A.

PENDAHULUAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dikenal juga dengan istilah High
Performance Liquid Chromatography (HPLC). KCKT merupakan perangkat peralatan
yang penting dalam perkembangan dunia analisis bahan baku maupun bahan pencemar.
Fungsi utama KCKT pada dasarnya adalah kemampuannya dalam memisahkan berbagai
komponen penyusun dalam suatu sampel. Kinerja tinggi dari kromatografi awalnya
ditentukan oleh ketinggian tekanannya, namun perkembangan teknologi telah
menghasilkan produk kromatografi cair berkinerja tinggi dengan tekanan yang tidak
terlalu tinggi.

KCKT merupakan teknik pemisahan yang masih menjadi idola didunia analisis
saat ini. KCKT digunakan secara luas dalam pemisahan dan pemurnian berbagai sampel
dalam berbagai bidang seperti farmasi, lingkungan, industri makanan dan minuman,
industri polimer dan berbagai bahan baku. KCKT lebih banyak digunakan untuk
keperluan identifikasi (analisis kualitatif), kecuali jika KCKT ini dihubungkan dengan
sebuah spektrometri massa (Mass Spectrometer) atau MS, maka penggunaannya akan
lebih memungkinkan dalam analisis kuantitatif.

Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:

1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen

biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
Komponen KCKT

B. DEFINISI
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif
dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
KCKT paling sering digunakan untuk :
1. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-
asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;
2. Menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses
sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Komatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan teknik pemisahan senyawa
dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase) dengan
menggunakan fase gerak (mobile phase) mengaliri semua ini. Senyawa dalam kolom akan
keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi
kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak
 Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi
puncak. Kedua hal ini berguna untuk :
1. Analisis kualitatif digunakan informasi tR,
2. Analisis kuantitatif digunakan informasi luas
3. Area/tinggi puncak kromatogram
Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :
1. Low pressure (tekanan rendah)
2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).
Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan
ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan
menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76
bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka
harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan
bisa juga terjadi bleeding.
Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom
konstan sehingga KD tetap.

C. PRINSIP DASAR
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai
fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah
pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu
retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya
terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon <
senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan
alkohol < golongan asam.

D. MANFAAT KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi sering kali digunakan untuk beberapa
kepentingan, seperti :
1. Pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa tidak mudah menguap (non volatile)
4. Penentuan molekul-moleku netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa-senyawa yg strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa-senyawa dlm jml sekelumit (trace elements)
8. Menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu
E. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN KCKT
Banyak analisa yang mengutamakan penggunaan KCKT dalam proses kerja
mereka, hal ini dikarenakan KCKT mempunyai beberapa kelebihan dibanding metode
Kromatografi lainnya, diantaranya :
1. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang
dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
2. Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa
dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa
diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan
rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai
pemisahan yang diinginkan.
3. Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat
mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti
Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga
digunakan dalam KCKT.
4. Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom
KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa
dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi,
kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.
5. Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan
KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis
psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk
mengalissis zat – zat tersebut.
6. Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan
dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen
sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat
dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat
dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion
memerlukan prosedur khusus.
Namun, terdapat pula beberapa kekurangan KCKT yang membuatnya tidak
efisien untuk digunakan, yaitu :
1. Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan
dengan spektrometer massa
2. Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan)
yang baik sulit diperoleh
3. Mahal
4. Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
5. Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan
F. RESOLUSI

Merupakan tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan

metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan Untuk hasil
pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara
sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak
tumpang tindih.

Resolusi adalah ukuran dari pemisahan efektif puncak analit yang berdekatan.
Resolusi dua puncak dibantu oleh faktor termodinamika, yang menimbulkan partisi
dan pemisahan (yaitu-K), dan itu adalah balas oleh kinetika, yang dapat menimbulkan
dispersi tambahan puncaknya, membuat puncak yang dinyatakan baik jika dipisahkan
antar dua puncaknya.

G. INSTRUMENT KCKT
Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi
lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam,
detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya.

1. Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan
inert. Wadah ini dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan
 terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini
akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat
mengacaukan hasil analisis.

2. Fase Gerak

Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen
dengan tingkat kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat
KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan
gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam
fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.

Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan
campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi
dan resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel.

Secara umum ada 2 tipe fase gerak:

a. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang
tidak berubah selama percobaan kromatografi
b. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut
yang berubah selama masa kromatografi

Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan
(pelarut/larutan) serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan
untuk mengoptimalkan pemisahan-pemisahan campuran kompleks dari segi
resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah
dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik

daripada cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut
untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan.

Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak

dibedakan menjadi:
a. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya
akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak.
b. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya.
Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya.
 c. Deret eluotrofik yang merupakan deretan nama-nama pelarut yang disusun
berdasarkan kepolarannya, akan sangat membantu kita dalam pemilihan fase
gerak.
Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril.
Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis
alkohol.

3. Pompa
Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak.
Bahan pompa dapat terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu
nilam.
Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk
keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa:
a. Pompa dengan tekanan konstan
b. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum
digunakan.

4. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Untuk mengetahui perbedaan kolom konvensional dan kolom mikrobor
klik disini.

Dalam beberapa hal kolom mikrobor lebih menguntungkan, diantaranya:

a. Kolom mikrobor mengkonsumsi fase gerak hanya 80% dari konsumsi
kolom konvensional. Hal ini disebabkan karena kolom mikrobor
mempunyai kecepatan alir yang lebih lambat (10-100 ul/menit)
b. Aliran fase gerak pada mikrobor yang lebih lambat membuat kolom
mikrobor lebih ideal untuk digabungkan dengan spektrometer massa
c. Sensitivitas kolom mikrobor lebih tinggi karena pelarut yang lebih
pekat, sehingga cocok digunakan dalam analisis sampel berskala kecil,
seperti sampel klinis.
Perbedaan kolom konvensional dan mikrobor akan dijelaskan disini :
I. Fase Diam
Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.

II. Detektor
Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang
bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal
adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah
detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.
Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:
1. Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible
2. Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar
yang sangat kecil
3. Stabil dalam pengoperasiannya
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada
kolom mikrobar.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang luas
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair
ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya
didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan
faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks
bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan
dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini
mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang
proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan
kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan
bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.

a. Detektor Spektrofotometri
Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya,
spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan
memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat
terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.

b. Detektor fluorometri
Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.

c. Detektor elektrokimia
Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana
larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial
pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer
elektron.

5. Perangkat Pendukung Lainnya

Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa
komputer, integrator dan rekorder.
H. JENIS-JENIS KCKT
Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan
menjadi:
a. Kromatografi fase normal.
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar
b. Kromatografi fase terbalik
Fase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan
Fase gerak : bersifat polar
Keuntungan kromatografi fase terbalik :
- Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya
- Senyawa ionic dapat dipisahkan
- Air dapat digunakan sebagi pelarut

Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang
pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18.
Dalam kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi
tidak sekuat interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan
pada silika (fasa diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh
karena itu molekul-molekul polar akan lebih cepat bergerak melalui
kolom. Sedangkan molekul-molekul non polar akan bergerak lambat
karena interaksi dengan gugus hidrokarbon
 DAFTAR PUSTAKA

Shafaati and B.J.Clark.J Pharm. Biomed. 1996 Anal.14,1547-1554

Christian G.D., 2003, Analytical Chemistry, Sixth, John Wiley & Sons Inc,New York

Mulja.Muhammad, Suharman,1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,

Surabaya

Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Skoog,DA,Holler,FJ,and West DM,1994, Analytical Chemistry, Six Edition,Hardcourt

Grace College,Florida

Underwood,A.L, 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, 554, Penerbit Erlangga, Jakarta

Watson, D.G.,1999,Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone,Edinburg