LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI PERTANIAN
“Pengecetan Gram dan Pengujian KOH Pada Bakteri “

OLEH

NAMA : UMAR TIMBU

NIM : D1B118106
KELAS : AGT-C
ASISTEN : ANDI SITTI RAHIMI HL

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2019
 I.PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Mikroba dapat kita jumpai pada seluruh lingkungan baik lingkungan normal

maupun ekstrim. Setiap mikroba membutuhkan kondisi lingkungan tertentu terkait

dengan karakter morfologi dan biokimia (metabolisme) yang dimilikinya. Oleh

karena itu, lingkungan hidup suatu mikroba akan berbeda–beda dan ada kalanya

hanya spesifik untuk mikroba tertentu. Suatu lingkungan tidak dapat dihindari bahwa

mikroba akan selalu berinteraksi dengan organisme lain, baik dengan kelompoknya

sendiri maupun dari kelompok lain.

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau

membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk

mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengabsorbsi dan membiaskan cahaya

sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat

warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi

yang mengandung zat pati dan granula fosfat.

Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalam mengidentifikasi

mikroba, salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiri dari berbagai bahan

kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka sel ini memperlihatkan

susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh disini adalah bakteri. Bakteri yang

hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut

disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah

untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut

juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Selain metode pewarnaan, terdapat pula metode yang digunakan untuk

mengetahui bakteri Gram positif dan negatif yaitu pengujian dengan menggunakan

larutan KOH. Pengujian ini dapat diketahui perbedaan yang mendasar antara bakteri

gram positif dan negatif yaitu apabila terbentuk lendir, maka menunjukkan bahwa

bakteri tersebut adalah bakteri Gram negatif, sedangkan apabila tidak terbentuk

lendir maka bakteri tersebut tergolong dalam bakteri gram positif.

Berdasarkan uraian di atas, maka perlu dilakukan praktikum pengecetan gram

dan pengujian KOH pada bakteri untuk membedakan kedua bakteri tersebut.

1.2. Tujuan

Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk melihat bentuk bakteri dan

mempelajari cara pewarnaan.

II. TINJAUAN PUSTAKA

 Bakteri merupakan mikroorganisme bersel tunggal dengan ukuran panjang

0,5-10 µ dan lebar 0,5-2,5 µ. Karakteristik bakteri dilihat dari bentuknya, seperti

bulat (cocci), batang (spirilli), koma (vibrios). Tambahan struktur bakteri yang

terpenting diketahui cambuk (flagella), kapsul (capsule) dan endospora (endospore).

Flagella merupakan struktur tambahan di luar sel yang berbentuk cabuk halus yang

tidak terlihat di bawah miskroskop kecuali menggunakan teknik perwarnaan khusus.

Susunan flagella pada sel yang untuk diidentifikasi dan dikelompokkan menjadi dua

golongan, yaitu flagella peitrichous dan flagella polar (Arisandi, 2017).

Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk mengetahui jenis gram dari

bakteri dilakukan pengecatan gram dimana bakteri gram negatif akan berwarna

merah, kuning sampai kejinggaan setelah dilakukan proses pengecatan, sedangkan

bakteri gram positif akan berwarna ungu (Murti dan Sri, 2017).

Langkah yang digunakan dalam pengecatan gram yaitu dimulai dari

pengambilan biakan bakteri dari hasil goresan dan kemudian diratakan di atas kaca

preparat yang terlebih dahulu telah ditetesi dengan aquades steril. Selanjutnya

difiksasi di atas api bunsen kemudian ditetesi dengan zat warna kristal violet

sebagai cat dasar selama 2 menit kemudian preparat dibilas menggunakan air

mengalir. Setelah itu ditetesi dengan larutan lugol sebagai cat penguat kemudian

ditunggu selama 1 menit kemudian dibilas dengan air mengalir. Kemudian ditetesi

ethanol sebagai cat peluntur dan didiamkan selama 15 detik kemudian dibilas

dengan air mengalir. Setelah itu ditetesi dengan air fuchsin sebagai cat penutup

kemudian dibiarkan selama 1½ menit dan dibilas menggunakan air mengalir.

Selanjutnya preparat dikering udara kemudian setelah preparat kering, preparat

ditetesi dengan imersion oil agar preparat yang diamati di bawah mikroskop lebih
terang dengan perbesaran 100x (Juwaidin, 2018).

Bakteri gram-positif ditandai dengan sel warna ungu sedangkan gram-negatif

berwarna merah atau jingga, gram bakteri juga dijustifikasi dengan ada tidaknya

lendir saat ditetesi KOH 3%. Identitas bakteri antagonis merupakan spesies sama jika

kemiripan ≥99%, mempunyai kesamaan genus jika kemiripan ≥95%-<99%, dan

kesamaan famili jika kemiripan <95% (Prabawati et al., 2019).

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel

bakteri sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan

penambahan larutan pencuci. Kristal violet atau ungu gentian adalah pewarna

triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologist noda dalam metode gram

klasifikasi bakteri. Sedangkan, pemberian iodium bertujuan untuk memperkuat

warna pada bakteri. Alkohol berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada

bakteri. Safranin adalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi.

Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan, pada

bakeri di preparat menunjukkan warna ungu yang berarti adalah bakteri gram positif

dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah

berikatan dengan safranin (Febrianti et al., 2019.)

Pengujian KOH pada bakteri juga untuk mengetahui jenis bakteri tergolong

bakteri Gram positif atau negatif dapat dilakukan dengan mencampurkan bakteri

dengan larutan KOH dan akan diketahui perbedaan yang mendasar antara bakteri

Gram positif dan negative yaitu apabila terbentuk lendir, maka menunjukkan bahwa

bakteri tersebut adalah bakteri Gram negatif, sedangkan apabila tidak terbentuk

lendir maka bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram positif (Hadiotomo,

2010).
 Pengujian reaksi dengan KOH yakni biakan murni bakteri antagonis yang

berumur 24 jam disuspensikan diatas gelas objek yang sebelumnya telah ditetesi

dengan KOH 3 %., kemudian diaduk menggunakan jarum ose. Suspensi bakteri

yang membentuk lendir menunjukkan bakteri termasuk Gram negatif. Apabila

suspensi tidak terangkat dengan jarum ose atau encer, menunjukkan bakteri Gram

positif (Arriani, 2019).

III. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

 Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu, 30 Oktober 2019 pukul 08.00

WITA sampai selesai, di Laboratorium Proteksi Tanaman Unit Pendidikan Fakultas

Pertanian Universitas Halu Oleo.

3.2 . Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikun kali ini, yaitu lampu bunsen, jarum ose,

kaca benda, dan pipet tetes dan mikroskop.

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu biakan murni, zat warna dan

larutan KOH 3%.

3.3. Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan pada praktikum ini adalah sebagai berikut:

A. Pewarnaan Sederhana

1. Membuat olesan bakteri pada kaca benda.

2. Difiksasi.

3. Memberi zat warna utama yaitu amonium oksalat kristal violet (berupa larutan)

selama 1-2 menit, mencuci dengan air mengalir.

4. Memberi mordan yaitularutan yodium selama 1-2 menit, mencuci dengan air

mengalir.

5. Meneteskan larutan alkohol aseton sedikit demi sedikit, sehingga larutan yang

mengalir tadi berwarna menjadi tidak berwarna.

6. Meneteskan zat warna penutup yaitularutan berwarna merah atau karbol selama

2-3 menit.

7. Mencuci dengan air mengalir, kemudian mengering anginkan.

8. Mengamati dibawah mikroskop dengan minyak inersi.

 9. Menggambar bentuk bakteri dan warnanya.

B. Pengujian KOH

1. Mengambil satu ose biakan bakteri Bacillus dan dicampurkan dengan 2 tetes

larutan KOH 3 %, di atas gelas obyek.

2. Mengaduk secara merata dengan jarum ose, menarik jarum ose keatas gelas

obyek dan mengamati pembentukan lendir. Jika terbentuk lendir

mengindikasikan bakteri Gram-negative. Jika tidak berlendir mengindikasikan

bakteri Gram-positif.

3. Melakukan hal yang sama (prosdur 1 dan 2) untuk isolat-isolat bakteri lainya.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Hasil pengamatan pada Praktikum kali ini dapat dilihat pada tabel di bawah.
a. Pengecetan Gram

Kode Isolat Reaksi Gram Gambar Sel Keterangan

Daun padi(10-4 Gram negatif Berwarna merah

b. Pengujian KOH

Kode Isolat Gambar Keterangan

Daun padi(10-4) Berlendir

4.2. Pembahasan

Menentukan gram suatu bakteri dapat dilakukan dengan uji KOH, dalam

praktikum pengecetan gram dan pengujian KOH pada bakteri, langkah-langkah yang

dilakukan untuk uji gram yaitu pertama-tama, mengambil satu ose biakan bakteri dan

mencampurkan dengan 2 tetes larutan KOH 3%, di atas gelas objek, kemudian

mengaduk secara merata dengan jarum ose, dan menarik jarum ose ke atas gelas

objek dan mengamati pembentukan lendir. Jika suspensi (campuran bakteri dengan

KOH) menjadi berlendir maka dinyatakan sebagai gram negatif, jika tidak   tampak

seperti lendir maka dinyatakan sebagai gram positif.

Berdasarkan praktikum “Pengecetan Gram dan pengujian KOH Bakteri”,

maka dapat diketahui bahwa Penentuan bakteri Gram positif dan negatif dapat
dilakukan dengan pengecetan gram dan pengujian KOH. Pengujian dengan

pengecetan gram ini dapat diketahui perbedaan yang mendasar antara bakteri Gram

positif dan negatif yaitu dari warnanya apabila berwarna ungu maka menunjukkan

bakteri Gram positif. Bakteri Gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat

warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna biru

atau ungu di bawah mikroskop. Sedangkan, jika berwarna merah, kuning atau jingga

mmaka menunjukkan bakteri gram negatif. Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang

dinding selnya menyerap warna merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang

tipis. Lapisan peptidoglikan pada bakteri Gram negatif terletak di ruang periplasmik

antara membran plasma dengan membran luar. Cara lain yang dapat dilakukan yaitu

dengan pengujian KOH apabila terbentuk lendir, maka menunjukkan bahwa bakteri

tersebut adalah bakteri Gram negatif, sedangkan apabila tidak terbentuk lendir maka

bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram positif.

Berdasarkan hasil dari praktikum pengecetan Gram dan pengujian KOH

diketahui pada pengecetan Gram menggunakan isolat daun padi (10-4) , reaksi Gram

nya yaitu Gram negatif karena berwarna merah dan bentuk sel yang terbentuk pada

pengecetan gram ini yaitu tipis. Bakteri Gram negatif ini dinding selnya menyerap

warna merah, dan memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Lapisan peptidoglikan

pada bakteri Gram negatif terletak di ruang periplasmik antara membran plasma

dengan membran luar. Pada pengujian KOH menggunakan isolat daun padi (10-4)

didapatkan hasil yaitu berlendir hal ini menunjukkan bakteri tersebut adalah bakteri

Gram negatif. Pembetukan lendir terjadi karena robeknya selaput pada bakteri yang

di kenal dengan lisis dan menghasilkan bakteri.

 V. PENUTUP

5.1. Kesimpulan

Kesimpulan pada praktikum ini yaitu penentuan bakteri Gram positif dan

negatif dapat dilakukan dengan pengecetan gram dan pengujian KOH. Pengujian

dengan cara pengecetan gram dapat diketahui perbedaan yang mendasar antara
bakteri Gram positif dan negatif yaitu dari warnanya apabila berwarna ungu maka

menunjukkan bakteri Gram positif, dan jika berwarna merah menunjukkan bakteri

Gram negatif. Sedangkan, pada pengujian KOH apabila terbentuk lendir, maka

menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Gram negatif, sedangkan apabila

tidak terbentuk lendir maka bakteri tersebut tergolong dalam bakteri Gram positif.

Berdasarkan hasil pada pengamatan dapat diketahui bahwa pada isolat yang diamati

yaitu isolat daun padi (10-4) pada pengecetan Gram diketahui bakteri yang terbentuk

adalah bakteri Gram negatif karena berwarna merah dan berbentuk tipis, sedangkan

pada pengujian KOH bakteri yang terbentuk juga bakteri Gram negatif karena

berlendir.

5.2. Saran

Saran saya dalam praktikum kali ini yaitu agar praktikum dapat dilaksanakan

tepat sesuai dengan waktu yang telah ditentukan agar praktikum dapat berjalan

dengan baik dan semua prosedur kerja dalam praktikum dapat dilaksanakan

seluruhnya.

DAFTAR PUSTAKA

Arisandi A, Badrud T, Raini Y. 2017. Jumlah Koloni pada Media Kultur Bakteri
yang Berasal dari Thallus dan Perairan Sentra Budidaya Kappaphycus
Alvarezii di Sumenep. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 9( 1): 57-64.

Arriani IF, Luqman QA, Restu RK. 2019. Pemanfaatan Bakteri Antagonis Lumpur
Sidoarjo untuk Menekan Sclerotium rolfsii Sacc. Penyebab Penyakit Rebah
Semai pada Tanaman Kedelai. Jurnal Viabel Pertanian. 13(1): 11-20.
Febrianti DR, Eka K, Via O. 2019. Potensi Kombinasi Ekstrak Daun Belimbing
Wuluh (Averrhoa Bilimbi L.) dengan Amoksisilin terhadap Staphylococcus
Aureus. Borneo Journal Of Phamascientech. 3(1): 94-100.

Hadiotomo, Ratna S.  2010.  Praktikum Mikrobiologi Dasar. Jakarta. Gramedia.

Juwaidin. 2018. Uji Potensi Bakteri Bacillus Amyloliquefaciens Subsp. Plantarum

sebagai Kandidat Probiotik pada Unggas. Skripsi. Fakultas Peternakan,
Universitas Mataram. Mataram.

Murti NIK dan Ni Nyoman Sri B. 2017. Prevalensi Salmonella Sp. pada Cilok di
Sekolah Dasar di Denpasar. E-Jurnal Medika. 6 (5): 30-41.

Prabawati A, Ari S, Sugiarto. 2019. Bakteri filosfer padi sebagai kandidat agen
biokontrol terhadap Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) penyebab
penyakit hawar daun bakteri