VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR

PIPERIN DALAM EKSTRAK PIPER NIGRUM LINN.

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh:
Christin Nesia Sukma Wijayanti
NIM : 168114018

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019

i
 VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
PIPERIN DALAM EKSTRAK PIPER NIGRUM LINN.

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi

Oleh:
Christin Nesia Sukma Wijayanti
NIM : 168114039

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019

ii
 Persetujuan Pembimbing

VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
PIPERIN DALAM EKSTRAK PIPER NIGRUM LINN.

Skripsi yang diajukan oleh:

Christin Nesia Sukma Wijayanti
NIM : 168114039

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Dr. Christine Patramurti, Apt. tanggal 4 November 2019

Pengesahan Skripsi Berjudul

VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
PIPERIN DALAM EKSTRAK PIPER NIGRUM LINN.

iii
 Oleh:
Christin Nesia Sukma Wijayanti
NIM : 168114039

Dipertahankan di hadapan Pantia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 22 November 2019

Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan

Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.

Panitia Penguji: Tanda tangan

1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ….……................

2. Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. ……………….....

3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ………………….

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana
layaknya karya ilmiah.

iv
 Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiatisme dalam naskah
saya, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 4 November 2019

Penulis

Christin Nesia Sukma Wijayanti

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Christin Nesia Sukma Wijayanti
Nomor Mahasiswa :168114039
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjusul:

VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
PIPERIN DALAM EKSTRAK PIPER NIGRUM LINN.

v
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan
data, medistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya
sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 4 November 2019
Yang menyatakan

(Christin Nesia Sukma Wijayanti)

vi
 ABSTRAK
Dewasa ini di Indonesia banyak dilakukan pengembangan obat tradisional
yang berbahan dasar tanaman obat menjadi fitofarmaka. Salah satunya adalah
ekstrak buah lada hitam atau Piper nigrum Linn. dengan kandungan utamanya
adalah piperin. Piperin diketahui mempunyai banyak aktivitas farmakologi seperti
hepatoprotektan, antidiare, antipiretik dan anti-inflamasi.
Dalam pengembangan obat tradisional menjadi fitofarmaka perlu
dilakukan serangkaian uji kuantitatif dan kualitatif untuk menjamin kebenaran
komposisi, keseragaman komponen aktif dan keamanannya baik secara kualitatif
maupun secara kuantitatif. Maka dari itu, diperlukan suatu metode yang optimal
dan tervalidasi untuk mengetahui kadar piperin yang terkandung dalam ekstrak
Piper nigrum Linn.
Pada penelitian ini, dilakukan validasi metode analisis piperin dalam
ekstrak Piper nigrum Linn. menggunakan KCKT fase terbalik dengan fase gerak
asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v), fase diam oktadesilsilan (C18), serta laju alir
1,0 mL/menit. Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi parameter selektivitas,
linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang diuji memiliki
koefisien korelasi 0,9985 (≥ 0,998) dan nilai resolusi 1,588 (≥ 1,5). Selain itu,
nilai perolehan kembali bernilai 100,33% (di dalam 85% - 110%) dan CV bernilai
0,019%; 0,00289%; 0,00362% (≤ 15%). Metode yang diuji realibel sehingga
dapat digunakan untuk menetapkan kadar piperin dalam ekstrak Piper nigrum
Linn..

Kata Kunci: Validasi, KCKT, Piperin, Ekstrak Piper nigrum Linn.

vii
 ABSTRACT

In the process of meeting the clinical trial requirements of a natural

material product into a phytopharmaca product, a reliable analysis method is
needed and is able to meet the needs of the standardization process for the raw
material to be made of a phytopharmaca product. The process of standardization
of turmeric rhizome extract raw materials requires optimum and valid analytical
methods to determine curcumin levels in turmeric rhizome extract. Curcuminoids
in turmeric rhizome extract which has three forms of compounds namely
curcumin, demetoksipiperin and bis-demetoksipiperin, so that analytical methods
with high selectivity and sensitivity are needed. Therefore, the method of
curcumin analysis in a reliable turmeric rhizome extract needs to be established.
Curcumin analysis method in turmeric extract using KCKT has been optimized in
previous studies.
In this study, the method of analysis of curcumin in turmeric rhizome
extract was validated using reverse phase KCKT with the mobile phase of
acetonitrile:methanol:water (65:5:30 v/v), octadesilsilan (C-18) stationary phase,
and flow rate 1 , 0 mL / minute. This study aims to validate the parameters of
selectivity, linearity, range, accuracy, and precision.
The results showed that the method tested had a correlation coefficient of
0.999 (≥ 0.998) and a resolution value of 1.588 (≥ 1.5). In addition, the value of
recovery is worth 100.33% (in 85% - 110%) and CV is 0.019%; 0.00289%;
0.00362% (≤ 15%). The method is tested reliably so that it can be used to
determine curcumin levels in turmeric rhizome extract.

Keywords: Validation, KCKT, Piperine, Extract Piper nigrum Linn.

viii
 HALAMAN PERSEMBAHAN

Successful and unsuccessful people do not vary greatly in their abilities. They
vary in their desires to reach their potential.
-John Maxwell-

Sembah dan sujud syukur saya persembahkan kepada Tuhan Yesus Kristus dan
Bunda Maria serta Para malaikat dan Roh Kudus
Dengan in saya mempersembahkan karya ini untuk
Bapak, Ibu serta Kakak dan Adik saya yang telah mencintai dan mendukung saya
Setiap guru dan dosen, yang dengan sabar mendidik saya selama ini
Teman-teman yang selalu mendukung, merajut memori setiap harinya, tawa yang
setiap hari kita miliki, dan solidaritas yang luar biasa
Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat saya menimba
ilmu selama ini melalui pembelajaran kontekstual dan aplikatif.

ix
 PRAKATA

Puji syukur saya haturkan kepada Tuhan Yesus Kristus, Bunda Maria
serta Para malaikat dan Roh Kudus atas berkat dan penyertaan dari awal proses
penyusunan proposal skripsi, pengambilan data skripsi sampai tahap akhir
penelitian sehingga naskah skripsi berjudul Validasi Metode Analisis High
Performance Liquid Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar
Piperin Dalam Ekstrak Piper nigrum Linn. dapat selesai.
Selama proses penyusunan dan penyelesaian naskah skripsi, penulis
menerima banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,
penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada :
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang
selalu mencintai, mendukung dan membimbing kami dengan sabar selama
proses penyusunan skripsi.
3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik dan
dosen penguji yang selalu memberikan masukan, pendampingan, dan kritik
yang membangun.
4. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm.,Apt., selaku dosen penguji yang
senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun.
5. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma), Bapak Bimo (Laboran Laboratorium Analisis
Pusat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan Bapak Kayat
(Laboran Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma) yang telah membantu dan memfasilitasi kegiatan penelitian di
laboratorium.
6. Keluarga saya, bapak, ibu, Mas Gandhi dan Dik Amel yang selalu mendukung
dan menyemangati saya.

x
7. Rekan penelitian Maria Philomia Christanti Raga, Sinta Susanti, dan Yosua
yang selalu menemani, mendukung, solid dalam suka-duka, dan atas kerja
sama selama proses penelitian.
8. Mia, Amanda, Prima, Amel, Puput, Selin, Jessica, Porok, Pungki, Sekar, Tita,
Lintang, Fosicol, FSMA 2016 dan Explosive SMASA 54
9. Pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa masih
terdapat banyak kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu, penulis sangat
terbuka terhadap segala masukan, saran dan kritik yang membangun agar naskah
skripsi ini dapat menjadi lebih baik dan bermanfaat. Akhir kata, semoga naskah
skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, 4 November 2019

Penulis

xi
 DAFTAR ISI
Halama
n

HALAMAN JUDUL……………………………………………..….. i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………... ii
… iii
HALAMAN PENGESAHAN……………………………………….. iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………... v
PERNYATAAN PERSETUJUAN vi
PUBLIKASI……………………. vii
ABSTRAK…………………………………………………………... vii
ABSTRACT…………………………………………………………... ix
HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………...
PRAKATA…………………………………………………………...
DAFTAR ISI………………………………………………………… xi
DAFTAR TABEL.....………………………………………………... xii
DAFTAR xiii
GAMBAR…………………………………………………
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………….... xiv
PENDAHULUAN…………………………………………………… 1
METODE PENELITIAN…………….……………..…….................. 2
HASIL DAN PEMBAHASAN……..…...…………...……………… 7
KESIMPULAN………..….…………...……………………….……. 15
SARAN………………….....….. 15
………………………......................
DAFTAR PUSTAKA………………...…... 16
………………………….
LAMPIRAN…………….…..…………...…………….…………….. 18
BIOGRAFI PENULIS……………………………………………….. 36

xii
 DAFTAR TABEL

Halaman
Tabel I. Data resolusi senyawa piperin dalam ekstrak Piper
nigrum Linn. konsentrasi 0,05 9
µg/mL…………………………..
Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi
baku piperin ………………...…..………………......... 11
Tabel III. Data rentang………………………………...…………… 13
Tabel IV. Data perolehan kembali dan presisi piperin………. 14

xiii
 DAFTAR GAMBAR

Halaman
Gambar 1. Kromatogram ekstrak Piper nigrum Linn. konsentrasi
0,05 µg/mL 9
………………………………………………… 11
Gambar 2. Kurva baku piperin……………………………….... 11
Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku piperin……….... 12
Gambar 4. Stacking kromatogram rentang………………………...
Gambar 4. Kromatogram ekstrak piperin 0,5
µg/ml…………………

xiv
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku piperin……… 18
Lampiran 2. Kromatogram 30
recovery………………………………... 34
Lampiran 3. Data AUC recovery dan
presisi………………………...

xv
PENDAHULUAN
Dewasa ini di Indonesia banyak dilakukan pengembangan obat
tradisional yang berbahan dasar tanaman obat, salah satu tanaman obat yang
banyak dikembangkan adalah buah lada hitam atau Piper nigrum Linn. Buah lada
hitam (Piper nigrum Linn.) termasuk dalam keluarga Piperaceae dengan
kandungan utamanya adalah piperin. Piperin diketahui mempunyai banyak
aktivitas farmakologi seperti hepatoprotektan, antidiare, antipiretik dan anti-
inflamasi (Ahmad, N., et al., 2012). Selain itu piperin juga diketahui dapat
meningkatkan biaoavailibilitas dan aktivitas antidiabetik apabila dikombinasikan
dengan kurkumin. (Prasad et al., 2014 dan Kaur, Ginpreet, et al., 2016).
Pemerintah saat ini juga mendorong perkembangan obat tradisional
menjadi obat herbal terstandar bahkan menjadi fitofarmaka. Hal ini bertujuan
untuk memberi ruang yang Seluas-luasnya bagi pengembangan produk untuk
menghasilkan inovasi-inovasi baru, namun di lain sisi produk-produk baru ini
juga harus dapat dipastikan keseragaman komponennya, keamanannya, khasiatnya
dan manfaatnya. Sebelum dinyatakan menjadi obat herbal tersatandar bahan baku
obat tradisional harus terstandarisasi terlebih dahulu dan lolos dalam uji klinik
(BPOM, 2014). Maka diperlukan suatu metode yang umum dan tervalidasi untuk
menganalisis piperin yang terkandung dalam ekstrak Piper nigrumLinn.
Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya menunjukan bahwa
analisis piperin dapat dilakukan menggunakan metode spektrofotometri,
kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatrografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase
terbalik. Chauhan, et al. pada tahun 1998 telah melakukan analisis piperin yang
terkandung dalam ekstrak Piper nigrum Linn. menggunakan metode
spektrofotometri, sementara itu Kanaki et al. pada tahun 2008 telah melakukan
analisis piperin yang terkandung dalam ekstrak Piper nigrum Linn. dengan
metode kromatografi lapis tipis. Penelitian mengenai analisis piperin yang
terkandung dalam ekstrak Piper Nigrum Linn. dengan etode KCKT juga telah
banyak dilakukan beberapa diantaranya yaitu Khismatrao, A., et al., 2018; Sethi,
et al., 2013; Ang et al.,2014; Jangle dan Thorat, 2013. Pada penelitian ini, penulis
mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Upadhay, V., et al., 2013 dengan

1
fase gerak yang sudah dioptimasi pada penelitian sebelumnya dan fase diam
menggunakan oktadesil silan (C18).
Penggunaan metode KCKT ini dengan alasan metode ini digunakan
secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam sejumlah bidang
serta KCKT merupakan suatu metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan
baik untuk analisis kuantitatif maupun kualitatif dan mempunyai kecepatan dan
kepekaan analisis yang tinggi. (Gandjar dan Rohman, 2007)
Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian penetapan kadar piperin
dalam ekstrak Piper nigrum Linn. menggunakan metode KCKT fase terbalik yang
terdiri dari tahap optimasi dan validasi. Penulis akan melakukan validasi terhadap
metode tersebut. Validasi metode analisis yang dilakukan oleh peneliti bertujuan
untuk mendapatkan metode yang sahih dari instrumen KCKT untuk memisahkan
piperin terhadap senyawa lain yang terdapat dalam ekstrak Piper nigrum Linn.
Validasi yang dilakukan meliputi selektivitas, akurasi, presisi dan kurva kalibrasi
(AOAC, 2019).

METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro
analysis, meliputi ekstrak Piper nigrum Linn., baku piperin (E. Merck), metanol
(E. Merck), dan asetonitril (E. Merck). Bahan lain yang tidak memiliki kualitas
pro analysis meliputi aquabidestilata. Bahan lainnya diperoleh dari Laboratorium
Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat KCKT
merk Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom C-18
(Knaurer) dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm ; Spektrofotometer
UV-1800 (Shimadzu); seperangkat komputer (Dell B6RDZIS Connexant system
RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S); printer (HP Deskjet 1000 J110a);
ultrasonikator (RETSCH); neraca analitis (Scaltec) dengan kapasitas timbang
maksimal 60/210 g minimal 0,001 g dan d = 0,01/0,1 mg; jarum suntik (Terumo);

2
syringe filter 0,45 µm (Ministar®); pompa vakum; whatman membrane filter
dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan diameter sebesar 47 mm; corong
buchner; mikropipet (Socorex); dan peralatan-peralatan yang biasa digunakan di
dalam laboratorium analisis farmasi.
Tata Cara Penelitian
Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak terbuat dari asetonitril, metanol dan air dengan perbandingan
yang didapat pada saat optimasi metode. Setiap komponen disaring dengan
menggunakan kertas saring whatman pada corong buchner, dibantu dengan
pompa vakum, kemudian diawaudarakan selama 15 menit dengan ultrasonikator.
Pencampuran komponen fase gerak dilakukan di dalam instrumen KCKT.
Pembuatan Larutan Baku Piperin
Pembuatan Larutan Stok Piperin 1000 µg/mL
Sebanyak kurang lebih 1,0 mg baku piperin yang ditimbang seksama
dilarutkan dalam mikrotube dengan metanol sampai tanda batas 1 ml sehingga
diperoleh larutan stok piperin 1000 µg/mL.
Pembuatan Larutan Intermediet Baku Piperin 100 µg/mL
Sebanyak 100 µL larutan stok baku piperin 1000 µg/mL diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 ml
sehingga diperoleh larutan intermediet baku piperin 100 µg/mL.
Pembuatan Larutan Intermediet Baku Piperin 10 µg/mL
Sebanyak 100 µL larutan intermediet baku piperin 100 µg/mL diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 ml
sehingga diperoleh larutan intermediet baku piperin 10 µg/mL.
Pembuatan Seri Larutan Baku Piperin
Pembuatan Seri Larutan Baku Piperin (konsentrasi 40; 35; 30; 25; 20; 15;
dan 10 µg/mL)
Sebanyak 400 µL; 350 µL; 300 µL; 250 µL; 200 µL; 150 µL; 100 µL
larutan intermediet baku piperin 100 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam
mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml

3
sehingga diperoleh seri larutan baku piperin dengan konsentrasi 40 µg/mL; 35
µg/mL; 30 µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; dan 10 µg/mL.
Pembuatan Seri Larutan Baku Piperin (konsentrasi 5,0; 2,5; 1,0; 0,5; 0,1;
dan 0,05 µg/mL)
Sebanyak 500 µL; 250 µL; 100 µL; 50 µL; 10 µL; 5 µL larutan
intermediet baku piperin 10 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam mikrotube,
kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml sehingga diperoleh
seri larutan baku piperin dengan konsentrasi 5,0 µg/mL; 2,5 µg/mL; 1,0 µg/mL;
0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL.
Preparasi Larutan Ekstrak Piper nigrum Linn.
Ditimbang kurang lebih seksama 10 mg ekstrak Piper nigrum Linn.,
kemudian dilarutkan dalam labu takar 10,0 mL dengan metanol hingga tanda
batas sehingga diperoleh larutan ekstrak Piper nigrum Linn. dengan konsentrasi
1000 µg/mL. Sebanyak 1,0 mL larutan larutan ekstrak Piper nigrum Linn.
konsentrasi 1000 µg/mL diambil kemudian dilarutkan dengan menggunakan
metanol dalam labu takar 10,0 mL sampai tanda batas sehingga diperoleh larutan
ekstrak Piper nigrum Linn. dengan konsentrasi 100 µg/mL. Sebanyak 100 µL
larutan ekstrak Piper nigrum Linn. dengan konsentrasi 100 µg/mL diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda
batas 1 ml sehingga diperoleh larutan larutan ekstrak Piper nigrum Linn. dengan
konsentrasi 10 µg/mL. Sebanyak 50 µL larutan ekstrak Piper nigrum Linn.
dengan konsentrasi 10 µg/mL diambil kemudian dilarutkan dengan menggunakan
metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml sehingga diperoleh larutan
larutan ekstrak Piper nigrum Linn. dengan konsentrasi 0,5 µg/mL.
Validasi Metode Analisis
Selektivitas
Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode untuk dapt memisahkan dan
membedakan analit dari senyawa-senyawa lainnya yang trdapatdalam suatu
matriks
Kurva Baku Piperin

4
 Larutan seri baku piperin dibuat dengan konsentrasi 1 µg/mL; 2,5 µg/mL;
5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL; 25 µg/mL yang telah dibuat disaring
dengan syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan
diinjeksikan ke dalam KCKT fase terbalik dengan sistem fase gerak yang sudah
dioptimasi pada penelitian sebelumnya. Luas area piperin (AUC) akan
ditunjukkan oleh kromatogram. Kurva baku diperoleh dengan memplotkan luas
area piperin (AUC)dengan kadar baku piperin.
Linearitas dan Rentang
Larutan seri baku piperin dengan konsentrasi 0,05 µg/mL; 0,1 µg/mL; 0,5
µg/mL; 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL; 25
µg/mL; 30 µg/mL; 35 µg/mL; dan 40 µg/mL yang telah dibuat disaring dengan
syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke
dalam KCKT fase terbalik dengan sistem fase gerak yang sudah dioptimasi pada
penelitian sebelumnya. Pembacaan seri baku piperin dilakukan sebanyak 3 kali
replikasi.
Akurasi dan Presisi
Larutan ekstrak Piper nigrum Linn. dan larutan ekstrak Piper nigrum
Linn. yang diadisi dengan baku piperin disiapkan. Larutan sampel adisi baku
piperin dibuat dengan menambahkan baku piperin dengan 3 tingkatan konsentrasi
yang berbeda. Pada sampel pertama, ekstrak Piper nigrum Linn diadisi dengan
baku piperin 1 µg/mL, pada sampel kedua ekstrak Piper nigrum Linn diadisi
dengan baku piperin 10 µg/mL, dan pada sampel ketiga ekstrak Piper nigrum
Linn diadisi dengan baku piperin 20 µg/mL. Larutan ekstrak Piper nigrum Linn.
dan larutan ekstrak Piper nigrum Linn. yang diadisikan baku piperin yang telah
dibuat disaring dengan syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap
larutan diinjeksikan ke dalam KCKT fase terbalik dengan sistem fase gerak yang
sudah dioptimasi pada penelitian sebelumnya. Replikasi dilakukan sebanyak 3
kali untuk setiap tingkatan konsentrasi tersebut, kemudian nilai recovery dan
koefisien variasi dapat dihitung.
Analisis Hasil
Selektivitas

5
 Selektivitas suatu metode analisis ditentukan melalui nilai resolusi yang
didapat. Setelah melalui pembacaan kromatogram, nilai waktu retensi dan luas
area akan diperoleh Metode analisis yang diuji dikatakan selektif apabila memiliki
nilai resolusi ≥ 1,5.
Linearitas dan Rentang
Nilai koefisien korelasi (r) merupakan nilai yang menentukan linearitas
suatu metode. Koefisien korelasi diperoleh dari plot perbandingan AUC baku
piperin terhadap konsentrasi baku piperin. Koefisien korelasi yang didapat
dibandingkan dengan syarat nilai koefisien korelasi yang baik. Metode analisis
dikatakan linear apabila memenuhi syarat tersebut. Rentang diperoleh dengan
melakukan penambahan 3 konsentrasi di atas titik tertinggi kurva baku dan 3
konsentrasi dibawah titik terendah kurva baku. Nilai koefisien determinasi (r2)
didapat dari pengkuadratan koefisien korelasi rentang baku piperin dengan
konsentrasi 0,05 µg/mL-40 µg/mL. Rentang yang baik memiliki nilai koefisien
determinasi mendekati 1,0 menunjukkan metode analisis mampu memastikan
kadar piperin dalam analit tidak mengalami ekstrapolasi.
Akurasi dan Presisi
Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan kembali. Nilai
tersebut dapat diperoleh dengan membandingkan konsentrasi sampel yang
didapat dengan konsentrasi analit sebenarnya melalui rumus perolehan kembali.
Nilai perolehan kembali yang didapat kemudian dibandingkan dengan syarat
nilai perolehan kembali yang baik. Presisi suatu metode ditunjukkan dengan nilai
koefisien variasi. Kriteria penerimaan parameter presisi yang didapat pada setiap
tingkatan konsentrasi adalah koefisien variasi (CV) tidak melebihi 4% untuk
kadar yang berada dalam kurva baku. Nilai koefisien variasi yang didapat
kemudian dibandingkan dengan syarat koefisien variasi yang dapat diterima
sesuai dengan jumlah kadar analit. Suatu metode dikatakan presisi, apabila
koefisien variasi suatu metode memenuhi syarat tersebut.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi metode analisis piperin dalam ekstrak Piper nigrum Linn.
dilakukan dengan menggunakan kolom C18; perbandingan fase gerak

6
asetonitril:metanol:air sebesar 65:5:30; laju alir 1,0 mL/menit; pembacaan pada
panjang gelombang 353 nm; volume injeksi 20 µL; dan waktu pembacaan selama
10 menit. Seluruh prosedur tersebut telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya
dengan nilai tailing factor sebesar 1,255; resolusi pada konsentrasi 0,5 µg/mL
sebesar 3,698; dan waktu retensi sebesar 7,499. Parameter yang divalidasi dalam
penelitian ini meliputi linearitas, rentang, selektivitas, akurasi, dan presisi.
Penentuan Selektivitas
Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode untuk membedakan
antara analit dengan senyawa-senyawa lain yang terdapat dalam suatu matriks.
Nilai selektivitas dapat dilihat dari nilai resolusi peak senyawa yang hendak
dianalisis. Daya resolusi bernilai paling tidak 1,5 untuk analisis kuantitatif suatu
senyawa (Günzler dan Williams, 2008). Keterpisahan senyawa piperin dalam
ekstrak Piper nigrum Linn. konsentrasi 0,05 µg/mL dengan peak yang berada
disebelahnya dapat dilihat pada kromatogram Gambar 1. Data resolusi senyawa
piperin dalam ekstrak Piper nigrum Linn. konsentrasi 0,05 µg/mL disajikan dalam
Tabel I. Daya resolusi rata – rata senyawa piperin dalam ekstrak piperin
konsentrasi 0,05 µg/mL bernilai sebesar 3,460. Metode memiliki nilai resolusi
lebih dari 1,5 sehingga metode yang diuji memenuhi parameter selektivitas.
Gambar 1. Kromatogram ekstrak Piper nigrum Linn. konsentrasi 0,05 µg/mL
Tabel I. Data resolusi senyawa piperin dalam ekstrak Piper nigrum Linn.
konsentrasi 0,05 µg/mL
Konsentrasi Resolusi Rata-rata
(µg/mL) Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 Resolusi
0,05 µg/mL 3,324 3.534 3,524 3,460

Penentuan Kurva Baku

Kurva baku atau kurva kaliberasi merupakan kurva yang menunjukkan
hubungan antara respon instrument dengan konsentrasi analit dengan beberapa
seri baku. Pembuatan kurva baku pada penelitian ini menggunakan seri
konsentrasi baku piperin 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20
µg/mL; dan 25 µg/mL.
Pada penelitian ini digunakan KCKT sehingga respon yang didapat
adalah dalam bentuk AUC (Area Under Curve). Kurva baku ini akan digunakan

7
untuk analisis secara kuantitatif dimana nantinya dari kurva baku ini akan didapat
regresi linear y = bx + a, y menunjukan respon (AUC), a merupakan intersep dan
b adalah slope. Setelah mendapatkan regresi linear selanjutnya akan didapatkan
nilai r (koefisien korelasi) yang menunjukan linearitas dari suatu metode, dengan
kriteria nilai r 0,998 (Kazakevich dan LoBrutto, 2007). Pada penelitian ini
dilakukan 3 kali replikasi dengan data sebagai berikut
Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi baku piperin
Konsentrasi Replikasi I Replikasi II Replikassi III
AUC AUC AUC
25 ppm 3,038,238 3,142,162 3,139,920
20 ppm 2,561,339 2,780,515 2,559,965
15 ppm 2,019,443 2,220,194 2,098,109
10 ppm 1,362,587 1,368,808 1,365,288
5 ppm 647,174 549,156 649,363
2,5 ppm 395,011 422,051 396,722
1 ppm 204,936 197,217 196,619
Koefisien korelasi 0,9985 0,9934 0,99812

Dari data tiga replikasi seri konsentrasi baku piperin yang disajikan pada
Tabel II, seri konsentrasi kurva baku yang digunakan adalah seri kurva baku
dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0, yaitu seri konsentrasi kurva
baku replikasi perama dengan nilai koefisien korelasi 0,9982. Kurva baku yang
digunakan memiliki nilai koefisien korelasi lebih dari 0,998 sehingga kurva baku
bersifat linear. Persamaan yang didapatkan dari seri konsentrasi baku piperin
replikasi ketiga adalah y = 121174,0149x + 102366,8324. Kadar piperin (x)
didapat dengan memasukkan nilai AUC ke dalam y pada persamaan.

Gambar 2. Kurva baku piperin

Dari gambar 2 dapat dilihat bahwa adanya hubungan yang prposional antara konsentrasi seri
baku dengan respon (AUC).

Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku piperin

8
Linearitas dan Rentang
Linearitas suatu metode dapat dilihat melalui kurva kaliberasi yang
menunjukkan hubungan respon instrumen dengan konsentrasi anali (Harvey,
2000). Dari hasil penelitian didapat hasil koefisien korelasi (r) adalah 0,9982
sehingga dapat disimpulkan bahwa metode ini mempunyai linearitas yang baik.
Rentang merupakan batas terendah dan tertinggi dari kurva baku dimana metode
masih memenuhi persyaratan validasi. Rentang kurva baku diperoleh dengan
menambahkan tiga seri konsentrasi di atas titik tertinggi kurva baku dan tiga
konsentrasi di bawah titik terendah dari seri konsentrasi baku yang telah
ditetapkan. Tujuan dari dibuatnya rentang kurva baku adalah untuk memastikan
respon instrumen terhadap analit yang berada di luar kurva tetap berada dalam
rentang yang ditetapkan dan kadar piperin dalam analit tidak mengalami
ekstrapolasi. Pada penelitian ini, seri konsentrasi baku 0,05 µg/mL; 0,1 ng/mL;
0,5 µg/mL; 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL; 25
µg/mL; 30 µg/mL; 35 µg/mL; dan 40 µg/mL digunakan sebagai rentang. Data
ketiga replikasi rentang dapat dilihat pada Tabel III.
Tabel III. Data rentang
Konsentrasi Replikasi I Replikasi II Replikasi III
40 ppm 9071762 11,731,031 9,071,762
35 ppm 4,255,539 4,192,141 4,747,157
30 ppm 3,755,142 3,988,619 3,703,531
25 ppm 3,038,238 3,142,162 3,139,920
20 ppm 2,561,339 2,780,515 2,559,965
15 ppm 2,019,443 2,220,194 2,098,109
10 ppm 1,362,587 1,368,808 1,365,288
5 ppm 678152 549,156 649,363
2,5 ppm 417999 422,051 396,722
1 ppm 235562 197,217 196,619
0,5 ppm 159004 134375 136,106
0,1 ppm 42862 39,558 40,028
0,05 ppm 39446 34,769 37,812
Koefisien 0,9248 0,8747 0,9357
determinasi

Dari data tiga replikasi rentang yang disajikan pada Tabel III, digunakan
rentang replikasi pertama dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0.
Dari data rentang replikasi pertama diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar
0,9982 dan koefisien determinasi (r2) sebesar 0,9248. Data hasil penelitian

9
menunjukkan metode memiliki koefisien korelasi ≥ 0,998 (0,9982) dan koefisien
determinasi mendekati nilai 1,0, yaitu sebesar 0,9248 yang berarti peningkatan
konsentrasi piperin mempengaruhi peningkatan AUC piperin sebesar 92,48%.
Peningkatan tersebut dapat diamati secara visual pada Gambar 4. Dengan
demikian, dapat disimpulkan bahwa metode analisis piperin yang diuji bersifat
linear serta peningkatan konsentrasi piperin memiliki pengaruh yang signifikan
terhadap peningkatan AUC piperin.

Gambar 4. Stacking kromatogram rentang

Penentuan Perolehan Kembali dan Presisi
Nilai perolehan kembali didapat dengan menggunakan larutan ekstrak
Piper nigrum Linn. dan larutan ekstrak Piper nigrum Linn. yang diadisi baku
piperin. Nilai perolehan kembali ditetapkan dengan paling sedikit tiga konsentrasi
(rendah, sedang, dan tinggi) dan paling sedikit lima kali pengukuran tiap
konsentrasi. dengan penambahan baku piperin. Pada penelitian ini, penambahan
baku piperin dilakukan dengan tiga tingkatan konsentrasi, yaitu 1 µg/mL (rendah),
10 µg/mL (sedang), dan 20 µg/mL (tinggi). Penambahan baku piperin dilakukan
sebanyak tiga replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi.

Tabel IV. Data perolehan kembali piperin

Kadar Baku Kadar Rata-rata

Level Piperin yang Piperin Rata- Perolehan Perolehan
Konsentrasi Ditambahkan Terukur rata Kembali Kembali
(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (%) (%)
Non Adisi 0 0,280
1,386 110,6%
1,410 113%
Adisi 1 1 1,434 1,410 115,40% 113%
(Rendah)
10,274 99,94%
10,342 10,303 100,62% 100,286%
Adisi 2 10 10,310 100,3%
(Sedang)
17,607 86,95%
17,684 87,02% 87,05%
Adisi 3 20 17,716 17,669 87,18%

10
 (Tinggi)

Berdasarkan data perolehan kembali piperin yang disajikan pada Tabel

IV, rata-rata hasil persen perolehan kembali untuk konsentrasi 1 µg/mL (rendah),
10 µg/mL (sedang), dan 20 µg/mL (tinggi) secara berurutan sebesar 113%;
100,286%; dan 87,05%. Nilai persen perolehan kembali yang baik untuk kadar di
bawah 100 ppm adalah 85% - 110% (AOAC, 2019). Dari data hasil persen
perolehan kembali ketiga tingkatan konsentrasi, dapat disimpulkan bahwa metode
analisis piperin yang diuji memenuhi parameter akurasi.
Presisi suatu metode menunjukkan apakah suatu metode analisis dapat
memberikan hasil yang sama ketika diulang. Presisi dinyatakan dengan persen
koefisien korelasi atau CV, dimana nilai yang baik adalah
Tabel IV. Data presisi piperin
Kadar Baku Kadar
Level Piperin yang Piperin Rata- SD CV
Konsentrasi Ditambahkan Terukur rata
(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
Non Adisi 0 0,280
1,386
1,410 0,024 1,702%
Adisi 1 1 1,434 1,410
(Rendah)
10,274
10,342 10,303 0,034 0,33%
Adisi 2 10 10,310
(Sedang)
17,607
17,684 17,669 0,056 0,316%
Adisi 3 20 17,716
(Tinggi)

Berdasarkan AOAC, 2019 suatu metode analisis yang duji dikatakan

memenuhi parameter presisi apabila didapatkan hasil koefisien variasi (CV) tidak
melebihi 4% untuk konsentrasi yang berada dalam kurva baku. Pada penelitian
ini, ketiga tingkatan konsentrasi yang digunakan berada dalam kurva baku
sehingga metode analisis yang diuji dapat dikatakan memenuhi parameter presisi
apabila memiliki nilai koefisien variasi tidak melebihi 4%. Berdasarkan data yang
disajikan pada Tabel V, ketiga tingkatan konsentrasi piperin memilki koeisien

11
variasi di bawah 4% (0,019%; 0,33%; dan 0,316%). Dengan demikian, dapat
disimpulkan bahwa metode analisis piperin yang diuji memenuhi parameter
presisi.
KESIMPULAN
Metode analisis piperin dalam ekstrak Piper nigrum Linn. menggunakan
KCKT fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak asetonitril:metanol:air
(65:5:30 v/v); laju alir 1,0 mL/menit memenuhi parameter validitas linearitas
(r=0,9982), selektivitas (nilai resolusi pada ekatrak Piper nigrum Linn.
konsentrasi 0,05 µg/mL sebesar 13,859), perolehan kembali pada adisi baku
piperin konsentrasi 1 µg/mL (rendah), 10 µg/mL (sedang), dan 20 µg/mL (tinggi)
secara berurutan sebesar 113%; 100,286%; dan 87,05% serta presisi pada
konsentrasi 1 µg/mL; 10 µg/mL; dan 20 µg/mL (0,019%; 0,33%; dan 0,316%)
sehingga metode analisis piperin yang diuji dapat digunakan untuk penetapan
kadar piperin dalam ekstrak Piper nigrum Linn..
SARAN

DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal, B.B., Bhatt, I.D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sundaram, C.,
Seeram, N., Shisodia, S., 2006. Curcumin-Biological and Medicinal
Properties. Turmeric: The Genus Curcuma, 1(6), 297-368.
Ahuja, S., Dong, M.., 2005. Handbook of Pharmaceutical Analysis By KCKT, 1st
ed. Elsevier Ltd, Netherland.
Ahuja, S., Rasmussen, H., 2007. KCKT Method Development For
Pharmaceuticals, 1st ed. Elsevier Ltd, Netherland.
Ali, I., Haque, A., Saleem, K., 2014. Separation and Identification of
Curcuminoids in Turmeric Powder by KCKT Using Phenyl Column.

12
 Analytical Methods, 6(8), 2526-2536.
AOAC, 2011. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical
Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 1-27.
BPOM, 2014. Pedoman Uji Klinik Obat Herbal. Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia.
FDA, 2018. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S
Department of Health and Human Services Food and Drug Administration,
1-22.
Fonseca, B., Gremião, M.P.D., Chorilli, M., 2017. A Simple Reversed Phase High
Performance Liquid Chromatography (KCKT) Method for Determination of
In Situ Gelling Curcumin-loaded Liquid Crystals in In Vitro Performance
Tests. Arabian Journal of Chemistry, 10(7), 1029-1037.
Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi: Analisis. Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Günzler, H., Williams, A., 2008. Handbook of Analytical Techniques. Wiley-
VCH, Germany.
Harmita, Manurung, J., 2009. Analisis Fisikokimia: Kromatografi, Vol. 2. EGC,
Jakarta.
International Conference on Harmonization, 2005. Harmonized Tripartite
Guideline Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.
International Conference on Harmonization, Genova.
Jayaprakasha, G.K., Jagan Mohan Rao, L., Sakariah, K.K., 2002. Improved
KCKT Method for the Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin,
and Bisdemethoxycurcumin. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
50, 3668-3682.
Kazakevich, Y., LoBrutto, R., 2007. KCKT for Pharmaceutical Scientists. Wiley-
Interscience, Hoboken.
Khismatrao, A., Bhairy, S., Hirlekar, R., 2018. Development and Validation of
RP-KCKT Method for Simultaneous Estimation of Curcumin and Piperine.
International Journal of Applied Pharmaceutics, 10(5), 43.
Meyer, V., 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography, 5th ed.
John Wiley and Sons Ltd, Switzerland.
Monton, C., Charoenchai, L., Suksaeree, J., Sueree, L., 2016. Quantitation of
Curcuminoid Contents, Dissolution Profile, and Volatile Oil Content of
Turmeric Capsules Produced at Some Secondary Government Hospitals.
Journal of Food and Drug Analysis, 24(3), 493-499.
Narayani, S.S., Aravanan, S., Bharathiaraja, S. Mahendran, S., 2016. Extraction,
Partially Purification and Study on Antioxidant Property of Fucoxanthin
from Sargassum cinereum. Journal of Chemical and Pharmaceutical
Research, 8(3), 610-616.
Nardo, L., Andreoni, A., Masson, M., Haukvik, T., Tønnesen, H.H., 2011. Studies
on Curcumin and Curcuminoids. XXXIX. Photophysical Properties of
Bisdemethoxycurcumin. Journal of Fluorescence, 21(2), 627-635.
Pulido, M., Moreno, J., Ramirez, C., Ramirez, M.C., 2016. Curcumin and Health.
Molecules, 21(3), 1-22.
Stankovic, I., 2004. Curcumin. Chemical and Technical Assessment 61st JECFA,

13
 1(8), 1-8.
Unites States Pharmacopeial Convention, 2017. The United States Pharmacopeia
40 National Formulary 35 (USP40-NF35). Unites States Pharmacopeial
Convention Inc, USA.
Wichitnithad, W., Jongaroonngamsang, N., Pummangura, S., Rojsittthisak, P.,
2009. A Simple Isocratic KCKT Method for the Simultaneous Determination
of Curcuminoids in Commercial Turmeric Extracts. Phytochem. Anal., 20(3),
314-319.

Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku piperin

1. Konsentrasi 0,05 µg/mL replikasi 1

2. Konsentrasi 0,1 µg/mL replikasi 1

3. Konsentrasi 0,5 µg/mL replikasi 1

4. Konsentrasi 1 µg/mL replikasi 1

5. Konsentrasi 2,5 µg/mL replikasi 1

6. Konsentrasi 5 µg/mL replikasi 1

7. Konsentrasi 10 µg/mL replikasi 1

14
 8. Konsentrasi 15 µg/mL replikasi 1

9. Konsentrasi 20 µg/mL replikasi 1

10. Konsentrasi 25 µg/mL replikasi 1

11. Konsentrasi 30 µg/mL replikasi 1

12. Konsentrasi 35 µg/mL replikasi 1

13. Konsentrasi 40 µg/mL replikasi 1

Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali

1. Non Adisi replikasi 1

2. Adisi 1 (rendah) replikasi 1

15
 3. Adisi 2 (sedang) replikasi 1

4. Adisi 3 (tinggi) replikasi 1

Lampiran 3. Kromatogram Ekstrak Piper nigrum Linn. konsentrasi 0,05

µg/mL

Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi

 Contoh perhitungan perolehan kembali pada adisi 1 replikasi pertama:

Persen perolehan kembali = (Cf – Cu) x 100/Cu
= (1,380 – 0,462) x 100/1
= 91,8%

 Contoh perhitungan koefisien variasi pada adisi 1:

Koefisien variasi (CV) = SD/rata-rata x 100%
= 0,027/1,425 x 100%

16
= 0,019%

17