(Wartono Hadie)
ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan teknik rekayasa penyisipan gen warna
pada ikan hias dan pengetahuan tentang pola pewarisannya yang akan dapat
membantu perbaikan mutu ikan. Metode yang diterapkan adalah elektroforasi. Ikan
hias yang digunakan dalam penelitian adalah ikan komet (Carassius auratus)
sedangkan gen pemendar yang digunakan adalah GFP (green fluorescent protein)
dengan konstruksi DNA yang digunakan berbentuk plasmid yang dikontrol oleh
promoter β-aktin dari ikan Japanese flounder (ikan sebelah) dengan panjang fragmen
pKer-GFP 6,0 kb. Sintasan dan keberadaan gen GFP diamati mulai dari telur menetas.
Ekspresi gen dapat diamati setelah fase terbentuknya sirip dan dilakukan secara
deskriptif (performa) dan PCR. Hasil yang diperoleh gen GFP terekspresi mulai
pembentukan sirip dan hasil cek PCR semua ketiga konsentrasi DNA yang dicobakan
mempunyai ekspresi yang sama. Untuk dapat mengetahui ekspresi gen GFP sampai
pada F0 masih menunggu ikan dewasa dan matang gonad.
This research was aimed to obtain a method for introduction of exogenous gene of
green flourescent protein (GFP) in order to improve the ornamental fish color
appearance. The method used were electroporation. The Carassius auratus were
used in this research. The construct of flourescent gene of pKer-GFP as DNA construct
of plasmid controlled by β-actin of Japanese flounder with pKer-GFP 6.0 kb in length.
Survival rate and gene expression of GFP assessed right after the eggs hatched.
Gene expression was observed using PCR product and direct observation. The result
show that the expression of GFP from all of three treatments were observed but not
significantly different. This expression however should be wait until the fish mature.
335
J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.3 Tahun 2010: 335-343
336
Penyisipan gen warna pada ikan Carassius auratus ..... (Wartono Hadie)
Kpn I Bam HI M 1 2 3 4 N M
kb
3.0
Prom. Keratin GFP SV40 1.5
1.0
0.5
pKer-GFP (6.0 kb)
0.2
Gambar 1a. Peta plasmid pKer-GFP diper- Gambar 1b. Peta plasmid pKer-GFP (kiri), dan
banyak menggunakan bakteri E. pengecekan hasil transformasi
coli strain DH5-α. plasmid pada 4 klon bakteri meng-
Figure 1a. Map of plasmid pKer-GFP multi- gunakan PCR
pliedusing E. coli strain DH5α Figure 1b. Map of plasmid pKer-GFP. (left),
and testing of plasmid transfor-
337
J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.3 Tahun 2010: 335-343
Tabel 1. Motilitas spermatozoa dari hasil perlakuan kejutan listrik dan kadar DNA
yang berbeda
Table 1. Motility of spermatozoa resulted from different voltages and DNA
consentrations
Volt ase Konsent rasi DNA Wakt u ant ara Volt ase akt ual M ot ilit as
Volt age Consent rat ion DNA Droop Act ual Volt age Mot ilit y (%)
Keterangan: Huruf superscript yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan
perbedaan nyata (P<0,05)
Note: Different superscripts in the same column show significant difference (P<0.05)
semen carp dapat dengan mudah dikeluarkan energi dari luar untuk melanjutkan hidupnya.
dengan cara di-stripping. Bahan utama yang dipakai sebagai sumber
energi dari luar adalah fruktosa yang akan
Medan elektromagnetik akan menyebab-
diubah menjadi asam laktat dan energi dengan
kan polarisasi ion pada cairan dan juga
bantuan enzim fruktolisin. Pemberian larutan
pada tubuh spermatozoa. Dengan demikian
fruktosa sebagai pengencer untuk spermato-
kekuatan medan elektromagnetik ini akan
zoa ikan dimaksudkan untuk memberikan
secara langsung mempengaruhi viabilitas dan
energi dan nutrisi untuk spermatozoa ikan agar
motilitasnya.
dengan energi yang berupa ATP tersebut
Dari Tabel 1, menunjukkan bahwa dosis dapat meningkatkan atau memperpanjang
DNA yang digunakan tidak memberikan waktu motilitas dan viabilitas spermatozoa.
pengaruh yang nyata (P>0,05) pada motilitas Di lain pihak kemampuan spermatozoa
spermatozoa. Pengaruh dosis DNA secara hidup secara normal setelah keluar dari testis
terpisah pada motilitas tidak terpola, yang hanya berkisar antara 1-2 menit. Menurut
menunjukkan bahwa dosis DNA tidak menye- Suquest et al. (1993) dalam Cosson et al.
babkan turunnya motilitas. Demikian pula jika (1999), bahwa di alam durasi motilitas terjadi
digabung antara dosis 10 μL dan 25 μL, rata- dalam periode yang sangat pendek pada ikan
ratanya tidak merubah nilainya secara nyata. air tawar. Billard dalam Jamieson (1990)
Oleh karena itu, dapat dinyatakan bahwa menyatakan bahwa motilitas spermatozoa ikan
motilitas spermatozoa hanya dipengaruhi oleh dibatasi pada periode detik dan menit karena
intensitas elektromagnetis dalam voltase yang adanya osmotic injury.
digunakan (Gambar 2).
Hasil Penggabungan DNA pada
Keberhasilan pembuahan (fertilisasi) dapat Spermatozoa
didukung oleh kualitas spermatozoa yang baik,
secara fisik maupun motilitasnya. Untuk Sebagian sperma yang dihasilkan dari kejut
mengetahui tingkat fertilisasi yang lebih tinggi, listrik dianalisis untuk mengetahui inkorporasi
perlu dicari larutan fisiologis yang dapat plasmid pKer-GFP dalam sperma menggunakan
menambah daya motilitas dan viabilitas metode PCR. Sebagian besar sperma ikan yang
spermatozoa. Menurut Rustidja (1985), peng- sudah dielektroforasi selanjutnya digunakan
gunaan larutan fisiologis yang mengandung untuk membuahi telur. Hasil analisis PCR
NaCl dan urea dapat mempertahankan daya dengan DNA dari sperma ikan komet hasil
hidup spermatozoa antara 20-25 menit. elektroforasi ditunjukkan pada Gambar 3.
Menurut Soehartojo (1995), di luar testis Hasil penggabungan DNA gen warna pada
sel spermatozoa mampu memakai sumber spermatozoa dapat diketahui dengan dua cara
338
Penyisipan gen warna pada ikan Carassius auratus ..... (Wartono Hadie)
100.00 Gabungan
90.00 10 μL
80.00 5 μL
Motility of sperm
Motilitas sperma
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
50 75 100
Voltase (Voltage) (mV/cm )
2
M 10 25 P N
Gambar 3. Hasil uji PCR DNA sperma komet yang telah dielektroforasi
Figure 3. PCR test of DNA spermatozoa treated with GFP by electrophoration
339
J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.3 Tahun 2010: 335-343
Tabel 2. Jumlah ikan yang hidup hasil penyisipan gen warna (GFP) dengan metode
elektroforasi
Table 2. Total of survived fish resulted from introduced GFP gene done with
electrophoration method
Volt ase Konsent rasi DNA Jumlah ikan yang hidup ( ekor)
Volt age (mV/s) Consent rat ion of DNA (μL) Tot al of life fish ( pcs )
50 10 84
75 10 86
75 10 104
100 10 123
50 25 36
75 25 18
Tabel 2. Pada perlakuan konsentrasi DNA 25 promoter dengan suatu gen lalu mengamati
μL dan voltasi 100 volt terjadi mortalitas 100%. ekspresi sementara (transient) yang terjadi
pada hewan uji. Selain itu, juga dapat dilihat
Telur ikan komet pada panelitian ini
ekspresi gen GFP pada sirip ikan yang
berkualitas bagus, hal ini dibuktikan dengan
membawa gen tersebut, walaupun tidak semua
derajat penetasannya yang tinggi, walaupun
yang membawa gen GFP akan terekspresi
pada fase larva banyak yang mati, kecuali pada
secara sempurna.
kontrol. Identifikasi telur adalah hal yang
penting untuk mengetahui nilai derajat Pada awalnya promoter keratin merupakan
sintasan embrio telur kontrol maupun telur promoter yang digunakan pada teknologi
yang diberi perlakuan gen (injek atau elektro- transgenesis yang terkait dengan sistem imun,
forasi). karena efektivitasnya yang tinggi pada
jaringan kulit (Gong et al., 2002). Namun
Dari Tabel 2 menunjukkan bahwa jumlah
demikian efektivitas promoter keratin tidak
ikan yang hidup dari hasil perlakuan dengan
hanya terbatas pada jaringan kulit dan epitel,
konsentrasi DNA yang berbeda tidak memiliki
tapi juga terdapat pada sel yang sedang
pola yang jelas. Artinya bahwa jumlah ikan yang
berkembang dan sel saraf tertentu. Sedangkan
hidup, bukan semata-mata pengaruh dari
Yazawa et al. (2005) menjelaskan bahwa
konsentrasi DNA, tetapi ada faktor lain selama promoter keratin yang diujikan pada ikan zebra
embriogenesis maupun setelah ikan menetas. mampu bersifat dapat aktif di mana-mana
Ekspresi Gen pada Ikan atau tidak spesifik jaringan tertentu (ubiquitous)
dan dapat aktif kapan saja diperlukan (house
Ekspresi sementara pada hasil korporasi keeping). Para peneliti telah melakukan
DNA ke dalam spermatozoa melalui elektro- karakterisasi promoter keratin pada berbagai
forasi ikan komet dapat dilihat pada Gambar 4. jenis ikan, antara lain pada ikan rainbow trout
Pada Gambar 4 benih ikan komet berumur (Markl et al., 1989), ikan koki, common carp
sekitar 3 bulan yang sudah dapat dilihat bahwa (Groff et al., 1997), ikan hiu (Schaffeld et al.,
ekspresi GFP yang disisipkan jelas terekspresi. 1998), serta ikan zebra (Yazawa et al., 2005).
Untuk membuktikan dan memastikan kebe-
Houdebine & Chourrout (1991) dalam
radaan GFP (DNA) pada benih ikan komet
Dunham (2004) menjelaskan bahwa ketika
tersebut dilakukan PCR terhadap sirip ekor
DNA asing diinjeksikan ke dalam sitoplasma,
yang diambil sekitar 0,45 g. Hasil dari PCR
maka DNA asing tersebut mengalami proses
jaringan sirip menunjukkan semua positif
replikasi dan dapat terekspresi dengan baik
membawa gen, tetapi harus dianalisis lebih
seiring dengan perkembangan embrio, namun
lanjut untuk masing-masing individu.
kemudian perlahan ekspresi tersebut hilang
Menurut Purwanti (2007), untuk menge- pada fase perkembangan larva, pola ekspresi
tahui efektivitas suatu promoter, pada seperti ini pada umumnya disebut ekspresi
umumnya dilakukan dengan menyambungkan sementara (transient). Ekspresi sementara
340
Penyisipan gen warna pada ikan Carassius auratus ..... (Wartono Hadie)
A B
Gambar 4. (A) Performa benih ikan yang telah diintroduksi dengan gen GFP
menggunakan elektroforasi. (B) hasil PCR dari sirip ekor benih ikan komet yg
berumur 3 bulan. M : marker; K (-) : kontrol negatif; K (+) : kontrol positif; 1 :
dosis DNA 10 μL/50 mV/s); 2. dosis DNA 25 μL/50 mV/s); 3. dosis DNA 10
μL/75 mV/s); 4. dosis DNA 25 μL/75 mV/s); 5. dosis DNA 10 μL/100 mV/s)
Figure 4. (A) Performance of fish introduced with GFP gene by electrophoration, (B)
Result of PCR from caudal fin of 3 months old fish. M : marker; K (-) : negative
control; K (+) : positive control; 1 : dosage of DNA 10 μL/50 mV/s); 2. dosage
of DNA 25 μL/50 mV/s); 3. dosage of DNA 10 μL/75 mV/s); 4. dosage of DNA
25 μL/75 mV/s); 5. dosage of DNA 10 μL/100 mV/s)
sering terjadi pada beberapa penelitian deskriptif dilakukan bertahap mulai umur 3
transgenik, di antaranya pada ikan kakap, minggu sampai sirip sudah mulai panjang dan
Sparus auratus (Garcia-Pozo et al., 1998), ikan kemungkinan dapat dipotong untuk dilakukan
zebra (Meng et al., 1999), ikan medaka (Winkler PCR. Perbandingan yang lebih nyata sampai
et al., 1990), ikan lele (Ath-thar, 2007), dan ikan sekarang belum dapat terlihat jelas mengingat
mas (Purwanti, 2007). ikan masih kecil sehingga perpendaran warna
yang diharapkan belum optimal. Ekspresi
Ekspresi gen sementara berhubungan erat
secara morfologi ikan komet sebelum di-
dengan ketahanan dari DNA yang diinjeksikan
elektroforasi dengan setelah dielektroforasi
atau dielektroforasikan (Lyengar et al., 1996).
dapat dilihat pada Gambar 5.
Tingginya ekspresi yang terjadi pada fase
gastrula kemungkinan sebagai hasil dari Untuk mendapatkan ekspresi gen pada
akumulasi DNA yang diinjeksikan yang ber- tahap F0 dari penelitian ini masih menunggu
lanjut pada peningkatan replikasi pada fase sampai ikan komet menjadi induk dan matang
pembelahan (cleavage) dan akumulasi dari gonad sehingga akan dilihat dengan PCR
enzim (RNA polymerase II) yang menyebabkan jaringan gonadnya untuk mengetahui ikan
dimulainya transkripsi pada saat MBT (mid- yang mana yang gen GFP di gamet, yang akan
blastula transition). Lebih lanjut dijelaskan digunakan untuk memproduksi ikan transgenik
bahwa degradasi dari DNA pada saat fase keturunan pertama (F-1).
lanjutan pada pembelahan sel diperkirakan
Apabila dalam gonad ternyata terekspresi
akan menyebabkan penurunan bertahap dari
gen tersebut, maka ikan komet hasil elektro-
jumlah DNA sehingga ekspresi sementara gen
forasi nantinya akan disilangkan dengan ikan
GFP akan semakin melemah.
yang tidak diberi perlakuan dan sebaliknya.
Ekspresi sementara umumnya muncul Hal tersebut dilakukan dengan maksud untuk
setelah MBT, tergantung promoter yang mendapatkan F-1, apakah ekspresi gen GFP
digunakan. Pada penelitian ini, ekspresi yang diijeksikan dapat diwariskan, dan
sementara gen GFP pada larva mulai muncul seberapa persen nilai pewarisannya, serta
pada saat tumbuhnya sirip. Sebenarnya pada ekspresi tersebut terdapat pada jaringan apa.
fase gastrula sudah mulai muncul tetapi waktu Perlakuan tersebut berlangsung seterusnya
itu tidak diamati, karena kekhawatiran ikan F-2, F-3, dan seterusnya, dengan demikian
mengalami stres. Akhirnya pengamatan secara hasil penelitian ini merupakan penelitian dasar
341
J. Ris. Akuakultur Vol.5 No.3 Tahun 2010: 335-343
A B
Gambar 5. Pengamatan visual untuk membedakan warna ikan komet: (A) tanpa penambahan
gen GFP dan (B) sesudah dilakukan penyisipan gen GFP dengan elektroforasi
Figure 5. Visualization of fish to compare the color (A) without insertion of GFP gene, (B) fish
with insertion of GFP gene by electrophoration
yang baru dapat melihat ekspresi gen pada Cosson, J., Billard, R., Cibert, C., & Dreanno, C.
benih ikan komet. 1999. Ionic Factor regilating theMotility of
fish sperm. Villefranch. France, p. 1,238-
KESIMPULAN 1,243.
1. Metode penyisipan (induksi) gen pemendar Dunham, R.A. 2004. Aquaculture and Fisheries
warna (GFP) dapat dilakukan menggunakan Biotechnology : Genetic Approaches. CABI
metode elektroforasi pada spermatozoa. Publishing. Cambridge, MA, USA, 380 pp.
Garcia-Pozo, S., Bejar, J., Shaw, M., & Alvarez,
2. Elektroforasi untuk penggabungan DNA
M.C. 1998. Effect of exogenous DNA mi-
gen warna pada spermatozoa pada ikan
croinjection on early development re-
komet dapat dilakukan menggunakan
sponse of the seabream Sparus aurata. Mo-
voltase antara 50 dan 100 mV/cm2 dengan
lecular Marine Biology and Biotechnology,
konsentrasi DNA 10 μL dan 25 μL.
7(4): 248-257.
3. Gen pemendar warna (GFP) yang di- Gong, Z., Wan, H., Ju, B., He, J., Wang, X., & Yan,
insersikan ke dalam telur melalui sperma- T. 2002. Generation of Living Color
tozoa telah dapat diidentifikasi pada umur Transgenic Fish. In: Shimizu, N., Aoki, T.,
dua bulan dengan PCR dari ikan yang Hirono, I., & Takashima, F. (eds) Aquatic
dihasilkan. Genomics: Steps Toward a Great Future.
Springer-Verlag. New York, p. 329-339.
DAFTAR ACUAN
Groff, J.M., Naydan, D.K., Higgins, R.J., & Zinkl,
Ath-thar, M.H.F. 2007. Efektivitas promoter â- J.G. 1997. Cytokeratin filament expression
actin ikan medaka Oryzias latipes dengan in epithelial and non-epithelial tissues of
penanda gen hrGFP (Humanized Renilla the Common Carp (Cyprinus carpio). Cell
reniformis Green Fluorescent protein) pada Tissue Res., 287: 375-384.
ikan lele Clarias sp. Keturunan F0. Skripsi. Hackett, P.B. 1993. The Molecular Biology of
Departemen Budidaya Perairan. Perikanan Transgenic Fish. In: Hocachka and
dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor, Mommesen (Eds.). Biochemistry and Mo-
75 hlm. lecular Biology of Fishes. Elsevier Science
Billard, R. 1978. Changes in structure and fer- Publishers BV., 2: 218-221.
tilizing ability of marine and freswater fish Haubruge, E., Petit, F., & Gage, M. 2000. Re-
spermatozoa diluted in media of various duced sperm counts in guppies (Poecilia
salinities Aquaculture, 14: 187-198. reticulata) following exposure to low lev-
Collas, P., Husebeye, H., & Alestrom, P. 2000. els oftributyltin and bisphenol. Proc. R. Soc.
Transferring foreign genes into zebrafish Biol. Ser. B., 267: 2,333-2,337.
eggs by microinjection. Transgenic Animal: Jamieson, B.G.M. 1990. Fish Evolution and Sys-
Generation and Use, p. 119-122. tematics: Evidence from Spermatozoa
342
Penyisipan gen warna pada ikan Carassius auratus ..... (Wartono Hadie)
(With a survey of lophophorate, echinoderm Rustidja. 1985. Pengantar Ilmu Repoduksi Ikan.
and protochordate sperm and an account Fisheries Project Unibraw. Malang, 138 hlm.
of gamete cryopreservation. Cambridge Schaffeld, M., Lobbecke, A., Lieb, B., & Markl, J.
University Press. New York, 22 pp. 1998. Tracing keratin evolution: catalog,
Kinoshita, M. & Ozato, K. 1995. Cytoplasmic expression patterns and primary structure
microinjection of DNA into fertilized medaka of Shark (Scyliorhinus stellaris) keratins. Eur.
Oryzias latipes eggs. The Fish Biology J. J. Cell. Biol., 77: 69-80.
MEDAKA, 7: 59-64. Soehartojo, H. 1995. Ilmu Kemajiran Pada
Lyengar, A., Muller, F., & Maclean, N. 1996. Regu- Ternak. Airlangga University Press.
lation and expression of transgenes fish – Surabaya, 120 hlm.
A Review. Transgenic Research, 5: 147-166. Suquest, M., Dorange, G., Omnes, M.H.,
Markl, J., Winter, S., & Franke, W.W. 1989. The Normant, Y., Le Roux, A., & Fauvel, C. 1993.
catalog and the expression complexity of Composition of the seminal fluid and
cytokeratins in lower vertebrate: Biochemi- ulrastructure of the spermatozoon of tur-
cal identification of cytokeratins in a te- bot (Scophtalmus maximus). J. Fish Biol.,
leost fish, Rainbow trout. Eur. J. Cell. Biol., 42: 509-516.
50: 1-16. Winkler, C., Vielkind, J.R., & Schartl, M. 1990.
Meng, A., Jessen, J.R., & Lin, S. 1999. Transient expression of foreign DNA dur-
Transgenesis. Methods in Cell Biology In : ing embryonic and larval development of
Detrich HW III, Westerfield, M. & Zon, LI (eds.) the Medaka fish Oryzias latipes. Mol. Gen.
60: 133-148. Genet., 226: 129-140.
Purwanti, L.I. 2007. Uji Efektivitas Promoter â- Yazawa, R., Hirono, I., & Aoki, T. 2005. Charac-
actin Ikan Medaka Oryzias latipes dengan terization of promoter activities of four dif-
Penanda Gen hrGFP (Humanized Renilla ferent Japanese Flounder promoters in
reniformis Green Fluorescent protein). transgenic Zebrafish. Marine Biotechnol-
Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. ogy, 7: 625-633.
Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut
Pertanian Bogor, 97 hlm.
343