Anda di halaman 1dari 10

LAPORAN PRAKTIKUM 

FISIOLOGI MOLEKULAR 
 
 
 
 
 

SDS PAGE DENGAN SILVER STAINING 
 

DAN ZIMOGRAM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
KHAIRUL ANAM 
P051090031/BTK 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BIOTEKNOLOGI 
SEKOLAH PASCASARJANA 
INSTITUT PERTANIAN BOGOR 
2009 
SDS PAGE DENGAN SILVER STAINING DAN ZIMOGRAM 
 
 
Pendahuluan 
 
Xilanase  merupakan  kelompok  enzim  yang  memiliki  kemampuan  menghidrolisis  hemiselulosa 
dalam  hal  ini  ialah  xilan  atau  polimer  dari  xilosa  dan  xilooligosakarida.  Xilanase  dapat  diklasifikasikan 
berdasarkan substrat yang dihidrolisis, yaitu β‐xilosidase, eksoxilanase, dan endoxilanase (Subramaniyan 
& Prema 2002; Richana 2002).  
Pemecahan  sempurna  xilan  memerlukan  aktivitas  sinergis  beberapa  enzim  hidrolitik 
(hemiselulase),  yaitu  endo‐1,4–ß‐xilanase,  ß‐xilosidase,  α‐glukuronidase,  α–L‐  arabinofuranosidase  dan 
asetilesterase. Endo‐1,4‐ß‐xilanase dapat memecah kerangka dasar struktur xilan, sehingga merupakan 
enzim kunci dalam proses depolimerisasi xilan (Subramaniyan & Prema 2002). 
Selama  dekade  terakhir  ini,  potensi  bioteknologi  dari  aplikasi  xilan  dan  xilanase  telah  menjadi 
perhatian  utama  dari  para  peneliti  karena  aplikasinya  yang  praktis  dalam  bidang  industri  seperti  : 
memproduksi dan mendaur ulang kertas, meningkatkan digestibilitas makanan ternak, industri makanan 
dan minuman, meningkatkan kualitas roti, industri tekstil, produksi biopharmaceutika (Beq et al. 2001; 
Richana 2002). 
 
SDS‐PAGE 
Salah  satu  metode  PAGE  yang  umumnya  digunakan  untuk  analisa  campuran  protein  secara 
kualitatif  adalah  SDS‐PAGE    (Sodium  Dodecyl  Sulfate  Polyacrilamide  Gel  Electroforesis).    Prinsip 
penggunaan  metode  ini  adalah  migrasi  komponen  akril  amida  dengan    N.N`  bisakrilamida.  Kisi  –  kisi 
tersebut  berfungsi  sebagai  saringan  molekul  sehingga  konsentrasi  atau  rasio  akrilamid  dengan 
bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering 
digunakan  untuk  menentukan  berat  molekul  suatu  protein  disamping  untk  memonitor  pemurnian 
protein (Wilson dan Walker, 2000). SDS‐PAGE dilakukan terhadap protein tak larut dengan kekuatan ion 
rendah  dan  dapat  menentukan  apakah  suatu  protein  termasuk  monomerik  atau  oligomerik, 
menetapkan berat molekul dan jumlah rantai polipeptida sebagai subunit atau monomer.  
Penggunaan  SDS‐PAGE  bertujuan  untuk  memberikan  muatan  negatif  pada  protein  yang  akan 
dianalisa.  Protein  yang  terdenaturasi  sempurna  akan  mengikat  SDS  dalam  jumlah  yang  setara  dengan 
berat  molekul  protein  tersebut  (Dunn,1989).    Denaturasi  protein  dilakukan  dengan  merebus  sampel 
dalam buffer yang mengandung β‐merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide), gliserol 
dan SDS (Wilson dan Walker,2000).  Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion 
yang  teikat  sehingga  kompleks  protein‐SDS  memiliki  rasio  muatan  per  berat  molekul  yang  konstan. 
(Hames, 1987).   
Sampel‐sampel  enzim  yang  diinjeksikan  ke  dalam  sumur  gel  diberi  warna  dengan  bromphenol 
biru  yang  dapat  terionisasi.    Fungsi  pewarna  adalah  untuk  membantu  memonitor  jalannya 
elektroforesis.  Berat  molekul  protein  dapat  diketahui  dengan  membandingkan  Rf  protein  dengan 
protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,2000). 
 
Zimogram 
Data  pemurnian  enzim  yang  diperoleh  melalui  elektroforesis  tidak  selalu  menunjukkan  daya 
katalitik enzim sebenarnya karena adanya kontaminan, isoenzim, atau enzim lain dari kelas yang sama.  
Kekurangan  ini  dapat  diatasi  dengan  meneliti  aktivitas  enzim  sesudah  elektroforesis  gel.    Zimogram 
merupakan  cara  menganalisaaktivitas  kitinolitik  yang  sederhana,  sensitif,  dapat  dikuantisasi  dan 
fungsional  (Leber  dan  Balkwil,  1997).    Pada  dasarnya  terdapat  2  model  teknik  zimogram.    Model 
pertama menggunakan substrat yang  terikat pada bahan penahan berupa gel, kertas saring, lembaran 
plastik,  atau  lapisan  substrat  langsung.    Pada  model  kedua,  indikator  diikatkan  secara  kuat  pada  gel 
pemisah  dimana  enzim  subjek  dibuat  inaktif  selama  elektroforesis  dan  diaktifkan  kembali  setelah 
elektroforesis.    Substrat  yang  digunakan  untuk  zimogram  harus  bersifat  kromogenik,kromoforik,  atau 
hasil reaksi enzim dengannya dapat diwarnai (Peach et al., 1993). 
Zimogram  adalah  salah  satu  teknik  elektroforesis  yang  digunakan  untuk  mengidentifikasi 
aktivitas enzim yang dipisahkan dalam gel poliakrilamida.  Secara keseluruhan, prinsip teknik zimogram 
yang  dilakukan  sama,  yaitu  penggunaan  substrat  kitinase  yaitu  glikol  kitin  yang  disertakan  dalam  gel 
pemisah  poliakrilamid,  penggunaan  buffer  renaturasi  agar  protein  melipat  kembali  dan  diberi 
kesempatan untuk menghidrolisis substrat pada kondisi  yang tepat, inkubasi gel dalam buffer dengan 
pH  optimum  enzim.    Gel  divisualisasi  dengan  congo  red  dan  adanya  aktivitas  enzim  ditunjukkan  oleh 
daerah bening dimana substrat telah didegradasi (Kleiner dan Stevenson, 1994). 
Pada percobaan kali ini dilakukan pemisahan dengan SDS PAGE pada hasil fermentasi isolat 234 
P‐16 ataupun isolat 45 I‐3 dengan analisa menggunakan silver staining dan teknik zimogram. 
 
 
Bahan dan Metode 
 
Isolat  bakteri  yang  digunakan  adalah  2  bakteri  koleksi  dari  Laboratorium  Fisologi  Molekular 
Bioteknologi,  Pasca  sarjana  IPB  dengan  kode  koleksi  234  P‐16  dan  45  I‐3  yang  diduga  mampu 
memproduksi enzim xylanase.  

Fermentasi dilakukan dengan mengambil beberapa cockborer kultur mikroorganisme pada media padat. 
Kultur tersebut diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair yang mengandung 0.5 
g xilan, 10.3 g sukrosa dan 1.0 g ekstrak yeast. Kultur fermentasi diinkubasikan pada suhu kamar selama 
5 hari untuk isolate 234 P‐16 dan 8 hari untuk isolate 45 I‐3 dengan penggoyangan pada kecepatan 150 
rpm.  Hasil  fermentasi  dipanen  pada  hari  ke  5  dan  ke  8  karena  pada  hari  tersebut  diketahui  bahwa 
merupakan  hari  dimana  produksi  enzim  xylanase  mencapai  aktivitas  tertingginya  dari  kedua  isolat 
tersebut.  Setelah  waktu  yang  ditetapkan,  kultur  media  di  sentrifugasi  untuk  diambil  larutan 
supernatannya yang merupakan ekstrak enzim kasar. 

Pemekatan  larutan  ekstrak  enzim  kasar  yang  diperoleh  dipekatkan  dengan  metode  pengendapan 
menggunakan larutan aseton pada konsentrasi aseton tertentu. Untuk memperoleh konsentrasi ekstrak 
enzim kasar yang optimal, jumlah aseton yang ditambahkan pada 20 ml enzim ekstrak kasar isolat 45 I‐3 
80  ml  agar  diperoleh  konsentrasi  aseton  80%  (v/v)  sedangkan  untuk  isolat  234  P‐16,  ditambahkan 
aseton sebanyak 90 ml pada 10 ml ekstrak enzim kasar agar diperoleh konsentrasi aseton sebesar 90% 
(v/v).  Campuran  tersebut  kemudian  disimpan  dalam  lemari  pendingin  selama  semalam.  Setelah  itu, 
larutan  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  suhu  4  0C  selama  15  menit.  Endapan  protein  yang 
terbentuk diambil dan dilarutkan dalam 0,02 M bufer fosfat pH 7,0, dengan volume 1 atau 2 ml. 

SDS PAGE terdiri dari 2 bagian yaitu, 4% gel pengumpul dan 10% gel pemisah. Gel‐gel tersebut dibuat 
dengan mencampurkan beberapa larutan sebagai berikut. 

Tabel 1. Gel pemisah dan gel pengumpul elektroforesi dengan menggunakan SDS PAGE 
Komposisi  Gel Pemisah  Gel Pengumpul 
Larutan A  3.3 ml  0.67 ml 
Larutan B  2.5 ml  ‐ 
Larutan C  ‐  1 ml 
H2O  4.17 ml  2.3 ml 
APS 10%  50 ul  50 ul 
SDS 10%  50 ul  50 ul 
Temed  5 ul  5 ul 
 
 
dimana: 
Larutan A dibuat dengan mencampurkan 75 g acrylamide ditambah 2 g bis‐acrylamide lalu tambahkan 
air hingga 250 ml. tempatkan dalam wadah gelap di suhu 4°C. 
Ammonium Per Sulfate (APS) 10% 
Larutan  B  atau  Gel  pemisah  protein  (1.4  M  tris  HCl  pH  8.8)  dibuat  dengan  melarutkan  45.5  g  tris  ke 
dalam 200 ml H2O dan dibuat menjadi pH 8.8 lalu ditambah dengan 1 g SDS lalu volume dibuat tepat 
menjadi 250 ml.  
Larutan C atau gel pengumpul (1 M tris HCL pH 6.8) dibuat dengan cara melarutkan 15.1 g tris dengan 
200  ml  H2O  lalu  larutan  dibuat  menjadi  pH  6.8  kemudian  larutan  ditambah  dengan  1  g  SDS  baru 
ditambahkan H2)O hingga tepat menjadi 250 ml. 
Buffer  Reservoir  (buffer  elektroda)  dibuat  dengan  melarutkan  28.8  g  glysine  ditambahkan  dengan  6  g 
tris dan disesuaikan pada pH 8.3. kemudian ditambahkan 2 g SDS dan larutan ditepatkan menjadi 2 l. 
Loading buffer sampel dibuat dengan mencampur 2 ml mercaptoetanol dengan 4 ml gliserol, kemudian 
ditambah dengan 0.3 g tris dan 2 ml bromofenol blue (0.1% b/v) dalam 20 ml H2O pH dibuat menjadi 
6.8. setelah itu ditambah dengan 0.92 g SDS. 
Preparasi sampel dilakukan sebelum sampel di elektroforesis. Preparasi dilakukan dengan memanaskan 
campuran larutan sampel dengan larutan loading buffer selama 5 menit pada suhu 100°C. 

Elektroforesis dilakukan dengan menempatkan larutan sampel yang sudah dipreparasi dan juga marker 
ke  dalam  sumur  SDS  PAGE.  Elektroforsis  dilakukan  selama  pada  kurang  lebih  4  jam  dengan  tegangan 
konstan sebesar 60 volt. Migrasi diamati dengan pewarna biru bromofenol sebagai tanda.  

Silver staining dilakukan dengan cara merendam gel ke dalam larutan fiksasi 50% asam asetat selama 2 
jam hingga semalaman dengan penggoyangan pelan. Setelah difiksasi, gel dibilas dengan dd H2O selama 
10 menit lalu dicuci dengan larutan etanol 20% selama 3 x 20 menit. Gel dibilas kembali dengan dd H2O 
selama  10  menit.  Kemudian  gel  di  sensitize  dengan  menggunakan  0.05  g/200  ml  Na2S2O3  selama  1 
menit.  Gel  kembali  dibilas  dengan  dd  H2O  selama  3  x  20  menit.  Kemudian  gel  diwarnai  dengan  0.1% 
perak  nitrat  selama  20  menit,  disimpan  pada  suhu  4°C.  gel  dibilas  lagi  dengan  dd  H2O  selama  2  x  20 
menit. Gel kemudian direndam pada larutan pengembang yang terdiri dari 5% Na2CO3 + 0.05% formalin 
+  0.0004%  Na2S2O3.  Ketika  pewarnaan  dengan  larutan  pengembang  dirasa  cukup,  gel  yang  direndam 
diberi larutan stop solution yang berisi 6 ml asam asetat dan 440 ml dd H2O selama 5 menit. Gel dicuci 
dengan dd h2O selama 5 menit. Gel di foto untuk didokumentasi dan di ukur jarak pengembangan pita 
protein sampel maupun marker. 
Zimogram  dilakukan  untuk  mengetahui  aktivitas  xylanase  dalam  gel  dengan  cara  menambahkan  1% 
(b/v)  substrat  birchwood  xylan  ke  dalam  campuran  gel  poli  akrilamid  sebelum  polymerase  gel  terjadi. 
Setelah  elektroforesis  gel  di  renaturasi  dengan  merendam  25%  (b/v)  Triton‐x100  selama  1  jam.  Gel 
kemudian  diinkubasi  dalam  buffer  sitrat  fosfat  pada  pH  dan  suhu  optimum  enzimnya  selama  2  jam. 
Setelah itu diwarnai dengan 0.1% (b/v) pewarna merah kongo selama 30 menit, kemudian dicuci dengan 
NaCl 1M. 

Analisis SDS PAGE pada pengecatan dengan menggunakan perak nitrat dianalisa jarak migrasi pita‐pita 
protein  yang  terbentuk  pada  gel  pemisah.  jarak  migrasi  diukur  dan  dibandingkan  dengan  jarak  yang 
ditempuh  oleh  pewarna  biru  bromofenol.  Sedangkan  untuk  zimogram,  analisa  dilakukan  dengan 
pengamatan terhadap terbentuknya zona bening secara kualitatif pada gel yang melibatkan pewarnaan 
merah Kongo. 
 
Hasil dan Pembahasan 
 
Hasil 
 
Apabila  jarak  migrasi  yang  ditempuh  oleh  pita  marker  dibandingkan  dengan  jarak  migrasi 
penanda pewarna biru bromofenol maka diperoleh nilai rf dari masing‐masing pita yang terbentuk. Dari 
pengamatan diketahui bahwa penanda pada gel pemisah berjarak 6 cm, sehingga diperoleh data sebagai 
berikut.  
 
Tabel 2. Jarak migrasi dari marker beserta niali rf dan berat molekul dari masing‐masing pita 
Jarak Marker (cm)  rf  Marker  BM Marker (kDa)  log BM 
0.7  0.117  116  2.064 
1.7  0.283  66.2  1.820 
2.6  0.433  45.0  1.653 
3.0  0.500  35.0  1.544 
3.4  0.567  25.0  1.397 
4.3  0.717  18.4  1.264 
4.8  0.800  14.4  1.158 
 
Dari data tersebut apabila memasukkan data rf dan log BM dari pita‐pita marker maka diperoleh kurva 
seperti pada gambar 1. Dari kurva log BM vs rf marker diperoleh persamaan regresi, yaitu y = ‐1.333x + 
2.208.  Dari  persamaan  regresi  ini,  maka  diperoleh  berat  molekul  pita  yang  dihasilkan  oleh  sampel 
seperti yang terlihat pada tabel 3. 
 
 
 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gambar 1. Kurva log BM vs rf marker 
 
 
Tabel 3. Jarak migrasi pita protein dari sampel ekstrak enzim kasar pada produksi enzim xylanase 
Sampel (cm)  rf sampel  log BM  BM (kDa) 
5.60  0.93  0.96  9.20 
4.30  0.72  1.25  17.89 
4.80  0.80  1.14  13.85 
5.50  0.92  0.99  9.68 
 
Pada  pengamatan  zimogram  dengan  pewarnaan  merah  Kongo  diketahui  bahwa  ada  pita  dari 
eksrak enzim kasar pada SDS PAGE memberikan zona bening. Pengamatan zona bening pada zimogram 
agak  sulit  karena  penampakan  zona  bening  berlangsung  dengan  cepat  sejalan  dengan  lama  nya 
pewarnaan  dan  pembilasan  dengan  NaCl  1  M,  akan  tetapi  pewarnaan  ini  bersifat  reversible  atau  bisa 
dilakukan kembali setelah pembilasan dengn kembali diberi pewarna merah Kongo (Gambar 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  Gambar 2. Pewarnaan merah Kongo pada Zimogram
 
Pembahasan 
 
SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate‐Polyacrilamide Gel Electrophoresis) merupakan salah satu 
cara  elektroforesis  dengan  menggunakan  gel  poliakrilamida  yang  dikombinasikan  dengan  SDS.  
Penggunaan  poliakrilamida  mempunyai  keunggulan  dibandingkan  dengan  gel  lainnya,  karena  tidak 
bereaksi  dengan  sampel  dan  tidak  membentuk  matriks  dengan  sampel,  sehingga  tidak  menghambat 
pergerakan  sampel  yang  memungkinkan  pemisahan  protein  secara  sempurna.    Selain  itu,  gel 
poliakrilamida  ini  mempunyai  daya  pemisahan  yang  cukup  tinggi.    Penggunaan  SDS  berfungsi  untuk 
mendenaturasi  protein  karena  SDS  bersifat  sebagai  deterjen  yang  mengakibat  ikatan  dalam  protein 
terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga mercaptoetanol.  
Komponen  penting  yang  membentuk  gel  poliakrilamida  adalah  akrilamida,  bis  akrilamida, 
ammonium persulfate dan TEMED (N,N,N’,N’ tetrametilendiamin).  Akrilamida sebagai senyawa utama 
yang menyusun gel adalah merupakan senyawa karsinogenik.  Ammonium persulfate berfungsi sebagai 
inisiator  yang  mengaktifkan  akrilamida  agar  bereaksi  dengan  molekul  akrilamida  yang  lainnya 
membentuk  rantai  polimer  yang  panjang.    TEMED  berfungsi  sebagai  katalisator  reaksi  polimerisasi 
akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein. 
Bis‐akrilamida berfungsi sebagai cross‐linking agent yang membentuk kisi‐kisi bersama polimer 
akrilamida.    Kisi‐kisi  tersebut  berfungsi  sebagai  saringan  molekul  protein.  Perbandingan  antara 
akrilamida  dengan  bis  akrilamida  dapat  diatur  sesuai  dengan  berat  molekul  protein  yang  dipisahkan  .  
Semakin  rendah  berat  molekul  protein  yang  dipisahkan,  maka  semakin  tinggi  konsentrasi  akrilamida 
yang digunakan agar kisi‐kisi yang terbentuk semakin rapat.   
Dalam praktikum ini migrasi protein dengan elektroforesis juga dilakukan pada tegangan 60 volt 
(rendah) dan lama pemisahan kurang lebih 4 jam agar didapatkan molekul protein yang berbeda dapat 
terpisah dengan baik. Penanda migrasi ditentukan dengan pewarna biru bromofenol. 
Pada praktikum ini digunakan 6 protein standar yang telah diketahui berat molekulnya, yaitu β‐
galaktosidase, bovine serum albumin, ovalbumin, lactate dehidrogenase, REase Bsp98I, β‐lactoglobulin 
dan lysozyme dengan berat molekul secara urut seperti pada tabel 2. Dari elektroforesis diperoleh jarak 
migrasi  dari  protein‐protein  standar  yang  kemudian  dibandingkan  dengan  jarak  migrasi  pewarna  biru 
bromofenol maka diperoleh rf. rf yaitu retension factor yaitu faktor retensi atau hambatan yang berarti 
pemisahan  protein  pada  gel  menggunakan  prinsip  penghambatan  terhadap  laju  migrasi  dari  protein‐
protein  tersebut  sehingga  pemisahan  karena  perbedaan  berat  molekul  mengakibatkan  terbentuknya 
pita‐pita pada jarak migrasi yang berbeda satu sama lain dan jarak tersebut di konversi menjadi nilai rf. 
Hubungan  antara  berat  molekul  dan  nilai  rf‐nya  dapat  dilihat  pada  gambar  1.  Dari  hubungan  tersebut 
diperoleh model regresi liniernya, yaitu y= ‐1.333 x + 2.208.  
Dari  analisa  SDS  PAGE  dengan  menggunakan  silver  staining,  maka  diperoleh  molekul  protein 
yang terdapat pada ekstrak enzim kasar dari hasil fermentasi dimana isolat 234 P‐16 menghasilkan satu 
pita pada jarak migrasi 5.6 cm dan isolat 45 I‐3 terdapat 3 pita protein yang masing‐masing berjarak 4.3 
cm,  4.8  cm  dan  5.5  cm,  sehingga  diperoleh  berat  molekul  dengan  cara  melakukan  intrapolasi  pada 
persamaan  regresi  yang  diperoleh  dari  protein  standar  yang  telah  diketahui  berat  molekulnya  seperti 
yang terlihat pada tabel 3.  
 Teknik zimogram ini dapat mendeteksi protein yang masih mempunyai aktifitas katalitik.  Cara 
ini  hampir  sama  dengan  teknik  silver  staining,  yaitu  menggunakan  gel  poliakrilamida  yang 
dikombinasikan dengan SDS.  Perbedaannya terletak pada penambahan substrat pada gel elektroforesis. 
Pada pembuatan gel untuk zimogram,  komposisi gel ditambahkan dengan 1% substrat bircwood xylan 
dengan  tujuan  protein  yang  mengandung  enzim  xylanase  akan  mendegradasi  substrat  xylan  yang 
ditambahkan  sehingga  ketika  dilakukan  pewarnaan  merah  Kongo  diperoleh  zona  bening  pada  pita 
protein  yang  mengandung  enzim  xylanase  seperti  yang  terlihat  pada  gambar  2.  Baik  isolat  234  P‐16 
ataupun  isolat  45  I‐3  ada  pita  protein  yang  memberikan  zona  bening  ketika  diberi  pewarna  merah 
Kongo. 
 
Kesimpulan 
Dari percoabaan, diperoleh, 
1. Analisa SDS PAGE dengan dikombinasi silver staining adalah cara untuk mengukur berat molekul 
protein yang dipisahkan dalam gel SDS PAGE. 
2. Analisa  SDS  PAGE  dengan  teknik  zimogram  adalah  untuk  mengetahui  secara  kualitatif  apakah 
protein yang dipisahkan dengan SDS PAGE mengandung suatu enzim yang bersifat katalitik. 
3. Isolat  234  P‐16  menghasilkan  1  pita  protein  pada  SDS  PAGE  dengan  kombinasi  silver  staining 
dengan rf 0.93 dengan BM protein tersebut sebesar 9200 Dalton. 
4. Isolat 45 I‐3 menghasilkan 3 pita protein pada SDS PAGE dengan kombinasi silverstaining dengan 
masing‐masing rf adalah 0.72, 0.80,.0.92 dengan BM protein tersebut secara berurutan sebesar 
17890 Dalton, 13850 Dalton dan 9680 Dalton. 
DAFTAR PUSTAKA 
 
1. Beg  QK,  Kapoor  M,    Mahajan  L,  Hoondal  GS.  2001.  Microbial  xylanases  and  their  industrial 
applications; a review. J. Appl. Micribiol. Biotechnol. 56:326‐338.  
2. Dunn, m.J. 1989. Determination of total Protein Concentration . di dalam : Protein Purification 
Methods. Harris, E.L.V. dan S. Angal (eds.). IRL Press, Oxford, England. 
3. Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notess. 2nd edition. Hongkong: 
Springger‐Verag. 
4. Kleiner,  D.E.  dan  W.G.S.  Stevenson.1997.  Quantitative  Zymography:  Detection  of  Picogran 
Quantities of Gelatinases. Anal. Biochem.228 : 325‐329. 
5. Leber ,T.M. dan Balkwil, F.R. 1997. Zymography : A single‐step Staining Method for Quantitative 
of Proteolytic Activity on Substrat Gels. Anal. Biochem. 249:24‐28. 
6. Paech, C., T. Christianson, dan K.H. Maurer. 1993. Zymogram of Protease Made With Developed 
Film  From  Nondenaturing  Polyacrylamide  Gels  after  Electrophoresis.  Anal.  Biochem.  208:249‐
254. 
7. Subramananiyan  S,  Prema  P.  2002.  Biotechnology  of  Microbial,  Xylanase:  Enzymology, 
Molecular Biology, and Application. Critical Rev Biotechhnol 22:33‐64. 
8. Wilson  K.  1994.  Protein  and  enzyme  techniques  In  Practical  Biochemistry,  (ed.  Wilson  K  and 
Walker JM), Cambridge University Press. p.161‐226.