kertas yang biasa digunakan terdiri dari selulosa yang sangat murni.

struktur selulosa polimer

mengandung beberapa ribu unit anhydroglucose yang dihubungkan melalui atom oksigen. secara
teoritis, ada tiga gugus hidroksil pada setiap unit glukosa, tetapi banyak di antaranya telah teroksidasi
sebagian selama pembuatan menjadi aldehida, keton, atau gugus fungsi karboksil. selain variasi, kertas
akan mengandung jejak banyak kotoran, termasuk zat anorganik yang disimpan sebagai kation yang
dapat ditukar pada gugus hidroksil, garam yang teradsorpsi, atau bahan mineral yang tertinggal di pape
selama pemrosesan. selulosa memiliki afinitas yang besar terhadap air dan pelarut polar lainnya dan
menahannya dengan kuat melalui pembentukan ikatan hidrogen. pelarut ini menembus serat dan
menyebabkan kertas membengkak, mengubah dimensinya. dalam air, selulosa sangat polar dan menjadi
elektronegatif. efek ini berkurang dalam pelarut konstanta dielektrik yang lebih rendah atau dengan
meningkatnya konsentrasi garam. makalah ini menunjukkan sifat penukar ion yang lemah serta sifat
adsorptif. lebih jauh lagi, ini adalah agen pereduksi ringan, dan pada kontak yang lama itu akan bereaksi
dengan banyak agen pengoksidasi.

sebagian besar sifat yang baru saja dijelaskan bervariasi dari kertas ke kertas bahkan dalam banyak yang
sama. berharap asam, membilas, dan mengeringkan bantuan dalam mendapatkan perilaku yang dapat
direproduksi, tetapi, paling baik, variasi dalam nilai Rf dapat diharapkan. kertas yang dimodifikasi
sekarang tersedia di mana kertas telah diresapi dengan gel silika, resin penukar ion, dll. Sementara
modifikasi ini mengarah pada mekanisme untuk pemisahan, tekniknya sama.

kertas yang biasa digunakan terdiri dari selulosa yang sangat murni. struktur selulosa polimer
mengandung beberapa ribu unit anhydroglucose yang dihubungkan melalui atom oksigen. secara
teoritis, ada tiga gugus hidroksil pada setiap unit glukosa, tetapi banyak di antaranya telah teroksidasi
sebagian selama pembuatan menjadi aldehida, keton, atau gugus fungsi karboksil. selain variasi, kertas
akan mengandung jejak banyak kotoran, termasuk zat anorganik yang disimpan sebagai kation yang
dapat ditukar pada gugus hidroksil, garam yang teradsorpsi, atau bahan mineral yang tertinggal di pape
selama pemrosesan. selulosa memiliki afinitas yang besar terhadap air dan pelarut polar lainnya dan
menahannya dengan kuat melalui pembentukan ikatan hidrogen. pelarut ini menembus serat dan
menyebabkan kertas membengkak, mengubah dimensinya. dalam air, selulosa sangat polar dan menjadi
elektronegatif. efek ini berkurang dalam pelarut konstanta dielektrik yang lebih rendah atau dengan
meningkatnya konsentrasi garam. makalah ini menunjukkan sifat penukar ion yang lemah serta sifat
adsorptif. lebih jauh lagi, ini adalah agen pereduksi ringan, dan pada kontak yang lama itu akan bereaksi
dengan banyak agen pengoksidasi.
sebagian besar sifat yang baru saja dijelaskan bervariasi dari kertas ke kertas bahkan dalam banyak yang
sama. berharap asam, membilas, dan mengeringkan bantuan dalam mendapatkan perilaku yang dapat
direproduksi, tetapi, paling baik, variasi dalam nilai Rf dapat diharapkan. kertas yang dimodifikasi
sekarang tersedia di mana kertas telah diresapi dengan gel silika, resin penukar ion, dll. Sementara
modifikasi ini mengarah pada mekanisme untuk pemisahan, tekniknya sama.

alat. peralatan yang diperlukan untuk kromatografi kertas terdiri dari dukungan untuk kertas, palung
pelarut, dan ruang kedap udara di mana penguapan pelarut yang mudah menguap dari area kertas yang
terbuka lebar. ukuran ruang dapat bervariasi dari tabung reaksi biasa ke akuarium besar tergantung
pada ukuran kertas. jika banyak kromatografi kertas harus dilakukan, mungkin lebih mudah untuk
mengontrol suhu seluruh ruangan, katakanlah sampai 18 C. komponen dasar yang diilustrasikan pada
Gambar 6-1 cukup untuk kromatografi kertas sederhana, tetapi sejumlah modifikasi tersedia untuk
metode pengembangan khusus yang akan dijelaskan di bawah ini.

sampel diterapkan sebelum mencelupkan ke dalam pelarut yang dielusi sebagai kecil dengan perangkat
apa pun yang akan mentransfer volume kecil; mis., tusuk gigi, lingkaran tabung kapiler kawat platinum,
pipet-mikro, dll. untuk beberapa metode, sampel dapat diterapkan sebagai solusi, pelarutnya harus
diuapkan sebelum melanjutkan.

metode pendeteksian yang biasa digunakan adalah: (1) warna komponen yang terlihat secara inheren
(bila memungkinkan), (2) reaksi dengan reagen penghasil warna, (3) absorbansi ultraviolet, (4)
absorbansi inframerah, (5) fluoresensi, ( 6) radioaktif, (7) bioautografi, atau (8) ekstraksi dan uji kimia
atau fisik lebih lanjut. reagen mudah diaplikasikan dengan menyemprotkan perendaman, atau dengan
menguapkan ke uap. misalnya, pereaksi ninhidrin yang disemprotkan pada kertas bereaksi dengan
amina dan asam amina untuk membentuk warna biru atau ungu.

bioautografi melibatkan menempatkan kertas dalam kontak dengan media kultur untuk periode waktu
diikuti dengan pemeriksaan tingkat pertumbuhan relatif bakteri di sepanjang strip kertas. senyawa
sampel dapat memiliki efek positif atau negatif pada tingkat pertumbuhan bakteri dalam media kultur.

pengembangan. untuk semua jenis pengembangan, kertas harus diseimbangkan dengan uap pelarut di
dalam kamar sebelum pengembangan dimulai.

perkembangan menanjak. ini adalah tipe yang paling sederhana dan paling populer. kertas ditangguhkan
secara vertikal dengan sekitar satu inci direndam dalam pelarut dan titik sampel terletak sekitar satu inci
di atas permukaan pelarut untuk mencegah difusi sampel ke bawah ke dalam reservoir pelarut. pelarut
naik melalui kertas dengan aksi kapiler. tingkat pendakian lambat dan menurun seiring waktu karena
gravitasi. Namun, laju yang lambat meningkatkan kemungkinan mencapai keseimbangan partisi dan
sering menghasilkan titik-titik yang padat dan terdefinisi dengan tajam.

menurun perkembangan. dengan palung pelarut di bagian atas bilik, arah aliran ke bawah, untuk
mencegah menyedot cepat, kertas dilipat menjadi bentuk-U dengan kenaikan awal singkat dari tangki
pelarut. meskipun aparatusnya agak lebih rumit, metode ini jauh lebih cepat dari yang sebelumnya,
potongan kertas yang lebih panjang dapat digunakan, dan pelarut dalam jumlah besar dapat digunakan
jika perlu untuk tempat yang bergerak lambat.

pengembangan dua dimensi. dalam semua metode kromatografi yang dijelaskan sebelumnya, pelarut
elusi (atau gas pembawa) dapat mengalir dalam satu arah saja - melalui kolom atau melintasi kertas.
pada permukaan bidang, seperti selembar kertas, dimungkinkan untuk melakukan pengembangan
berurutan dalam dua arah. sampel diterapkan sebagai titik dekat sudut. ini dikembangkan secara normal
dengan prosedur naik atau turun hingga titik bergerak tercepat mendekati ujung kertas. kemudian
kertas dihilangkan, dan setelah penguapan pelarut, itu berubah 90 derajat dan dikembangkan untuk
kedua kalinya dengan pelarut lain yang memiliki sifat eluting yang berbeda. dengan cara ini, sampel yang
hanya dapat dipisahkan sebagian dengan salah satu pelarut saja, dapat sepenuhnya dipisahkan oleh
kombinasi pelarut seperti yang ditunjukkan pada gambar 6-2

perkembangan radial. dalam metode ini sampel terlihat di tengah cakram kertas yang ditempatkan
secara horizontal dengan sumbu untuk memasok pelarut ke pusat melalui pasokan di bawah ini.
komponen bergerak ke luar sepanjang lingkaran jalur radial dari diameter yang meningkat. pita kurang
lebih menajamkan diri sendiri karena pelarut memindahkan tepi lebih cepat dari tepi terkemuka, cawan
Petri tertutup adalah wadah yang memadai, atau kertas dapat diapit di antara dua lempeng kaca,
dengan lubang di tengah atas untuk pengenalan pelarut.

untuk pengembangan yang cepat, seseorang dapat memutar disk dengan kecepatan tinggi sehingga
aliran yang diselesaikan dengan gaya sentrifugal serta oleh tindakan kapiler.

pilihan sistem pelarut. fase yang lebih polar, biasanya air, lebih disukai diserap oleh kertas dan ditahan
diam sementara fase yang lebih polar mengalir di atasnya. dalam beberapa kasus mungkin diinginkan
untuk menghilangkan air dari kertas dalam operasi pengeringan awal dan menggunakan alkohol, glikol,
formamida, atau pelarut polar lainnya sebagai fase diam. jika air digunakan sebagai fase diam, perlu
bahwa pelarut bergerak tidak dapat bercampur karena fase air secara kuat dipegang oleh kertas. fase
berair dapat, tentu saja, menjadi penyangga yang diinginkan. fase gerak dapat berupa campuran
pelarut, misalnya, alkohol, keton, ester, amina, fenol, hidrokarbon, dll., dipilih sehingga mencapai
pemisahan maksimum dari komponen sampel.

Selain pemisahan yang optimal, ada faktor lain yang perlu dipertimbangkan adalah memilih sistem
pelarut. semakin banyak komponen yang dikandung sistem pelarut, semakin sulit untuk
mempertahankan atmosfer jenuh di dalam ruangan. penguapan yang mengubah komposisi pelarut akan
mempengaruhi nilai. juga, perubahan suhu akan lebih kritis dalam sistem campuran. sistem pelarut tidak
boleh mengganggu prosedur deteksi (atau harus siap dan sepenuhnya dapat diuapkan sehingga dapat
dihilangkan sebelum deteksi).

idealnya, seseorang harus memilih sistem pelarut sehingga kedua fase tidak dapat bercampur, dan di
mana komponen sampel memiliki kelarutan yang tinggi, tetapi berbeda di kedua fase. situasi ini akan
menyebabkan pemisahan maksimum dengan penyebaran minimum dalam waktu singkat.

kromatografi fase terbalik. jika kertas dilapisi dengan zat hidrofobik, seperti getah karet, minyak mineral,
atau minyak silikon, dan fase polar yang digunakan untuk mengelusi, diperoleh pembalikan dari
distribusi normal. sistem semacam itu mungkin menguntungkan untuk pemisahan asam lemak dan
senyawa nonpolar yang dapat bergerak terlalu cepat karena kelarutannya rendah dengan fase diam
polar.

kelebihan dan keterbatasan. kertas kromatografi biasanya digunakan untuk analisis yang akan sulit,
memakan waktu, atau mahal menjadi metode yang lebih konvensional. berpikir beberapa prosedur
mungkin memerlukan beberapa jam, waktu operator memang sangat kecil. sangat cocok untuk sampel
di wilayah mikrogram, dan untuk campuran susbtances yang terkait erat secara kimia.

keterbatasan sampel kecil mungkin menjadi kerugian jika deteksi membutuhkan teknik tambahan.
variabilitas makalah ini merupakan masalah serius meskipun situasi ini membaik. sebagian besar
prosedur telah sampai pada cara empiris, dan hampir tidak bisa disebut kuantitatif.

aplikasi. kertas kromatografi telah berhasil diterapkan pada masalah dalam kimia anorganik dan organik
serta dalam biokimia. prospektor telah menggunakannya untuk menentukan logam dalam sampel bijih.
kompleks logam isomer dapat diselesaikan. logam dengan sifat kimia yang serupa mudah diselesaikan.
hampir semua campuran bahan kimia organik dapat dipisahkan dan kimiawan organik sering
menggunakannya sebagai pemeriksaan cepat untuk kemurnian atau sebagai metode percontohan untuk
menentukan kondisi optimal untuk pemisahan kromatografi kolom skala besar.

metode ini telah membuat dampak terbesar dalam biokimia di mana masalah analitis yang sulit dengan
sampel kecil yang semakin menghilang sangat banyak. literatur terus berkembang: kontrol kemurnian
obat-obatan dan produk makanan, studi pematangan dan fermentasi, deteksi obat-obatan dan obat bius
pada hewan dan manusia, analisis kosmetik, deteksi pezina dan kontaminan dalam makanan dan
minuman, dan , tentu saja, analisis sebagian besar campuran reaksi dipelajari oleh ahli biokimia.

the paper commonly used consists of highly purified cellulose. the polymeric cellulose structure contains
several thousand anhydroglucose units linked through oxygen atoms. theoretically, there are three
hydroxyl groups on each glucose unit, but many of these have been partially oxidized during
manufacture to aldehyde, ketone, or carboxyl functional groups. in addition to the variations, the paper
will contain traces of many impurities, including inorganic substances held as exchangeable cations on
the hydroxyl groups, adsorbed salts, or mineral matter left on the pape during processing. cellulose has
a great affinity for water and other polar solvents and holds them tenaciously through the formation of
hydrogen bonds. these solvents penetrate the fibers and cause the paper to swell, changing its
dimensions. in water, the cellulose is highly polar and becomes electronegative. this effect is decreased
in solvents of lower dielectric constants or with increasing salt concentrations. the paper exhibits weak
ion exchange properties as well as adsorptive properties. furthermore, it is a mild reducing agent, and
on prolonged contact it will react with many oxdizing agents.

most of the properties just described vary from paper to paper even within the same alot. acid-wishing,
rinsing, and drying aid in obtaining reproducible behavior, but, at best, variations in Rf values can be
expected. modified paper are now available in which the paper has been impregnated with silica gel, ion
exchange resins, etc. while these modifications lead to mechanisms for the separation, the technique is
the same.

apparatus. the apparatus required for paper chromatography consists of support for the paper, a
solvent trough, and an air-tight chamber in which evaporation of the volatile solvents from the large
exposed area of the paper. the size of the chamber may vary from an ordinary test-tube to a large
aquarium depending on the size of paper. if a great deal of paper chromatography is to done, it may be
simpler to control the temperature of the entire room, say to 18 C. the basic components illustrated in
figure 6-1 are sufficient for simple paper chromatgraphy, but a number of modifications are available
for special methods of development to be described below.
the sample is applied prior to dipping into the eluting solvent as a small with any device that will transfer
a small volume; e.g., a toothpick, loop of platinum wire capillary tube, micro-pipet,etc. for some
methods, the sample may be applied as a solution, its solvent should be evaporated before proceeding.

the methods of detection commnly used are: (1) inherent visible colors of the components (whenever
possible), (2) reactions with color-producing reagents, (3) ultraviolet absorbance, (4) infrared
absorbance, (5) fluorescence, (6) radioactive, (7) bioautography, or (8) extraction and further chemical
or physical test. reagents are easily applied by spraying immersing, or by exposing to vapor. for example,
s ninhydrin reagent sprayed on the paper reacts with amines and amine acids to form a blue or purple
color.

bioautography involves placing the paper in contact with a culture medium for a period of time followed
by examination of the relative growth rates of bacteria along the paper strip. sample compounds may
have either a positive or negative effect on the growth rate of the bacteria in the culture medium.

development. for all types of development, the paper should be equilibrated with solvent vapors in the
chamber before development is begun.

ascending development. this is the simplest and most popular type. the paper is suspended vertically
with about an inch immersed in the solvent and the sample spot intially located about an inch above the
surface of the solvent to prevent diffusion of the sample downwards into the solvent reservoir. the
solvent ascends through the paper by capillary action. the rate of ascent is slow and decreases with time
because of gravity. however, the slow rate enhances the possibility of achieving partition equilibrium
and often results in compact, sharply defined spots.

descending development. with a solvent trough at the top of the chamber, the direction of flow is
downwards, to prevent rapid siphoning, the paper is folded into a U-shape with a short initial rise from
the solvent tank. although the apparatus is somewhat more elaborate, the method is much faster than
the previous one, longer pieces of paper may be used, and large amounts of solvent can be used if
necessary for slow-moving spots.

two-dimensional development. in all previously described methods of chromatography, the eluting

solvent (or carrier gas) could flow in one direction only-trough the column or accross the paper. on a
plane surface, such as a piece of paper, it is possible to carry out a sequential development in two
directions. the sample is applied as a spot close to a corner. this is developed in the normal fashion by
ascending or descending procedure until the fastest moving spot approaches the end of the paper. then
the paper is removed, and after evaporating the solvent, it is turned 90 derajat and developed a second
time with another solvent having different eluting properties. in this manner, sample which could be
only partially separated with either solvent alone, may be completely separated by the combination of
solvents as shown in figure 6-2

radial development. in this method the sample is spotted at the center horizontally placed disk of paper
with a wick to supply solvent to the center a supply trough below. the components move outward along
radial paths circles of increasing diamteres. the band are more or less self sharpen because the solvent
moves the trailing edge faster than the leading edge, covered Petri dish is an adequate container, or the
paper can be sandwiched between two glass plates, with a hole in the center of the upper one for the
introduction of solvent.

for fast development, one can rotate the disk at high speed so that the solved flows by centrifugal force
as well as by capillary action.

choice of solvent systems. the more polar phase, usually water, is preferentially adsorbed by the paper
and is held stationary while the less polar phase flow over it. in some cases it may be desirable to
remove the water from the paper in preliminary drying operation and use an alcohol, glycol, formamide,
or other polar solvent as a stationary phase. if water is used as a stationary phase, it is necessary that
the mobile solvent be immiscible because the water phase is tenaciously held by the paper. the aqueous
phase may, of course, be buffer desired. the mobile phase may be a mixture of solvents, for example,
alcohol, ketones, esters, amines, phenols, hydrocarbons, etc., selected so as achieve maximum
separation of the sample components.

in addition to optimum separation, there are other factors to be considered is choosing a solvent
system. the more components a solvent system containts, the more difficult it will be to maintain a
saturated atmosphere in the chamber. evaporation which changes the composition of the solvent will
affect the values. likewise, temperature change will be more critical in a mixed system. the solvent
system must not interfere with the detection procedure (or must be ready and completely vaporizable
so that it can be eliminated before detection).

ideally, one should choose solvent system such that the two phases are immiscible, and in which the
sample components have a high, but different solubility in the two phases. this situation will lead to
maximum separation with a minimum of spreading in the shortest time.

reversed-phase cromatography. if the paper is coated with a hydrophobic substance, such a rubber
latex, mineral oil, or silicon oil, and a polar phase used to elute, a reversal of the normal distribution is
obtained. such systems may be advantageous for the separation of fatty acids and nonpolar compounds
which may move too fast because of low solubility with a polar stationary phase.

advantages and limitations. paper cromatography is usually used for analyses that would be difficult,
time-consuming, or expensive be more conventional methods. thought some of the procedures may
require several hours, tehe operator time is indeed very small. it is particularly suitable for samples in
the microgram region, and for mixture of susbtances that are closely related chemically.

the small sample limitation may well be a disadvantages if detection requires an auxiliary technique. the
variability of the paper is a serious problem although this situation is improving. most of the procedurs
have been arrived at in an empirical fashion, and could hardly be called quantitative.

application. paper cromatography has been successfully applied to problems in inorganic and organic
chemistry as well as in biochemistry. prospectors have used it to determine metals in ore samples.
isomeric metal complexes can be resolved. metals with similar chemical properties are easily resolved.
nearly any mixture of organic chemicals can be separated and organic chemists often use it as a quick
check for purity or as a pilot method to dtermine the optimum conditions for a large scale column
chromatography separation.

the method has made its greatest impact in biochemstry where difficult analytical problems with
vanishingly small samples are legion. the literature expands continually: the control of purity of
pharmaceuticals and foodd products, the study of ripening and fermentation, the detection of drugs and
dopes in animals and humans, the analysis of cosmetics, the detection of adulterants and contaminats in
food and drink, and, of course, the analysis of most of the reaction mixtures studied by biochemists.