Evaluasi kemanjuran sediaan steril dengan zat chlorhexidine gluconate sebagai antisepsis

maupun desinfektan.

Abstrak :

Pendahuluan :

Antisepsis kulit adalah salah satu tindakan pencegahan paling efektif untuk mengurangi infeksi
terkait perawatan kesehatan (HAI), termasuk infeksi aliran darah terkait-kateter (CRBSIs) dan
infeksi pasca bedah(1,2). Antisepsis kulit dilakukan sebelum operasi untuk mengurangi beban
mikroba dan meminimalkan risiko infeksi di tempat bedah. Beberapa agen tersedia untuk prosedur
ini, termasuk alkohol, yodium dan iodoform, chlorhexidine gluconate (CHG), dan kombinasi agen-
agen ini (3). Chlorhexidine gluconate (CHG) adalah antimikroba yang digunakan dalam persiapan
kulit pra-operasi karena aktivitas spektrum luas dan sifat persistennya (4,5). Chlorhexidine
gluconate telah digunakan selama lebih dari 50 tahun sebagai persiapan untuk kebersihan tangan
dan dekolonisasi kulit. Penggunaan antiseptik ini telah meningkat pesat dalam beberapa tahun
terakhir, mengikuti upaya untuk mendekolonisasi individu yang merupakan pembawa
Staphylococcus aureus (MRSA) yang resistan terhadap metisilin. Berbagai penggunaan CHG untuk
dekolonisasi, termasuk pasien unit perawatan intensif mandi (ICU) untuk mengurangi infeksi terkait
perawatan kesehatan (HAI) dan pemandian universal pasien rawat inap untuk mengurangi akuisisi
organisme yang resistan terhadap beberapa obat (MDRO), baru-baru ini diulas (6). Karena
peningkatan penggunaan ini, kekhawatiran tentang kemungkinan pengembangan resistensi terhadap
CHG telah muncul, dan beberapa penelitian telah berusaha untuk menjawab pertanyaan ini (7-10).
Namun, saat ini tidak ada penelitian membahas tentang bagaimana menguji kerentanan organisme
terhadap CHG. Akibatnya, banyak metode telah digunakan dan sulit untuk membandingkan data
dari studi yang berbeda (11). Sebagai agen antiseptik, menunjukkan bahwa spektrum yang luas dari
aktivitas antibakteri yang efektif terhadap kedua gram positif dan gram negatif bakteri non-
sporeforming. Aktivitas antivirus dari CHG meliputi virus menyelimuti selektif, termasuk HIV (12).
Spektrum aktivitas melawan mikroba patogen tampaknya mirip dengan povidone iodine. Namun,
tidak seperti povidone iodine, CHG tidak aktif oleh darah atau serum protein dan menunjukkan
aktivitas antimikroba sisa pada permukaan kulit, menekan pertumbuhan mikroba selama beberapa
jam setelah aplikasi (13). Dari sudut pandang penggunaan yang aman, persiapan kulit antimikrobial
efektif yang memiliki potensi irirtasi rendah akan sangat diinginkan. Untuk itu, kami melakukan
studi kilinid komparatif menyelidiki berbagai konsentrasi CHG (0,5%, 1%, dan 2%) dalam alkohol
dan PVP-I untuk menilai keampuhan antimikroba mereka sebagai persiapan pra operasi dan potensi
iritasi kulit mereka. Tujuan utama dari studi ini adalah untuk mengidentifikasi perumusan CHG-
EtOH yang baik efektif untuk antisepsis kulit dan potensi iritasi rendah, seperti yang diinginkan
untuk dimasukkan pre-kateter, injeksi, dan persiapan kulit sebelum operasi (14).
Metode

Formulasi yang diuji adalah dengan menggunakan preparasi kulit dalam pengembangan (2% CHG /
70% IPA dengan warna dan kopolimer akrilat pembentuk film; 3M, St. Paul, MN) dan salah satu
preparasi kulit yang tersedia secara komersial tanpa colpolymer ( Persiapan Kulit pasien sebelum
operasi, diwarnai; bahan aktif 2% b / v CHG dan 70% v / v IPA) atau larutan CHG 2% dalam air
sebagai kontrol (disiapkan dengan pengenceran 20% CHG dari Medichem, Barcelona, Spanyol). Ini
masing-masing dinamai Produk A, Produk B, dan Produk C. Bahan lain yang digunakan adalah:
Air, Pengencer Buffered Fosfat (PBDW) dari Butterfield; trypticase agar kedelai (TSA); trypticase
soybroth yang mengandung 5% darah domba yang dideklinisasi (TSB + S); Agar Müeller-Hinton
(MHA); Kaldu Müeller-Hinton (MHB);

Reagen pewarnaan Gram, strip Etest1 untuk klindamisin, oksasilin, vankomisin, ampisilin,
ceftazidime, imipenem, piperasilin, dan tobramycin (BioMérieux Clinical Diagnostics, 69280
Marcy l'Etoile, Prancis); dan garam potassium-G kadar kalium (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ).

2.1 Uji invitro.

2.1.1 Persiapan suspensi mikroorganisme

Suspensi bakteri dan ragi disiapkan menggunakan kultur. Dengan waktu 18-24 jam yang tumbuh
pada suhu 36 ± 1 ○ C dalam TSB atau TSB + S. Setiap kultur disesuaikan dengan pengenceran
menggunakan PBW untuk menghasilkan konsentrasi sekitar 1 × 108 CFU / mL, jika
memungkinkan.

2.1.2. Persiapan preparasi kulit berbasis CHG

Dengan menggunakan konsentrasi aktif yang diuji untuk Produk A dan B (2% CHG / 70%
IPA),dengan melakukan pengenceran dua kali lipat dianggap sebagai konsentrasi aktif sekunder
(1% CHG / 35% IPA), dan konsentrasi tidak aktif (0,0002% CHG / 0,007% IPA).

2.1.3 Penetuan aktivitas antimikroba

Pengujian antimikroba dilakukan berdasarkan metode ASTM E2315 03 dan penggunaan

Mikrobiologi Klinis secara manual [15,16]. Untuk setiap pengujian mikroorganisme, dengan
menggunakan 9,9 mL produk uji atau kontrol .Untuk pengujian (Produk A) atau kontrol (Produk
B) dimasukan kedalam ke tabung reaksi yang sudah disterilkan. Tabung reaksi ditutup dan
didiamkan pada suhu 30 ○ C selama 10 menit. Ditambahkan Alikuot sebanyak 0,1 mL ke setiap
tabung reaksi dan dicampurkan. Untuk meminimalkan gangguan buffer dan pengenceran
konsentrasi antimikroba, volume inokulum dijaga pada 1% dari total volume. Setelah 3 menit,
sampel 1 mL dikeluarkan dan dinetralkan. Pengenceran selanjutnya dilakukan dengan dilapisi
rangkap tiga. Plat yang diinkubasi dan pemulihan dari sampel dinyatakan sebagai log 10 CFU / mL
(unit pembentuk koloni) yang dipulihkan per mL. Pengurangan log mikroba dihitung dengan
mengurangi rata-rata log 10 pemulihan populasi mikroba yang bertahan hidup dari populasi
mikroba awal. Selain itu, aktivitas Produk A dievaluasi terhadap subset dari tiga spesies (masing-
masing dua strain) dari organisme yang resisten terhadap obat dengan adanya muatan tanah organik
5% (panas, serum bovine janin janin yang dilemahkan).

2.1.4. Netralisasi antimikroba

Sampel dinetralkan menggunakan PBDW Butterfield yang mengandung 0,3% lesitin, 1,0% Tween1
80, dan 1,0% Tamol. Efektivitas penetral ditentukan berdasarkan prosedur yang diuraikan dalam
ASTM E1054 [17] menggunakan 1 mikroorganisme Gram-negatif (Escherichia coli, ATCC 11229)
dan 1 mikroorganisme Gram-positif (MRSA, ATCC 33591) menantang mikroorganisme. Pada
akhir waktu kontak, sampel 1- mL dipindahkan ke tabung yang berisi 9 mL penetralisir.
Pengenceran sepuluh kali lipat selanjutnya ditambahkan kedalam PBDW Butterfeld, dan alikuot
rangkap tiga dari pengenceran dipindahkan ke plat,lalu tuangkan TSA (1-mL alikuot) atau keplat
lalu sebarkan TSB + S (0,1 mL alikuot). Semua plat dalam keadaan terbalik dan diinkubasi selama
48 ± 2 jam pada 36 ○ C. Koloni dihitung dan mikroorganisme yang bertahan hidup ditentukan
(CFU / mL). Penetral dianggap efektif jika log 10 CFU / mL . Jadi hasil sampel produk uji adalah
0,3 log 10 lebih kecil dari sampel kontrol viabilitas mikroorganisme uji. Netralisasi dianggap tidak
beracun jika sampel kontrol memiliki toksisitas penetralisir 0,3 log 10 lebih kecil dari kontrol
viabilitas mikroorganisme uji.
2.1.5. Kontrol sterilitas

Plat rangkap tiga dari masing-masing jenis agar diinkubasi pada suhu 36 ○ C selama 48 jam untuk
memeriksa sterilitas. Selain itu, rangkap tiga alikuot 1-mL PBDW dan penetralisasi dilapisi dalam
setidaknya satu jenis agar-agar yang digunakan.

2.2. Prosedur Munculnya resistensi (EoR)

2.2.1. Persiapan inokulasi EoR

Bakteri disub kultur dari kultur stok ke agar dan diinkubasi semalaman pada suhu 36 ± 1 ○ C di
udara ambien. Setidaknya lima koloni dari hasil kultur semalam diinokulasi ke dalam 4 mL
kaldu. 1/10mL suspensi dipindahkan ke 10 mL kaldu dan diinkubasi pada suhu 36 1 ○ C selama 2-
6 jam. Uji suspensi organisme disesuaikan dengan PBDW dengan kisaran 1–2 106 CFU / mL
menggunakan spektrofotometri. Inokulum digunakan dalam 30 menit.

2.2.2. Tes EoR dan kontrol persiapan produk

Produk A dan B diencerkan seperti dijelaskan di atas. Pengenceran seri dua kali lipat dari produk
disiapkan dalam media kultur untuk menghasilkan total sembilan pengenceran terpisah.
Pengenceran disiapkan dan disimpan kurang dari 24 jam sebelum digunakan.

2.2.3. Persiapan media EoR

Untuk setiap tes (Produk A) dan kontrol (Produk C), sepuluh bagian agar-agar 450 mL disiapkan
dengan cairan dan disterilkan dengan uap. Kemudian, 50 mL produk uji atau kontrol pada
pengenceran yang tepat ditambahkan ke campuran dan dicampur dengan lembut (satu volume
masing-masing pengenceran ke sembilan volume agar-agar). Selanjutnya, 50 mL media kultur yang
digunakan untuk mencairkan produk ditambahkan ke agar-agar yang kesepuluh sebagai kontrol.
Campur secara merata dan dituangkan secara cepat kedalam plat.
2.2.4. Tes EoR

Untuk setiap mikroorganisme, per produk, permukaan agar 10 plat yang mengandung pengenceran
produk uji dan kontrol dan plat kontrol yang tidak mengandung zat antimikroba diinokulasi secara
langsung dengan 0,01 mL. Sekitar 104 CFU dipermukaan area dengan diameter 5-8 mm. Plat agar
yang diinokulasi didiamkan tanpa gangguan sampai bintik-bintik inokulum sepenuhnya diserap dan
diinkubasi pada 36 ± 1 ○ C selama 18-20 jam.

2.2.5. Pemulihan EoR

Sebanyak 2 CFU yang terdapat dipermukaan area yang diinokulasi dianggap positif. Organisme
yang bertahan dari konsentrasi non-penghambatan maksimum (MNC) yang diulang dua kali dalam
medium yang mengandung konsentrasi produk yang sama. Dua hingga lima koloni dipindahkan
dari plat yang sesuai ke kaldu. Suspensi disesuaikan menjadi sekitar 1-2 CFU / mL menggunakan
spektrofotometri. Inokulum digunakan dalam 30 menit. Sekitar 1,0 ×10⁴ CFU (0,01 mL) diterapkan
pada area yang berdiameter 5-8 mm (seperti yang dijelaskan dalam uji EoR di atas). Penyelesaian
dua lipatan selanjutnya dari produk disiapkan, dengan konsentrasi terendah setara dengan MNC
yang diamati pada langkah sebelumnya; pengujian diulang menggunakan seri pengenceran baru.
Karena MIC dari pengenceran baru tidak berstandar dibandingkan dengan MIC awal, pengujian
dihentikan dan produk tidak dianggap memiliki potensi untuk mengembangkan resistansi.

2.2.6. Kontrol negatif / positif EoR

Negatif : Plat duplikat disiapkan dari kontrol (media kultur 50 mL + agar 450 mL) diinkubasi
dengan plat uji.
Positif : Untuk setiap mikroorganisme, duplikat plat yang disiapkan dari kontrol, yang diinokulasi
seperti dijelaskan untuk plat uji dan diinkubasi dengan plat uji.

2.2.7. Inokulum EoR menghitung kontrol

Sebuah alikuot 1 mL dari inokulum uji mikroorganisme diencerkan secara seri sepuluh kali lipat
dalam PBDW. Pengenceran yang dipilih dilapisi agar-agar yang sesuai dalam rangkap tiga. Semua
plat dibiarkan mengeras, lalu dibalik dan diinkubasi dengan percobaan.
2.2.8. Konfirmasi EoR dari uji mikroorganisme

Konfirmasi dari masing-masing uji organisme dilakukan melalui perbandingan koloni dari kontrol
inokulum dan plat uji. Pewarnaan Gram dilakukan pada koloni yang terisolasi dari kontrol positif,
dan setiap koloni yang mencurigakan dicatat pada plat uji. Prosedur ini memastikan kemurnian
masing-masing uji mikroorganisme. Kriteria penerimaan uji : percobaan dianggap dapat diterima
jika kontrol positif menunjukkan pertumbuhan pada uji mikroorganisme dan jika kontrol negatif
tidak menunjukkan pertumbuhan apa pun.

2.3. Prosedur cross-resistance

2.3.1. Persiapan inokula resistansi silang

Ini dilakukan seperti yang dijelaskan dalam prosedur resistensi diatas.

2.3.2. Cross-resistance Etest ⁻¹

Plat Etest⁻¹terdiri dari gradien konsentrasi antibiotik yang telah ditentukan pada strip plastik dan
digunakan untuk menentukan MIC dari antibiotik. Satu perangkat MHA untuk pelengkapan
organisme dapat dipisahkan dalam lintas pola. Plat Etest⁻¹ yang sesuai ditambahkan ke plat sesuai
petunjuk pabrik. Plat itu diinkubasi pada suhu 36 1 ○ C selama 20-24 jam dan diamati
pertumbuhannya. Itu zona hambatan diukur dan dilaporkan sebagai MIC yang setara.

2.3.3. Pengenceran kaldu MIC cross-resistance

Untuk setiap organisme yang berlaku, 12 pengenceran penisilin dua kali lipat disiapkan dalam
MHB. Sebanyak 2 mL dari setiap pengenceran ditempatkan ke dalam tabung steril dan diinokulasi
dengan 0,05 mL dari 1:10 pengenceran salah satu uji organisme . Tabung diinkubasi pada 36 ± 1 ○
C selama 20-24 jam. Tabung reaksi menunjukkan pertumbuhan pada tingkat antibiotik yang paling
terkonsentrasi yang melesat ke MHA dan diinkubasi pada suhu 36 1 ○ C selama 20-24 jam
bersamaan dengan tabung kontrol viabilitas.

2.3.4. Kontrol resistansi silang

Kontrol sterilitas: Satu plat Etest⁻¹ yang mewakili masing-masing antibiotik ditambahkan ke plat
MHA steril dan diinkubasi dengan percobaan. Selain itu, duplikat alikuot 1-mL PBDW dan MHB
dilapisi pada MHA.
Kontrol viabilitas: Sebuah tabung tunggal yang mengandung 2 mL MHB diinokulasi dengan 0,05
mL organisme dan diinkubasi dengan percobaan.
Kontrol negatif: Sebanyak 2 mL masing-masing cairan penisilin yang disiapkan dilepaskan ke
dalam tabung steril dan diinkubasi sebagai tes. Ini menentukan sterilitas antibiotik dan berfungsi
sebagai perbandingan untuk penentuan pertumbuhan (mis. Sedimen atau kekeruhan kadang-kadang
dapat disebabkan oleh zat uji atau antibiotik itu sendiri). Konfirmasi organisme: Untuk setiap
organisme, pewarnaan Gram dilakukan dari plat Etest⁻¹ dan kontrol viabilitas
garis.Karena sifat data, tidak ada analisis statistik dari hasil yang dilakukan. Peningkatan MIC
empat kali akan dianggap signifikan dan ini tidak diamati.

Pembahasan

DAFTAR PUSTAKA

1.Garibaldi RA, Skolnick D, Lerer T, Poirot A, Garibaldi RA, Barbour AG, et al. The impact of
preoperative skin disinfection on preventing intraoperative wound contamination. Infect Control
Hosp Epidemiol 1988;9:109-13.

2.Crosby CT, Mares AK. Skin antisepsis: past, present and future. J Vasc Access Devices
2001;6:26-31.

3. Hemani ML, Lepor H. Skin preparation for the prevention of surgical site
infection: which agent is best? Rev Urol 2009;11:190–5.

4. Maiwald M, Chan ES. The forgotten role of alcohol: a systematic review and meta-analysis of
the clinical efficacy and perceived role of chlorhexidine in skin antisepsis. PloS One
2012;7:e44277.

5. Zhang D, Wang XC, Yang ZX, Gan JX, Pan JB, Yin LN. Preoperative chlorhexidine versus
povidone-iodine antisepsis for preventing surgical site infection: A meta-analysis and trial
sequential anal- ysis of randomized controlled trials. Int J Surg 2017;44:176e84.

6. Septimus EJ, Schweizer ML. Decolonization in prevention of health care-

associated infections. Clin Microbiol Rev 2016;29:201–22.
7. Bhardwaj P, Ziegler E, Adams H, Palmer KL. Chlorhexidine induces VanA-
type vancomycin resistance genes in enterococci. Antimicrob Agents Chemother
2016;60(4):2209–21.

8. Gadea R, Glibota N, Perez Pulido R, Galvez A, Ortega E. Adaptation to

biocides cetrimide and chlorhexidine in bacteria from organic foods: association
with tolerance to other antimicrobials and physical stresses. J Agric Food Chem
2017;65:1758–70.

9. Velazquez-Meza ME, Mendoza-Olazaran S, Echaniz-Aviles G, Camacho-

Ortiz A, Martinez-Resendez MF, Valero-Moreno V, et al. Chlorhexidine whole-
body washing of patients reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus
and has a direct effect on the distribution of the ST5-MRSA-II (New
York/Japan) clone. J Med Microbiol 2017;66:721–8.

10. Wand ME, Bock LJ, Bonney LC, Sutton JM. Mechanisms of increased
resistance to chlorhexidine and cross-resistance to colistin following
exposure of klebsiella pneumoniae clinical isolates to chlorhexidine.
Antimicrob Agents Chemother 2017;61.

11. Williamson DA, Carter GP, Howden BP. Current and emerging topical
antibacterials and antiseptics: Agents, action, and resistance patterns. Clin
Microbiol Rev 2017;30:827–60.

12. Milestone AM, Passaretti CL, Perl Tm. Chlorhexidine: memperluas

armamentarium untuk pengendalian infeksi dan pencegahan. Clin
Menginfeksi Dis. 2008; 46 (2): 274-281.

13. Edmiston CE J, Seabrook GR, Johnson CP, Paulson DS, Beausoleil C.

Perbandingan dari 2% chlorhexidine glukonat diresapi kain baru dan inovatif
dengan 4% klorheksidin glukonat sebagai topical antiseptic untuk persiapan
kulit sebelum operasi. Am J Infect Control. 2007; 35 (2): 89-96.

14. ASTM standar E1173-01. Metode uji standar untuk evaluasi persiapan pra operasi,
precatheterization, atau kulit preinjection. West Conshohocken [PA]: ASTM International; 2009.