LAPORAN PRAKTIKUM

FUNDAMENTAL OF MOLECULAR BIOLOGY

Isolasi DNA

Disusun oleh:

Jeannete Claudia Wulandari

472018041

PROGRAM STUDI GIZI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Manusia memiliki sifat-sifat yang diturunkan dari leluhurnya. Penurunan sifat tersebut
terbawa oleh gen yang berada dalam setiap tubuh manusia. Gen adalah pembawa materi
genetik yang diwariskan dari induk kepada keturunannya. Materi genetik tersebut adalah DNA
(asam deoxyribonukleat) dan RNA (asam ribonukleat). Pada praktikum ini, praktikan
melakukan isolasi DNA dengan membuktikan bahwa DNA berbentuk benang-benang putih
pada akhir percobaan.
DNA merupakan unit keturunan terkecil dan terdapat pada semua makhluk hidup mulai
dari mikroorganisme sampai organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tanaman.
Tiap jaringan dalam tubuh manusia memiliki kandungan DNA yang berbeda tergantung
struktur serta komposisi sel. Jaringan yang memiliki inti sel dan sedikit jaringan ikat umumnya
mempunyai kadar DNA yang tinggi. Kualitas DNA yang baik yang diperoleh dari hasil
ekstraksi merupakan syarat dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler, terutama dalam
penandaan sidik jari DNA (Yudianto, 2016).
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu, DNA juga bisa diisolasi.
Pengisolasian komponen tersebut dari sel penting dilakukan dengan menggunakan metode
yang tersedia, yaitu lisis, presipitasi dan pemurnian. Pada seluruh jaringan dan cairan tubuh
terdapat DNA. Oleh karena itu, DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang
mengandung inti sel, seperti darah, rambut, tulang dan lain-lain (Siswanto, 2016). Isolasi DNA
adalah suatu teknik dimana hasil akhirnya benang-benang DNA dapat terpisan dalam bentuk
kumpulan benang berwarna putih. Tujuan dari isolasi DNA adalah mendapatkan ekstrak DNA
pada jaringan atau sel yang diinginkan (Agus, 2014).
1.2 Tujuan
Tujuan dari pelaksanaan praktikum ini adalah agar praktikan mampu menjaalankan
tahapan-tahapan isolasi DNA dengan benar serta praktikan mampu mengisolasi dan
mendeteksi DNA pada sampel darah manusia.
 BAB II

METODELOGI

2.1 Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan pada hari Rabu, 19 Juni 2019, pukul 13.00 – 15.00 WIB di
Laboratorium Dasar, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Satya Wacana.
2.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah mikropipet, tip, microtube 1,5 mL,
rak microtube, box ice, vortex, sentrifuge, spidol, water bath, lemari asam dan label. Bahan yang
digunakan pada praktikum ini adalah sampel darah, buffer A, buffer B, buffer C, buffer D, fenol, fenol-
kloroform, etanol 70%, etanol absolut dan akuades.

2.3 Prosedur Kerja

Praktikum ini dilalui dengan tiga tahapan, yaitu lisis presipitasi dan pemurnian.
Tahapan pertama yang dilakukan oleh praktikan adalah tahap lisis. Pertama disiapkan sampel
darah manusia dalam box ice dan disiapkan microtube serta diberi label yang sesuai dengan
sampel. Lalu diambil buffer A sebanyak 500 μl dan dimasukan ke dalam microtube 1,5 ml
yang telah diberi label. Sampel darah diambil sebanyak 300 μl dan dimasukan ke dalam
microtube yang berisi buffer A. Mikrotube yang sudah berisi dibolak balik dengan kuat sampai
larutan larut dan bercampur. Setelah tercampur, larutan diinkubasi di suhu ruang selama 10
menit. Lalu larutan disentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm dan suhu 40C selama 2 menit.
Larutan yang telah beres disentrifuge diambil supernatannya (bagian atas) dengan hati-hati,
pelet yang berada didasar microtube dibuang. Setelah itu supernatan yang telah dipisahkan
ditambahkan buffer B sebanyak 500 μl. Tabung microtube dibolak balik, di vortex dan
disentrifuge kembali seperti setelah penambahan buffer A. Setelah larutan selesai dicampur,
ditambahkan buffer C sebanyak 500 μl dan larutan tersebut diinkubasi di water bath dengan
suhu 370C selama 15 menit. Lalu dilakukan kembali bolak balik tabung tabung dengan kuat
kemudian di vortex selama 2 menit hinggal larut.
Selanjutnya dilakukan tahap presipitasi dengam menambahkan 200 μl fenol yang
dilakukan di lemari asam. Lalu dilakukan kembali bolak balik tabung kemudian di vortex
dengan kuat selama 5 menit. Setelah itu larutan disendtrifuge dengan kecepatan 13.00 rpm dan
suhu 40C selama 3 menit. Diambil supernatan dengan mikropipet lalu dipindahkan dengan hati-
hati ke microtube 1,5 ml yang baru. Setelah itu bagian supernatant yang telah dipindahkan
ditambahkan 400 μl fenol : kloroform (1:1). Larutan tersebut dibolak balik secara perlahan
sampai semua larutan tercampur dengan baik kemudian divortex secara perlahan selama 5
menit dan dilanjutkan dengan sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm dengan suhu 40C
selama 2 menit sampai larutan terpisah menjadi 2 bagian. Setelah terlihat 2 bagian tersebut
bagian supernatant diambil kembali menggunakan mikropipet dan dipindahkan secara hati-hati
ke microtube 1,5 ml baru.

Proses terakhir adalah proses pemurnian. Larutan ditambahkan etanol absolut sebanyak
500 μl, lalu dibolak balik selama 10 menit hingga terlihat lapisan benang-benang putih. Setelah
itu larutan di sentrifuge dengan kecepatan 13.000 rpm dengan suhu 40C selama 2 menit sampai
terlihat pelet kecil berwarna putih pada bagian bawah microtube. Supernatant yang terjadi pada
microtube dibuang secara hati-hati, kemudian ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 μl.
Larutan dibolak balik secara perlahan untuk mencuci pelet DNA, lalu di sentrifuge dengan
kecepatan 13.000 rpm dengan suhu 40C selama 1 menit sampai terlihat pelet kecil berwarna
putih. Etanol dibuang secara hati-hati dan jangan sampai pelet terbuang. Kemudian larutan di
kering anginkan selama 2 menit, lalu ditambahkan buffer D sebanyak 100 μl. Sampel larutan
tersebut disimpan di temperature 200C dan siap untuk dianalisis berikutnya.
 BAB III
HASIL
3.1 Tabel alat beserta fungsinya
No Nama Keterangan Gambar

Terdapat endapan berwarna merah dan

1 Tahap Lisis
cairan berwarna bening keruh.

Tidak terdapat endapan, cairan

2 Tahap Presipitasi
berwarna bening

Tidak terdapat benang-benang putih,

3 Tahap Pemurnian
cairan berwarna bening
 BAB IV

PEMBAHASAN

Setiap tahapan pada isolasi DNA memiliki prinsip masing-masing. Prinsip dari tahap
lisis adalah untuk memecah darah untuk mendapatkan DNA yang berapa dalam sampel darah
manusia. Pada proses ini dilakukan perusakan atau penghancuran membrane dan dinding sel.
Tahap selanjutnya adalah presipitasi, tahap ini juga memiliki prinsip yaitu, menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan. DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan
protein yang masih tersisa. Selanjutnya adalah tahap pemurnian, pada taham ini prinisip yang
dilakukan adalah untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA (Suhharsono, 2009).

Isolasi DNA yang dilakukan praktikan menggunakan 3 tahapan, yaitu lisis, presipitasi
dan pemurnian. Pada tahap lisis digunakan sodium dodecyl sulphate (SDS) atau sering disebut
dengan detergen untuk tahap lisis, namun SDS memiliki peran lain, yaitu dapat mengurangi
aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA. SDS juga dapat merusak
membrane sel dan menyebabkan pecahnya kromosom. Pada praktikum ini digunakan buffer,
fungsinya adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi
sehingga mudah dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim
pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA (Ardiana, 2009). Selanjutnya
adalah tahap presipitasi atau bisa disebut dengan pemekatan DNA dilakukan dengan tujuan
agar DNA dalam darah mengendap sekaligus memisahkan dari garam-garam mineral. Pada
tahap presipitasi digunakan fenol-kloroform yang memiliki perbandingan 1:1. Fungsi dari
fenol sendiri adalah untuk mengikat air dan mendenaturasi protein. Setelah itu masuklah ke
tahap pemurnian. Digunakan etanol absolut (70%) untuk memurnikan larutan, kemudian etanol
dibuang dan pelet atau endapan yang terjadi dikeringkan. Perlakuan ini bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari endapan DNA (Clark, 2010). Prinsip isolasi DNA pada
berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki
modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan.

Keberhasilan dari isolasi DNA dipengaruhi beberapa faktor, pertama adalah senyawa
metabolit karena akan mempengaruhi kualitas dan kuantitas DNA. Kedua adalah kadar air,
karena semakin banyak kadar air maka DNA yang terkandung lebih banyak. Ketiga adalah
jenis detergen yang digunakan, maksudnya adalah jika suatu bahan diberikan detergen maka
tidak semua proses isolasi akan sempurna. Terakhir adalah suhu yang dikandung etanol karena
akan menyebabkan adanya ruang untuk DNA menggumpal (Ediwirman, 2009). Namun ada
juga faktor yang mempengaruhi kegagalan isolasi DNA yaitu kesterilan. Hal ini sangat penting
dalam isolasi DNA karena jika sampel terkontaminasi sedikit saja akan berpengaruh besar
terhadap hasilnya.

Darah manusia dan hewan memiliki kesamaan yaitu sama-sama memiliki eritrosit,
leukosit dan trombosit. Pada sel darah hewan vertebrata memiliki perbedaan dalam hal bentuk,
ukuran dan jumlahnya. Kebanyakan hewan vertebrata memiliki sel darah merah berinti, tetapi
sel darah merah mamalia tidak berinti. Selain itu, biasanya vertebrata rendah cenderung
memiliki sel darah merah lebih sedikit tetapi lebih besar dari invertebrate yang lebih tinggi.
Pada manusia sel darah merah tidak memiliki inti. Bentuk dari sel darah merah manusia dan
hewan pun berbeda, manusia berbentuk bikonkaf sedangkan hewan berbentuk oval dan
memiliki ukuran yang lebih besar dari pada manusia. Selain itu, darah manusia selalu hangat,
tapi tidak pada hewan, kecuali mamalia dan burung. Presentase jenis sel pada manusia dan
hewan juga berbeda satu sama lain. Efisiensi fungsi dari darah manusia sangat tinggi
dibandingkan dengan hewan (Mediawati, 2009).
 BAB V
KESIMPULAN

Setelah melakukan praktikum ini, praktikan mampu menjalankan tahapan-tahapan

isolasi DNA dengan benar. Tahapan-tahapan isolasi DNA adalah tahap lisis, tahap presipitasi
dan pemurnian. Pada setiap tahap tersebut, praktikan dapat menggunakan alat-alat yang dipakai
pada praktikum ini dengan baik dan benar. Praktikan juga mampu memahami prosedur kerja
yang ada. Praktikan juga mampu mengisolasi dan mendeteksi DNA pada sampel darah
manusia, tetapi pada praktikum ini praktikan tidak menemukan adanya benang-benang putih
yang berada pada hasil akhirnya. Hal ini bisa terjadi karena beberapa faktor yaitu,
terkontaminasinnya DNA, konsentrasi DNA, dan lain-lain.
 DAFTAR PUSTAKA
Ardiana, W. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan
Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Journal Teknik Pertanian Vol 14 No1:
12-16. Jakarta.

Agus, Rosana. Sjafaranaiin. 2014. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka WIrausaha
Muda dan ESESE Foundation. Bogor.

Clark, D. P. 2010. Molecular Biology: Academic Cell Update. Elsevier Academic Press. San
Diego. USA.

Ediwirman. Mansya, Ellina. 2009. Optimasi Metode Isolasi DNA Genom pada Tanaman
Kapulasan. Jurnal Agroekotek 1 (1): 7-11, Juli 2009. Universitas Tamansiswa.
Padang.

Mediawati, Dina. Dkk. 2009. Fisiologi Darah Katak dan Manusia. Jurnal Hematologi Vol 2 No
10. FMIPA Universitas Negri Jakarta. Jakarta.

Siswanto, Jo Edy. Dkk. 2016. Isolasi DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada
Bayi Penderita ROP: Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian.
Jurnal Sari Pediatri Vol 18 No 4, Desember 2016. Jakarta.

Suharsono. Widyastuti, Utut. 2009. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. IPB
Press. Bogor.

Yudianto, Ahmad. 2016. Isolasi DNA dari Bercak Urine Manusia sebagai Bahan Alternatif
Pemeriksaan Identifikasi Personal. Jurnal Media Pharmaceutica Indonesiana Vol
1 No 1 Juni 2016. Universitas Airlangga. Surabaya.