Anda di halaman 1dari 6

Nama: Mimma Amalia

NIM: 190332722011

1. Apa itu RT- PCR, apa saja bedanya dengan PCR biasa atau konvensional.
(min 4)
Jawab: RT-PCR adalah adalah teknik yang digunakan untuk memonitor progress
reaksi PCR pada waktu yang sama. RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR
(qPCR).
PCR Konvensional RT-PCR
Produk amplifikasi PCR hanya dapat Deteksi produk PCR dapat dihasilkan
diamplifikasi pada akhir proses reaksi pada fase awal reaksi atau proses
PCR akumulasi produk PCR bersamaan
dengan proses amplifikasi sehingga
ketika alat selesai bekerja, data hasil
amplifikasi dapat langsung dianalisis
Tidak dapat mengetahui kuantitas gen Dapat mengetahui kuantitas gen target
target atau tidak memungkinkan untuk pada sampel hingga dapat
menghitung jumlah salinan (copy) membandingkan ekspresi gen pada
secara tepat dari template yang sampel
diperlukan untuk analisis ekspresi gen
Menggunakan gel elektroforesis untuk Menggunakan reagen yang
mendeteksi produk amplifikasi berfluorosensi dalam amplifikasi DNA
salah satu reagennya yaitu SYBR Green
1
Kemungkinan terjadinya kontaminasi Mengurangi kemungkinan terjadinya
karena terdapat proses gel elektroforesis kontaminasi karena meniadakan proses
gel elektroforesis
Waktu eksperimen memerlukan jangka Mempersingkat waktu eksperimen
waktu yang lumayan lama

2. Apa keunggulan dan apa pula kelemahan RT-PCR dibanding PCR biasa
ditinjau dr kecepatan dan kegunaannya?
Jawab:

 Keunggulan Real Time PCR


1. Mampu meengukur asam nukleat dalam rentang dinamis yang sangat luas
atau lebar (lebih dari 5 log).
2. Memiliki sensitivitas yang tinggi, mampu mendeteksi kurang dari 5 salinan
sekuens target sehingga memungkinkan untuk menganalisis sampel yang
sedikit seperti biopsi klinik,atau lisat yang sangat kecil dari tangkapan laser
mikrodiseksi
3. Mampu untuk menganalisis eksperesi gen yang sangat halus bahkan pada
tingkat rendah sekalipun dengan standar internal dan perhitungan yang
tepat,rata rata 1-2 %,
4. Platform real time relatif cepat dan otomatis.
5. Reaksi PCR dilakukan pada wadah tertutup sehingga meminimalkan
kemungkinan kontaminasi silang dari laboratorium

 Kelemahan Real Time PCR


1. Kerja Real Time PC dapat mengalami penghambatan oleh senyawa senyawa
yang terkandung dalam sampel biologi yang digunakan seperti Hb da urea di
bidang forensik forensik dan klinik. Dalam biadng mikrobiologi makanan
dapat dihambat oleh adanyan senyawa organik atau fenolik
2. Reaksi pada PCR yang memerlukan RNA pada tahap enzimatis dapat
menimbulkan beberapa masalah karena RNA lebih labil dibandingkan
DNA..
3. Keterbatasan PCR yang utama bukan terletak pada teknologinya namun
lebih disebabkan karena faktor human error atau kesalahan pada manusia
yakni pengembangan uji yang tidak benar, ketidakbenaran analisis, dan
kesimpulan yang tidak beralasan
4. Penggunanan PCR untuk analisis ekpresi gen memerlukan set primer Real
Time PCR yang harus didesain dan divalidasi dengan krtiteria yang tepat
untuk mematikan spesifisitas dan keakuratan hasil yang diperoleh.

3. Ada 2 jenis pewarna fluoresens yg umum digunakan pd RT PCR, apa saja


dan apa keunggulan dan kelemahan dr masing-masing jenis itu?
Jawab: Terdapat dua jenis jenis pewarna fluoresens yg umum digunakan pd RT
PCR yaitu Cyber Green dan Taqman.
A. Keunggulan Cyber Green/SYBR Green 1
 Mudah untuk diproduksi
 Harganya murah atau terjangkau
 Mudah untuk ditangani
 Bersifat sensitive
 Efektif
 Dapat berfluorosensi dengan sangat terang dan tidak membutuhkan banyak
pewarna
B. Kelemahan Cyber Green/SYBR Green 1
 Tidak bersifat spesifik.
Jika primer tidak dapat mengikat spesifik gen yang dituju, cyber green tidak
dapat dideteksi karena cyber green tidak dapat membedakan squence yang
dituju dengan squence yang lainnya. Hal ini dapat diatasi menggunakan
“Highly Spesific Primer” sehingga kita dapat memastikan bahwa primer
akan mengikat secara spesifik terhadap gen atau sequence yang dituju.

A. Keunggulan Taqman
 Spesifik pada setiap sequence atau setiap gen
 Multiplex RT-PCR
Kita dapat menggunakan RT-PCR terhadap banyak gen dalam satu tabung
reaksi dengan spesifik detektor
B. Kelemahan Taqman
 Sulit untuk mengurutkan sequence
 Harganya mahal
 Kemungkinan terdapat hasil yang salah

4. RT PCR dapat digunakan untuk mengkuantifikasi DNA dalam suatu


larutan sampel, nilai apa yg digunakan sbg ukuran kuantitas DNA dlm
sampel dan jelaskan dg singkat cara penentuan kuantifikasi nya?

Jawab: Untuk mengukur kuantitas DNA maka dapat menggunakan Ct (Cycle


Thershold) yang menandakan bahwa semakin kecil nilai Ct maka semakin besar
DNA yang dihasilkan sehingga fluorosence semakin tinggi begitupun sebaliknya.
Gambar kurva dapat dilihat di bawah ini.
5. RT PCR juga dpat digunakan untuk mendeteksi suatu virus RNA atau
melihat tingkat ekspresi suatu gen, tetapi dg bantuan enzim reverse
transcriptase, shg terbentuk cDNA yg dpt dikuantifikasi. Jelaskan secara
ringkas tahapan RT PCR utk kedua kegunaan di atas?
Jawab:
mRNA cDNA
Reverse Transkriptase

Sebelum melakukan ini kita membutuhkan mRNA induk, primer, komponen DNA
(dNTPs) yang digunakan untuk menghasilkan DNA, RNA dan DNA polimerase,
serta enzim reverse transcriptase. Secara umum enzim reverse transcriptase adalah
enzim yang digunakan oleh retrovirus untuk membuat copy DNA berdasarkan
RNAnya. Enzim reverse transcriptase ini kemudian digunakan untuk
mengkontruksi copy DNA yang disebut cDNA dengan menggkunakan RNA
sebagai cetakannya. Dengan demikian gen atau sebagian dari gen dapat disintesis
berdasarkan mRNA