----- ISOLASI DAN KARAKTERISASI DNA -------

JURNAL PRAKTIKUM BIOKIMIA

oleh:
Nur Alif Fitriasih (24030116120037)

Bintang Septiani Widia Utami (24030116120038)

Lifiany Annisa (24030116120039)
Arini Khoiriyah (24030116120040)
Siti Hartinah (24030116120041)
Nunung Lailatul (24030116120042)
Faisol Fahmi (24030116120043)

Departemen Kimia
Fakultas Sains Dan Matematika

Universitas Diponegoro
2018
 HALAMAN PENGESAHAN
Laporan Praktikum Biokimia

Judul Praktikum : ISOLASI DAN KARAKTERISASI DNA

Nama : Nur Alif Fitriasih (24030116120037)

Bintang Septiani Widia Utami (24030116120038)

Lifiany Annisa (24030116120039)
Arini Khoiriyah (24030116120040)
Siti Hartinah (24030116120041)
Nunung Lailatul (24030116120042)
Faisol Fahmi (24030116120043)

Semarang, 17 Oktober 2018

Mahasiswa Praktikum,

Nur Alif Fitriasih Bintang Septiani W.U Lifiany Annisa

24030116120037 24030116120038 24030116120039
Arini Khoiriyah Siti Hartinah Nunung Lailatul
24030116120040 24030116120041 24030116120042

Faisol Fahmi
24030116120043

Menyetujui
Asisten Praktikum,

Yunita Triwijayanti
NIM ……………………………
 PERCOBAAN 7

ISOLASI DAN KARAKTERISASI DNA

1. TUJUAN PERCOBAAN

1.1 Memperoleh dan menentukan sifat-sifat (karakter) umum molekul

DNA.

2. DASAR TEORI

2.1 DNA

Asam deosiribonukleat, lebih dikenal dengan DNA, adalah sejenis asam

nukleat yang tergolong biomolekul utama penyususn berat kering setiap
organisme. DNA umumnya terdapat di dalam sel. DNA merupakan suatu
polimer , rekombinasi DNA merupakan suatu proses alamiah denagn unsure-
unsur material genetik (pecahan-pecahan molekul DNA) dipersatukan ke
dalam suatu molekul DNA yang lain. DNA produk dirujuk sebagai suatu DNA
rekombinan (Fessenden, 1986).

DNA merupakan molekul yang amat panjang, terdiri dari ribuan

deoksiribosa nukleotida yang tergabung dalam suatu urutan yang bersifat khas
bagi setiap organisme. Molekul ini biasanya berbentuk rantai ganda.
Kromosom sel kariotik merupakan satu molekul besar DNA yang berikatan
erat menjadi suatu daerah inti atau nukleotida. Sel eukariotik mengandung
sejumlah molekul DNA. Masing-masing pada umumnya memiliki ukuran jauh
lebih besar daripada sel prokariota.molekul DNA dalam eukariota bergabung
dengan molekul protein dan dikelompokan menjadi serabut kromatin di dalam
nucleus, yang dikelilingi sistem ganda yang kompleks. DNA berfungsi untuk
menyimpan informasi genetik seacra lengkap yang diperlukan untuk
menentukan struktur semua protein dari tiap-tiap spesies organisme agar
biosintesis sel dan jaringan berlangsung secara teratur, untuk menentukan
aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya dan untuk menentukan
kekhususan organisme tertentu. Basa purin yang terdapat dalam DNA adalah
adenin dan guanin sedangkan basa pirimidin yang terdapat dalam DNA adalah
sitosin dan timin. Antara basa-basa yang terdapat pada rantai asam nukleat ini
terikat dengan suatu ikatan hidrogen. Adenin dapat membentuk dua ikatan
hidrogen dengan timin (A=T), sedangkan Guanin dan sitosin dapat membentuk
tiga ikatan hidrogen (G C). Ikatan yang terbentuk antara basa-basa tersebut
dapat dilihat dari struktur berikut:

H3 C
N N Sitosin
Timin

O N OH HN N O

H H H H H

HN N O N N H

Adenin Guanin

N N
N N

N N

(Lehningher, 1982).

2.2 Sifat-Sifat DNA

Hart (1963) menemukakan beberapa sifat penting DNA adalah :

1. Mengabsorpsi sinar ultraviolet pada panjang gelombang 260 nm

2. Menunjukan roatsi optis yang kuat
3. Dalam larutan menunjukan viskositas yang tingi katena struktur heliksnya
yang kokoh
4. Mengalami denaturasi akibat adanya pemanasan atau agitasi akibat
pemecahan ikatan hidrogen, pendinginan memperbaki ikatan hidrogen
antara pasangan-pasangan basa.
5. Ikatan hidrogen dapat dipecah dalam pH asam atau basa.
2.3. Struktur DNA

Struktur asam nukleat dapat diketahui lebih terinci lagi. Gugus

hidroksi 3’ dari ribose terikat pada hidroksil 5’ dan ribose berikutnya
melalui ikatan fosfodiester. Tentu saja basa heterosiklik dihubungkan
dengan unit deoksiribosa oleh ikatan N-glikosida. Perlu dicatat bahwa pada
DNA tidak ada lagi gugus hidroksil unit eoksiribosa yang tersisa. Pada
setiap fosfat masih mempunyai satu proton bersifat asam yang biasanya
mengion pada pH 7. Jika proton ada, zat tersebut adalah suatu asam, karena
itulah bernama asam nukleat. Adapun strukturnya adalah sebagai berikut:

NH2

5' N
N
Adenin

O N N
5' NH2
O P O CH2 H
O
4'H H 1' NH
OH 3' 2'
3' Sitosin
H H
O H H N O
5' O
O P O CH2
O
N
OH H H NH Guanin
3'
5' H
H H
O H N N O NH 2
5'
O P O CH2 H3 C
O
NH
OH H H
3'
Timin
H H
O H H N O
5'
O P O CH2
O
4' H H 1'
O- 3' 2'
H H
OH H
 ( Hart, 1963 )

2.4. Struktur Sekunder DNA

Sejak tahun 1938 telah diketahui bahwa molekul DNA mempunyai

bentuk tertentu, karena hasil sinar-x pada analisis DNA menunjukan pola
teratur secara berkala. Penelitian pada tahun 1950 menunjukan hal-hal
penting mengenai struktur DNA. Chargaff menganalisis kandungan baa
DNA dari berbagai organisme dan ia menemukan bahwa komposisinya
selalu sama. Ketika dilakukan penelitian di Cambridge University
ditunjukan sifat-sifat DNA heliks.

Ciri-ciri penting DNA heliks :

1. DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang melingkar menurut satu
sumbu heliks

2. Kedua sumbu heliks bersifat putar kanan dan arahnya berlawanan

menurut ujung-ujung 3’ dan 5’ nya

3. Basa purin dan pirimidin terletak di dalam heliks pada bidang yang
tegak lurus sumbu heliks, sedang gugus-gugus deoksiribosa dan fosfat
terletak di bagian luar heliks

4. Kedua rantai mempunyai pasangan basa purin dan pirimidin

dihubungkan oleh ikatan hidrogen, adenine selalu berpasangan dengan
timin dan guanin selalu berpasangan dengan sitosin

5. Tidak ada pembatasan pada urutan basa di epanjang rantai

polinukleotida, urutan yang pasti menentukan informasi genetik
(Lehningher, 1982).

Tulang belakang molekul DNA adalah suatu rantai panjang yang

terdiri dari molekul gula deoksiribosa yang diikat menjadi satu oleh gugus-
gugus fosfat. Satu ujung rantai mempunyai satu gugus OH pada karbon
 lima, menurut penomoran gula, ujung yang lain mempunyai satu gugus OH
pada karbon nomor 3’.

Tiap molekul gula dalam DNA juga dihubungkan ke satu molekul

cincin heterosiklik, yang biasa dirujuk sebagai basa. Hanya empat basa
utama yang terdapat dalam DNA. Dua sari basa ini adalah pirimidin
tersubstitusi dan dua lagi adalah purin tersubstitusi (Fessenden, 1986).

2.5 Isolasi DNA

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini
bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan.
Proses ini harus dilakukan secara hati-hati agar tidak merusak DNA yang
diisolasi, untuk mengeluarkan DNA dari sel dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti sel baik secara
mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan
pemblenderan atau menggerus dengan mortar, sedangkan cara kimiawi dapat
dilakukan dengan senyawa yang dapat merusak membran sel dan membran
inti, salah satunya adalah detergen.
Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena detergen
dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk
detergen dengan protein-protein kompleks. Ikatan tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofobik, demikian juga dengan
detergen sehinga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Mahmud, 2006).

2.6 Replikasi DNA

Replikasi adalah proses duplikasi DNA secara akurat. genom manusia
pada satu sel terdiri sekitar 3 milyar dan pada saat replikasi harus diduplikasi
secara akurat (persis tidak boleh ada yang salah). Replikasi adalah transmisi
vertical (dari sel induk ke sel anak supaya informasi genetik yang diturunkan
sama dengan sel induk). Replikasi hanya terjadi pada fase S (pada mamalia),
Replikasi terjadi sebelum sel membelah dan selesai sebelum fase M.
 Salah satu sumber kesalahan DNA adalah pada kesalahan replikasi yang
dipengaruhi oleh berbagai factor, diantaranya karena kondisi lingkungan dan
kesalahan replikasi sendiri sehingga menyebabkan terjadinya mutasi. Supaya
replikasi sel dari generasi ke generasi tidak terjadi kesalahan maka perlu ada
repair DNA. Selain karena kesalahan replikasi, DNA juga sangat rentan terhadap
bahan kimia, radiasi maupun panas (hal yang dapat menyebabkan mutasi pada
DNA pada saat replikasi).

Replikasi terjadi dengan proses semikonservatif karena semua DNA

double helix. Hasil replikasi DNA double strand. Kedua DNA parental strand bisa
menjadi template yang berfungsi sebagai cetakan untuk proses replikasi:
Semikonservaative process. Primer strand : Pada 3’ dia akan melepaskan 2P
dipakai sebagai energy untuk menempelkan, tetapi pada 5’ P tidak bisa dilepas
karena ketiga P dibutuhkan sehigga tidak ada energy sehingga tidak pernah terjadi
sintesis dari 3’-5’, tetapi dari 5’-3’, jadi yang menambah selalu ujung 3’.

Perbedaan Replikasi DNA dan Trankripsi DNA. Enzim yang berperan

dalam proses transkripsi dan replikasi berbeda Pada proses transkripsi, enzim
yang berperan RNA polymerase. transkripsi DNA : terjadi pada saat akan terjadi
sintesis protein (ekspresi gen); yang dipakai cetakan hanya salah satu untai
DNA(3’-5’) replikasi DNA : sebelum fase mitosis (fase S) dalam siklus sel; kedua
untai induk dipakai sebagai cetakan untuk di replikasi.

2.7 Proses replikasi DNA

Pertama adanya replication origin, kemudian pembukaan local DNA helix
dan adanya RNA primer synthesis. Replikasi:> ORC menempel pada ACS
(ORI) :> sehingga pilinan membuka dengan bantuan helikase. Helikase akan
menempel untuk membuka pilinan (helix). DNA double helix (bentuk terpilin).
Untuk mereplikasi bila bentuknya terpilin tidak akan pernah bisa sehingga perlu
dibuka pilinannya. Bila membuka pilinan pada salah satu ujung maka ujung yang
lain akan semakin kuat pilinannya sehingga perlu daerah tertentu yang dipotong
untuk membuka pilinan tesebut yang dilakukan oleh helikase. Perlu DNA primase
untuk membuat RNA primer sintesis, karena DNA polymerase tidak bisa
mensintesis tanpa ada primer. Kemudian terjadi proses replikasi. Karena arah
DNA anti parallel maka perlu Leading-strand dan lagging strand. Dari ORI
didapatkan 2 replication fork. Ada ORI dan helikase yang membuka pilinan terus
sampai terbentuk replication bubbleProses replikasi yang di perlukan utama:
1. ORI
2. Helikase

2.8 Denaturasi Dan Renaturasi

Dua buah pita nukleotida yang berbentuk double heliks pada molekul
DNA dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang sangat lunak. Jika suatu
larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau dibubuhi alkali yang kuat,
maka ikatan hidrogen ini menjadi labil dan putus lalu pita spiral dari molekul
DNA itu terbuka. Proses ini dinamakan denaturasi DNA. Jika larutan tersebut
kemudian didinginkan kembali, atau dinetralisir secara perlahan-lahan maka
terbentuk pasangan-pasangan basa itu kembali. Peristiwa kembalinya ikatan
hidrogen antar basa tersebut dinamakan renaturasi (Surya, 1989).

2.9 Sentrifugasi

Sentrifugasi merupakan suatu teknik pemisahan yang dilakukan

berdasarkan sifat partikel dalam medan gaya sentrifugal. Partikel yang berbeda
dalam berat jenis, ukuran dan bentuk akan mengendap searah dengan arah gaya
sentrifugal yaitu arah jari-jari ke luar (menjauhi sumbu). Untuk partikel yang
akan dipisahkan biasanya disuspensikan dalam medium cairyang dimasukan
dalam tabung sentrifugal dan ditempatkan dalam motor yang berputar. Rotor
terdapat pada pusat sumbu simetri (Wirahadikusumah, 1989).

2.10 Analisa bahan

2.10.1 Akuades

Sifat Fisik: Cairan tak berwarna, tak berasa dan tak berbau, berat
molekul 12,016gr/mol, Indeks bias 1,332, Titik leleh 0oC, titik
didih 100oC.
Sifat Kimia: Bersifat Polar, digunakan sebagai pelarut universal.
(Basri, 19

2.10.2 Etanol

Sifat fisk : C airan tidak berwarna, tida berasa dan tidak berbau,
titik didih 78,29 oC
Sifat kimia : mudah terbakar dan menguap, larut dalam air (Basri,
1996)
2.10.3 NaCl
Sifat Fisik: Padatan kristalin putih. Densitas 2,17, titik leleh 801oC,
Titik didih 1413oC
Sifat Kimia: Larut dalam air dan sedikit larut dalam etanol,
dijumpai sebagai mineral dalam air laut .(Daintith, 1994)
2.10.4 Deterjen
Detergen adalah campuran berbagai bahan, yang digunakan untuk
membantu pembersihan dan terbuat dari bahan-bahan turunan
minyak bumi. Dibanding dengan sabun, detergen mempunyai
keunggulan antara lain mempunyai daya cuci yang lebih baik serta
tidak terpengaruh oleh kesadahan air. Dalam Percobaan, deterjen
ini biasa digunakan sebagai inhibitor. (Anonim, 2010)
2.10.5 Bromelin
Bromelin merupakan salah satu jenis enzim protease yang mampu
menghidrolisis ikatan trawbe pada protein atau polipeptida
menjadi molekul yang lebih kecil yaitu asam amino.(Hartadi,
1980)
2.10.6 Eter
Sifat Fisik : Titik leleh -116,3oC, Titik didih 34,6oC
Sifat Kimia: Senyawa yang relative lembam (inert), biasanya tidak
bereaksi dengan asam encer ataupun basa encer, digunakan sebagai
pelarut organik. (Hart, 2003)
3. METODE PERCOBAAN

3.1 Alat
- Pisau
- Mesin Blender
- Kertas saring
- Gelas beker
- Gelas ukur
- Batang pengaduk
- Spatula
- Tabung reaksi
- Rak tabung reaksi

3.2 Bahan
- Sampel (sumber DNA)
- Akuades
- Etanol dingin 96%
- Garam (NaCl, garam dapur)
- Detergen
- Ekstrak papain/bromealin (buah nanas/pepaya muda)
- Eter/heksana

3.3 Cara Kerja

(a) Isolasi DNA dengan Metode Sederhana

 Detergen/Sabun cair

Pelarutan ke dalam 56 mL

Pengadukan selama 15 menit

Pencucian sampel dengan akuades

Pemblenderan 100 g sampel, 200 Ml akuades, 1 g garam dan 10 g buah

Pencampuran 4 mL jus sampel + 4 mL larutan detergen

Pengadukan selama 10 menit

Pemcampuran homogen

Penyaringan campuran

Pemasukkan ke dalam tabung reaksi + penambahan 9 mL etanol 96% dingin

Pengamatan timbulnya DNA ( waktu, warna dan jumlah DNA yang terbentuk)

Pemisahan DNA dengan kertas saring

Analisis pellet DNA

(b) Karakterisasi DNA

 Pellet DNA

Penimbangan

Uji kelarutan Pellet DNA pada akuades, etanol 96%, eter, heksana dan kloroform

Penentuan penyerapan panjang gelombang maksimum (λmax)

Pengamatan proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA

Penentuan absorbansi pada berbagai suhu secara bertahap dan bolak-balik

Pencatatan hasil pengamatan

4. DATA PENGAMATAN

No Perlakuan Hasil

1 Isolasi DNA dengan metode sederhana

- Pemasukan detergen dan 56 mL akuades
kedalam gelas beker
- Pengadukan selama 15 menit
- Penimbangan 100g buah sampel, dan1g
Nacl
- Pencucian sampel dengan akuades
- Pemasukan sampel kedalam blender
- Penambahan 1g NaCl dan 200 mL
akuades
- Pemblenderan selama 10 menit
- Pemasukan sampel dan larutan detergen
kedalam erlenmeyer
- Pengadukan selama 10 menit,
Penyaringan
- Pemasukan filtrat kedalam tabung reaksi
- Penambahan 9 mL etanol,Pengamatan
- Pengambilan pellet DNA

1. Karakterisasi DNA
- Pelarutan pellet DNA dalam berbagai
pelarut: akuades, etanol, eter, n-heksan
dan kloroform
- Penentuan λ maks dan nilai absorbansi
- Penambahan HCl dan pengamatan proses
denaturasi DNA
- Penentuan λ maks dan nilai absorbansi
DAFTAR PUSTAKA