
dapat divisualisasi menggunakan mikroskop fluorescent, fluorometer,
fluorescence scanner, atau flow cytometer.
2. Reaksi Sekunder
 Aglutinasi Reaksi aglutinasi dapat terjadi antara antigen yang terlarut
(soluble) dengan antibodi yang tidak terlarut (insoluble) atau
sebaliknya. Antigen atau antibodi dapat dibuat menjadi tidak terlarut
dengan cara mengikatkannya pada permukaan carier seperti partikel
latex (Koivunen and Krogsrud, 2006). Penggumpalan terjadi jika
molekul antigen memiliki berbagai macam epitop yang menyebabkan
ikatan silang (Gambar 1.6).

 Presipitasi
Reaksi presipitasi dapat terjadi antara antigen yang terlarut dengan
antibodi yang terlarut juga (Gambar 1.7). Ketika sejumlah antibodi
terlarut dicampurkan dengan antigen terlarut maka akan terjadi
interaksi antibodiantigen yang menyebabkan pengendapan
(Koivunen and Krogsrud, 2006). Reaksi presipitat dipengaruhi oleh
jumlah epitop yang dimiliki antigen dan jumlah antibodi yang dapat
terikat pada antigen tersebut.

5
  Fiksasi Komplemen
Keberadaan antibodi spesifik pada serum pasien dideteksi
menggunakan antigen, komplemen, dan sel darah merah (Koivunen
and Krogsrud, 2006). Jika di dalam serum terdapat antibodi maka
akan terjadi reaksi pengikatan antara antibodi dengan antigen dalam
reagen secara spesifik. Penambahan komplemen yang terikat pada
kompleks antigen-antibodi akan membentuk sistem yang
memungkinkan sel darah merah menjadi pellet (Murphy, 2012). Jika
kompleks antigen-antibodi tidak terbentuk maka penambahan
komplemen akan melisiskan sel darah merah. Jenis immunoassay ini
jarang digunakan.

D. CONTOH UJI AGLUTINASI

1. Uji Widal
Uji Widal adalah prosedur uji serologi untuk mendeteksi bakteri
Salmonella enterica yang mengakibatkan penyakit Thipoid. Uji ini akan
memperlihatkan reaksi antibodi Salmonella terhadap antigen O-somatik
dan H-flagellar di dalam darah. Prinsip pemeriksaan adalah reaksi
aglutinasi yang terjadi bila serum penderita dicampur dengan suspense
antigen Salmonella typhosa. Pemeriksaan yang positif ialah bila terjadi
reaksi aglutinasi antara antigen dan antibodi (agglutinin). Antigen yang
digunakan pada tes widal ini berasal dari suspense salmonella yang sudah
dimatikan dan diolah dalam laboratorium. Dengan jalan mengencerkan
serum, maka kadar anti dapat ditentukan. Pengenceran tertinggi yang
masih menimbulkan reaksi aglutinasi menunjukkan titer antibodi dalam
serum.
2. Uji Weil-Felix
Uji Weil-Felix merupakan uji yang dilakukan terhadap infeksi oleh
riketsia. Uji ini melibatkan antigen heterofil, beberapa riketsia memiliki
antiten yang sama seperti yang terdapat pada galur-galur Proteus spp.
Artinya serum dari pasien yang menderita infeksi oleh riketsia akan
mengaglutinasikan suspensi bakteri Proteus spp. Reaksi Weil-Felix ini
bersifat diferensial, atau diagnostik terhadap penyakit-penyakit tertentu
yang disebabkan oleh riketsia karena terjadinya aglutinasi galur-galur ini
6
 secara selektif. Uji Aglutinasi biasanya digunakan dalam penentuan
golongan darah ABO dan penentuan tipe Rh.
3. Penggolongan Darah ABO
Pada proses transfusi darah, pertimbangan utama ditunjukkan pada
interaksi antara antibodi resipien dan sel-sel donor. Transfusi yang
inkompatibel (tidak serasi) akan mengakibatkan terjadinya penggumpalan
serta lisis sel yang ditransfusikan oleh isoantibodi dan komplemen serum
si donor. Hal ini dapat menyebabkan terganggunya fungsi ginjal pada
donor.
Orang-orang dengan golongan darah O, yang memiliki agulitinin anti-A
dan anti-B dalam serum darahnya disebut sebagai donor universal,
sedangkan golongan darah AB yang memiliki aglutinogen A dan B
disebut sebagai resipien universal.
4. Penentuan tipe darah Rh
Pada sistem Rh tidak dijumpai isoantibodi alamiah terhadap antigen Rh.
Namun demikian, seseorang dengan Rh negatif yang menerima sel-sel
darah dengan Rh positif akan memberikan respon dengan cara
mensintesis antibodi terhadap faktor Rh. Untuk melakukan uji Rh dapat
dilakukan dengan menambahkan antigen D pada darah. Penyakit yang
dapat ditimbulkan apabila perkawinan terjadi antara rherus yang berbeda
adalah eritroblastosis fetalis bada bayi mereka. Hal ini dapat terjadi bila
ayah rhesus positif sedangkan ibunya rhesus negatif, rhesus positif lebih
dominan terhadap rhesus negatif. . Anak dari pasangan beda rhesus punya
kemungkinan 50-100% berrhesus positif. Kemungkinan berrhesus negatif
hanya 0-50%. Artinya rhesus si anak lebih mungkin berbeda dengan si
ibu. Perbedaan rhesus antara calon bayi dengan ibu akan menimbulkan
masalah. Melalui plasenta, rhesus darah janin akan masuk ke peredaran
darah si ibu. Selanjutnya ini akan menyebabkan tubuh si ibu
memproduksi antirhesus. Melalui plasenta juga, antirhesus ini akan
melakukan serangan balik ke dalam peredaran darah si calon bayi. Sel-sel
darah merah si calon bayi akan dihancurkan.Pada kehamilan pertama,
antirhesus mungkin hanya akan menyebabkan si bayi lahir kuning
(karena proses pemecahan sel darah merah menghasilkan bilirubin yang
menyebabkan warna kuning pada kulit). Tapi pada kehamilan kedua,
7
problemnya bisa menjadi fatal jika anak kedua juga memiliki rhesus
positif. Saat itu, kadar antirhesus ibu sedemikian tinggi, sehingga daya
rusaknya terhadap sel darah merah bayi juga hebat. Ini bisa menyebabkan
janin mengalami keguguran.

1. Pemeriksaan Golongan Darah

 Tujuan
Untuk menentukan golongan darah seseorang dengan mereaksikan
antibodi yang terdapat dalam serum dan antigen A, B, AB dan O
dalam reagen
 Prinsip
Antigen pada darah akan bereaksi dengan antisera pada reagen
yang akan menimbulkan aglutinasi.
 Alat dan Bahan
Objek glass, Blood lancet, darah kapiler, Serum anti A, B, AB
 Cara Kerja
1. Jari pasien yang akan ditusuk didesinfeksi dengan alkohol 70%
2. Di tusuk denan lancet: tetesan pertama dihapus dengan kapas
kering: tetsan kedua selanjutnya ditaruh diobjek glass dengan 3
bagian
3. Kemudian ditetesi dengan anti sera A, anti sera B, anti sera Ab
4. Dicampur dengan baik kemudian digoyangkan.
 Interpretasi Hasil
Apabila terjadi aglutinasi pada anti sera A  Golongan darah A
Apabila terjadi aglutinasi pada anti sera B  Golongan darah B
Apabila terjadi aglutinasi pada anti sera AB  Golongan darah
AB
Apabila tidak terjadi aglutinasi pada anti sera  Golongan darah
O
2. Pemeriksaan Widal
 Tujuan
Untuk mengetahui adanya antibody spesifik terhadap bakteri
Salmonella

8
  Prinsip
Reaksi aglutinasi yang terjadi bila serum penderita dicampur
dengan suspensi antigen Salmonella typhosa. Pemeriksaan yang
positif ialah bila terjadi reaksi aglutinasi antara antigen
danantibodi (agglutinin).
 Alat dan Bahan
Tabung reaksi, Rak tabung, Mikropipet 10ul dan 5ul, reagen,
papan slide.
 Cara Kerja
1. Siapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Ditetesi 20ul serum dan 1 tetes larutan tydal pada slide test,
jika hasilnya positif, lanjutkan pada pengenceran 10ul
3. Ditetesi 10ul serum dan 1 tetes larutan tydal
4. Jika masih positif pada pengenceran 10ul, maka dilanjutkan
seperti perlakuan diatas dengan pengenceran 5ul.
5. Kemudian baca hasilnya.
 Interpretasi Hasil
Pengenceran 20 ul = 1/80
Pengenceran 10 ul = 1/160
Pengenceran 5 ul = 1/320
3. Pengujian RF
 Tujuan
mengetahui Rheumatoid Factor dalam serum secara kualitatif
 Prinsip
Partikel latex yang dilapisi gamma globulin manusia yang telah
dimurnikan: ketika suspensi latex dicampur dengan serum yang
kadar RF nya meningkat: aglutinasi jelas terlihat dalam waktu 2
menit.
 Alat dan Bahan
Pengaduk, test slide, mikropipet, serum.
 Cara Kerja
1. Reagen dan serum diinkubasi dalam suhu kamar
2. Teteskan 50 mikroL serum pasien ke dalam lubang slide

9
 3. Kocok reagen latex
4. kemudian teteskan ke dalam lubang dengan penetes yang
disediakan
5. Campur tetesan menggunakan alat disposable untuk
memastikan seluruh lubang test tercampur
6. Putar test slide: selama 2 menit lihat aglutinasi yang terjadi.
4. Uji ASTO/ASO
 Tujuan
mengetahui arah Stertolysin O dalam serum secara kualitatif
dimurnikan.
 Prinsip
Suspensi latex dicampur dengan serum dengan kadar meningkat:
aglutinasi terjadi dalam waktu 2 menit
 Alat dan Bahan
Pengaduk, test slide, mikropipet, serum.
 Cara Kerja
1. Reagen dan serum diinkubasi dalam suhu kamar
2. Teteskan 50 mikroL serum pasien ke dalam lubang slide
3. Kocok reagen latex
4. kemudian teteskan ke dalam lubang dengan penetes yang
disediakan
5. Campur tetesan menggunakan alat disposable untuk
memastikan seluruh lubang test tercampur
6. Putar test slide: selama 2 menit lihat aglutinasi yang terjadi.
5. Uji CRP
 Tujuan
untuk mendeteksi adanya infeksi kerusakan jaringan: inflamasi.
 Prinsip
Aglutinasi pasif terbalik dimana latex dilapisi antibodi CRP dan
yang dideteksi adala! antigen CRP dalam serum dengan kadar
tinggi: aglutinasi terlihat dalam waktu 2 menit.
 Alat dan Bahan
Objek glass, mikropipet, tip, pengaduk.

10
 Cara Kerja
1. Masukan 50ul serum dalam test slide
2. Tambahkan satu tetes suspensi
3. Campurkan suspensi dengan cara digoyang
4. Putar test slide selama 2 menit.
5. Lihat aglutinasi yang terjadi.
 Interpretasi Hasil
Hasil Positif : Aglutinasi kasar
Positif Lemah : Aglutinasi halus
Hasil Negatif : Tidak ada aglutinasi

11
 TEKNIK DETEKSI ANTIGEN ANTIBODI DENGAN PRINSIP
PRESIPITASI

A. DEFINISI
Presipitasi adalah hasil kombinasi antara antigen terlarut dengan antibodi
terlarut menghasilkan suatu komplek yang terlihat. Proses presipitasi pertama
kali ditemukan oleh Kraus tahun 1897 saat kultur bakteri enterik membentuk
presipitat bila dicampur dengan antibodi spesifik.
Presipitation adalah salah satu metode sederhana yang mendeteksi reaksi
antigen-antibodi. kebanyakan antigen multivalent sehingga mampu
membentuk satu aggregat dengan adanya antibodi yang seuai. Jika antigen
terlarut bergabung dengan antibodinya dalam lingkungan yang mengandung
elektrolit ( NaCl ) pada suhu dan pH yang cocok, maka gabungan antigen
antibodi ini menjadi presipitat yang tidak dapat larut.

B. TUJUAN UJI PRESIPITASI

Penggunaan reaksi presipitasi yaitu:
1. Menentukan jenis kuman
2. Identifikasi unsur antigenik pada kuman di dalam jaringan binatang yang
terinfeksi
3. Pembakuan toksin dan antitoksin
4. Mencari antibodi di dalam serum
5. Uji serologis medikolegal untuk mendeteksi darah, serum dll.

C. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI REAKSI PRESIPITASI

1. Sifat antigen (Ag)
2. Elektrolit dan Ph
3. Waktu dan suhu
4. Ratio antigen-antibody (Ag-Ab)

D. REAKSI PRESIPITASI
Pada uji presipitin terjadi reaksi antara satu antigen yang dapat larut dengan
antibodi homolognya. Reaksi ini berlangsung dengan poembentukan
presipitat (endapan) kasat mata pada batas permukaan reaktan-reaktan

12