Anda di halaman 1dari 23

PANDUAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULAR
PROGRAM STUDI FARMASI FKUB

DISUSUN OLEH:
Valentina Yurina, M.Si
Dra. Diana Lyrawati, M.Si. Ph D. Apt.
Ferri Widodo, S.Si., Apt.
Rudy Salam, S.Farm. Apt.
dr. Dewi Santosaningsih, M.Kes
dr. Dwi Yuni Nurhidayati, M.Kes

PROGRAM STUDI FARMASI


FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2015

0
KATA PENGANTAR

Panduan praktikum Biologi Molekular ini disusun bagi mahasiswa Program Studi Farmasi,
FKUB yang melaksanakan praktikum Biologi Molekular sebagai penunjuang dari mata kuliah
Biologi Molekular.

Praktikum Biologi Molekular diharapkan dapat menambah wawasan dan ketrampilan mahasiswa
dalam teknik-teknik dasar biologi molekular yang umum digunakan.

Sebelum memulai praktikum, mahasiswa diharapkan mempelajari panduan praktikum ini,


termasuk tata tertib praktikum sehingga tujuan praktikum dapat tercapai dan praktikum
berlangsung dengan benar dan memenuhi persyaratan keamanan laboratorium. Penggunaan
sampel biologis dalam praktikum ini menuntut kehatia-hatian dan perhatian penuh dari setiap
mahasiswa karena dapat mengakibatkan resiko kontaminasi yang serius jika tidak diantisipasi
sebelumnya.

Semoga buku panduan praktikum ini dapat berguna bagi mahasiswa dan pengguna lain.

Malang, Juli 2015

Tim Penyusun Panduan Praktikum

Biologi Molekular

1
TATA TERTIB PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULAR

Mahasiswa yang mengikuti praktikum Biologi Molekular diwajibkan mematuhi Tata Tertib
sebagai berikut:

1. Diwajibkan hadir tepat waktu sesuai jadwal praktikum yang telah ditentukan.
2. Mengenakan pakaian sopan dan sepatu tertutup.
3. Mengenakan jas praktikum.
4. Membawa perlengkapan yang tidak tersedia di laboratorium, seperti: tissue, sarung tangan
lateks sekali pakai, dll.
5. Berada dalam laboratorium selama praktikum, kecuali mendapatkan izin dari dosen yang
bertugas.
6. Menjaga kebersihan dan keutuhan alat laboratorium. Bagi mahasiswa yang merusak atau
menghilangkan alat laboratorium diwajibkan mengganti sesuai dengan spesifikasi alat
tersebut maksimum 1 hari sebelum praktikum selanjutnya. Apabila hingga praktikum berikut
belum mengganti alat tersebut maka sanksinya adalah tidak diperbolehkan mengikuti ujian
praktikum.
7. Bekerja dengan jujur dan tertib.
8. Berbicara seperlunya dan tidak gaduh.
9. Maksimum ketidakhadiran mahasiswa dalam praktikum adalah 1 kali pertemuan, apabila
mahasiswa tidak hadir lebih dari 1 kali praktikum sanksinya adalah dianggap tidak lulus
dalam praktikum Biologi Molekular dan harus mengulang praktikum ini pada tahun
berikutnya. Izin yang diterima adalah izin yang tertulis dan dengan alasan yang dapat
dipertanggungjawabkan.
10. Mengembalikan alat laboratorium dalam keadaan bersih dan lengkap.
11. Membuat dan mengumpulkan laporan praktikum sesuai dengan draft yang telah ditentukan.
12. Meninggalkan ruang praktikum dalam keadaan bersih dan rapi.

Tempat praktikum: Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran

2
MATERI PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULAR

TAHUN AKADEMIK 2014/2015

No. Materi

1. Pengenalan dan metode pippeting (18 dan 25 September 2015)

2. Isolasi DNA dan Kuantifikasi DNA ( 2 dan 9 Oktober 2015)

3. Amplifikasi DNA dengan metode PCR (16 dan 23 Oktober 2015)

Karakterisasi DNA dengan elektroforesis agarosa

4. Isolasi protein (13 dan 20 November 2015)

Kuantifikasi protein

5. Karakterisasi protein dengan SDS-PAGE (27 November dan 4 Desember 2015)

Persentase penilaian:

 Diskusi : 10%
 Pengerjaan : 50%  penilaian dari proses dan produk (hasil)
 Post test : 10%
 Laporan : 10%
 Ujian akhir : 20%

3
BAB I

TEKNIK PIPETTING

Tujuan:

 Memahami tujuan penggunaan mikropipet


 Memahami penggunaan mikropipet dengan baik dan benar
 Memahami sistem metrik dalam penghitungan volume kecil

Alat:

 Mikropipet dengan berbagai ukuran


 Tips

Bahan:

 1 mL larutan berwarna merah


 1 mL larutan berwarna hijau
 1 mL larutan berwarna kuning
 1 mL larutan berwarna biru
 Beaker glass
 Aqua bidestilata

Prinsip Dasar:

Penelitian Biologi Molekuler pada umumnya berkaitan dengan volume yang sangat kecil, yaitu
dalam skala microliter. Untuk mendukung penelitian tersebut dibutuhkan suatu peralatan khusus
untuk mengukur dan mengambil sejumlah tertentu larutan, yaitu mikropipet. Penggunaan
mikropipet yang baik dan benar akan meningkatkan keberhasilan suatu penelitian. Mikropipet
yang tersedia saat ini dapat mengambil suatu volume larutan mulai dari 0,25 µL hingga 1000µL.
Ada dua macam mikropipet yang umum digunakan, yaitu single channel dan multi channel
(Gambar 1.1)

Gambar 1.1. Variasi mikropipet (A) Manual single channel micropipette (B) Manual multi
channel micropipette (C) Electronic multi channel micropipette

4
Mikropipet terdiri dari beberapa bagian utama, yaitu: plunger (tombol untuk
menarik/mengeluarkan cairan), ejector button (tombol untuk melepaskan disposable tip), volume
indicator (menunjukkan jumlah cairan yang dipipet), volume adjustment (bagian pengaturan
jumlah cairan yang dipipet), tip attachment (bagian penempelan disposable tip). (Gambar 1.2)

Gambar 1.2. Bagian-bagian pipet

Prosedur:

1. Penggunaan mikropipet dengan berbagai variasi rentang volume

Mikropipet tersedia dalam berbagai rentang volume yang berbeda, yaitu 0,5-10 μL (P-
10), 2-20 μL (P-20), 20-200 μL (P-200), 200-1000 μL (P-1000). Penggunaan pipet harus
tepat sesuai dengan volume cairan yang hendak dipipet.

 Pilih pipet seusai dengan volume yang dimaksudkan, misalnya:

P-20 P-200 P-1000

0 0 0

4 4 4

7 7 7

4.7 μL 47 μL 470 μL

5
A) P-1000 1

0 5

8 0

8 _____ μL

_____ μL

F) P-____

B) P-200

8 19.5 uL

_____ μL

C) P-____

940 μL

D) P-____

50 μL

E) P-20

6
 Tentukan volume yang hendak dipipet dengan mengatur tombol adjusment.
Jangan memutar tombol adjusment lebih besar daripada volume yang tertera di
bagian atas pipet!!
 Tekan pipet pada kotak tips. Penekanan harus cukup kuat untuk mendapatkan
suatu kondisi kedap udara tetapi jangan menggunakan kekuatan berlebihan.
 Tekan bagian plunger hingga pemberhentian pertama, masukkan ujung tip hingga
kurang lebih 2 mm dari permukaan cairan dalam keadaan pipet vertikal. Lepaskan
plunger secara perlahan, tarik ujung tip dari permukaan cairan. Jangan pernah
memegang pipet dalam kondisi horisontal saat tip berisi cairan !!
 Sentuhkan ujung tip pada bagian sisi dalam mikrotube kosong, tekan plunger
hingga pemberhentian kedua. Upayakan semua cairan keluar keluar dari tip
 Buang tip dengan menekan tombol ejector

2. Penggunaan mikropipet dengan akurat dan presisi


 Beri label 3 microtube kosong (A.B.C)
 Pipet sejumlah larutan berwarna sbb pada ketiga tabung

Tabung Cairan Cairan Cairan biru Cairan hijau Total volume


merah (μL) kuning (μL) (μL) (μL) (μL)
A 20 50 20 0
B 45 25 0 75
C 25 0 85 25

 Ketukkan tabung pada meja hingga semua cairan terkumpul.


 Jumlahkan volume total pada masing-masing tabung
 Set volume pipet sesuai jumlah volume total
 Pipet cairan sejumlah volume total masing-masing tabung, cek apakah tersisa
cairan di dasar tabung atau terdapat udara di ujung pipet.

7
BAB II

ISOLASI DNA TOTAL

Tujuan:

1. Memahami konsep isolasi DNA total dari sel manusia


2. Melakukan isolasi DNA total dari sel manusia

Prinsip:

DNA total dapat diperoleh dari sel tanaman, bakteri, atau dari organismen lain yang hendak
dipelajari. Secara garis besar, proses isolasi DNA total terdiri dari empat tahap, yaitu:

 Lisis sel, baik dengan metode fisik (secara mekanik) atau kimiawi (menggunakan
senyawa tertentu yang menyebabkan sel lisis, misalnya lisosim dan EDTA)
 Ekstraksi DNA sehingga terpisah dari komponen sel lain, dapat digunakan
menggunakan pelarut organik (misalnya fenol dan kloroform) atau dengan metode
kromatografi
 Pemekatan DNA total, pada umumnya menggunakan presipitasi etanol

Bahan:

 Rambut manusia (5 helai yang dicabut beserta bagian akarnya)


 Apusan bukal manusia
 Larutan saline (larutkan20 gram garam dalam 200 mL air)
 Proteinase K
 TE buffer (harus dibuat segar, maksimal 1 jam sebelum penggunaan):
o 1 ml 1 M Tris HCl
o 0.2 ml 0.5 M Na2EDTA
o Tambahkan aquadest sehingga volume akhir 100 ml
o Adjust dengan larutan buffer hingga mencapai pH 8.0

Alat:

 Sentrifuga
 Water bath
 Mikropipet
 Wadah penampung

8
Prosedur isolasi DNA dari sel bukal manusia:

1. Peserta praktikum yang hendak diambil sampelnya berkumur dengan cairan saline 10 mL
selama 60 detik. Keluarkan cairan saline dan tampung dalam wadah yang disediakan.
2. Putar wadah perlahan untuk meresuspensi sel kemudian ambil sampel sebanyak 1,5 mL
dan masukkan ke dalam mkirotube
3. Sentrifuga cairan sampel selama 2 min pada kecepatan maksimal.
4. Buang supernatannya kemudian ulangi prosedur 2 dan 3 sebanyak 2 kali.
5. Resuspensi sel bukal dengan 140 uL buffer lisis kemudian homogenasikan dengan
vorteks, tambahkan 10uL proteinase K 20mg/mL
6. Inkubasi sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C
7. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik
8. Inkubasikan sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 99⁰C
9. Sentrifuga sel lisat selama 2 menit pada kecepatan 6000 rpm
10. Pindahkan supernatan pada tabung mikrosentrifuga
11. DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (simpan di suhu - 20⁰C)

Gambar 2.1. Prosedur isolasi DNA total dari sel bukal manusia (Sumber: VNTR Human
DNA typing Using PCR (Edvotek))

9
Prosedur isolasi DNA dari rambut manusia:

1. Ambil 5 helai rambut, termasuk bagian akarnya (lihat gambar).


2. Potong rambut sepanjang 1cm dari bagian akar rambut.
3. Gunting menjadi bagian yang lebih kecil.
4. Sentrifuga dengan kecepatan maksimal selama 10 detik untuk mengumpulkan potongan
rambut pada bagian bawah tube.
5. Resuspensi potongan rambut dengan 140 uL buffer lisis (pastikan semua potongan
rambut terendam buffer lisis), tambahkan 10ul Proteinase K 20mg/mL.
6. Inkubasi sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C.
7. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik.
8. Sentrifuga sampel pada kecepatan maksimal selama 10 detik.
9. Inkubasikan sampel pada waterbath selama 15 min pada suhu 55⁰C.
10. Pindahkan pada waterbath bersuhu 99 ⁰C kemudian inkubasikan selama 10 menit
11. Homogenasikan sampel dengan vorteks selama 20 detik.
12. Sentrifuga sel lisat selama 2 menit pada kecepatan 6000rpm.
13. Pindahkan supernatan pada tabung mikrosentrifuga.
14. DNA siap digunakan untuk proses selanjutnya (simpan di suhu - 20⁰C)

Gambar 2.2. Prosedur isolasi DNA total dari rambut manusia (Sumber: VNTR Human
DNA typing Using PCR (Edvotek))

10
BAB III

KUANTIFIKASI DNA

Tujuan:

1. Mempelajari prinsip dan metode penghitungan konsentrasi DNA dengan menggunakan


spektrofotometer UV-Vis
2. Melakukan kuantifikasi DNA menggunakan spektrofotometer UV-Vis

Prinsip:

DNA murni memiliki kemampuan untuk menyerap absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
karena adanya basa-basa purin dan pirimidin yang menyusun DNA. Untuk menghitung
konsentrasi DNA dalam suatu sampel dapat digunakan penilaian berikut ini:

1 O.D. pada 260 nm untuk double-stranded DNA = 50 ng/ul of dsDNA

1 O.D. pada 260 nm untuk single-stranded DNA = 20-33 ng/ul of ssDNA

1 O.D. pada 260 nm untuk RNA molecules = 40 ng/ul of RNA

Maka untuk menghitung konsentrasi DNA digunakan persamaan berikut ini:

Konsentrasi DNA = A260 nm x 50 x fakor pengenceran

Di lain pihak, senyawa fenol dan protein dapat menyerap absorbansi pada panjang gelombang
280 nm. Dengan demikian adanya kontaminan protein/fenol pada sampel DNA/RNA dapat
dihitung dengan menggunakan persamaan:
𝑛𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 260 𝑛𝑚
Nilai kemurnian DNA/RNA = 𝑛𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 280 𝑛𝑚

DNA atau RNA yang murni memiliki nilai kemurnian antara 1,8-2,0. Adanya kontaminasi
menyebabkan nilai yang diperoleh akan lebih kecil dari 1,8 sehingga mengurangi nilai
kepercayaan dalam penghitungan konsentrasi DNA atau RNA yang sebenarnya.

Bahan dan Pereaksi:

 DNA yang akan dihitung konsentrasinya


 Aquabidestilata

11
Alat:

 Micropippet dan tips


 Spektrofotometer UV-Vis

Prosedur:

1. Pipet 1 µL sampel DNA yang akan ditentukan konsentrasinya


2. Masukkan ke dalam microtube baru yang telah berisi 99 µL aquadest, homogenkan,
dengan demikian diperoleh sampel dengan faktor pengenceran 100.
3. Ukur absorbansi sampel pada λ 260 nm dan λ 280 nm.
4. Hitung konsentrasi dan kemurnian sampel DNA.

12
BAB IV

AMPLIFIKASI DNA DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION

Tujuan:

 Memahami dan melakukan proses amplifikasi DNA menggunakan metode Polymerase


Chain Reaction

Prinsip:

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu metode amplifikasi atau perbanyakan DNA
pada suatu daerah terget tertentu yang dibatasi oleh sepasang primer (primer forward dan primer
reverse). Pada umumnya proses amplifikasi dilakukan oleh DNA polymerase yang berasal dari
Thermus aquaticus. Proses amplifikasi dilakukan dalam 3 tahap, yaitu denaturasi (pemisahan
untai ganda DNA), anneling (penempelan primer), dan elongasi (perpanjangan untai DNA).
Masing-masing tahapan dilakukan pada suhu yang berbeda-beda.

Aplikasi metode polimerase chain reaction di bidang kesehatan sangat luas, misalnya sebagai
metode pendeteksi patogen atau cemaran dalam produk kesehatan, untuk identifikasi hubungan
kekerabatan, dan untuk deteksi forensik dan deteksi penyakit genetik. Salah satu penggunaan
PCR yang telah lama dikenal adalah identifikasi variable number of tandem repeats (VNTR),
yaitu suatu region pada genome manusia yang sangat bervariasi antar individu. VNTR pada
segmen pYNZ22 (HGM locus Dl 7S30) adalah salah satu segmen dengan tingkat polimorfisme
yang tinggi dan telah banyak digunakan dalam deteksi hubungan kekerabatan dan penyakit
genetik.

13
Gambar 4.1. Proses amplifikasi DNA dengan metode PCR (Sumber:VNTR Human DNA
typing Using PCR (Edvotek))

Bahan:

 DNA template (DNA kromosom total hasil isolasi)


 Primer forward dan reverse (5'-CGAAGAGTGAAGTGCACAGG-3' dan 5'-
CACAGTCTTTATTCTTCAGCG-3') masing-masing dengan konsentrasi 0,5 uM
 dNTP
 Taq DNA Polimerase dan buffer yang sesuai
 ddH2O

Alat:

 Sentrifuga mikro
 Microtube 200 µL steril
 Thermal cycler

14
Prosedur:

Komposisi reaksi PCR:

Buffer PCR 10x 5 L


Primer forward 0,5 M 5 L
Primer reverse 0,5 M 5 L
DNA template 1 g/uL 1 L
dNTP 25 mM 1 L
ddH2O 32,75 L
Taq DNA polimerase 5U/uL 0,25 L
Total 50 L

Prosedur kerja :
1. Selalu gunakan wadah es saat bekerja.
2. Masing-masing komponen PCR dimasukkan ke dalam tabung, gunakan tip yang berbeda
untuk setiap komponen
3. Sampel DNA di kocok/vortex dan kemudian di-spin sebelum digunakan.
4. Tabung dispin sebentar agar semua larutan turun dan bercampur.
5. Tabung dimasukkan ke dalam mesin PCR.
Kondisi reaksi PCR :
Pre-denaturasi : 94 oC selama 5 menit
Denaturasi : 94 oC selama 1 menit
28 siklus
Annealing : 55 oC selama 1 menit
Elongasi : 72 oC selama 1 menit
Post-elongasi : 72 oC selama 10 menit
Penyimpanan : 4 oC

6. Hasil PCR selanjutnya dielektroforesis dan diamati di bawah sinar UV.

15
BAB V

KARAKTERISASI DNA DENGAN ELEKTROFORESIS AGAROSA

Tujuan khusus:

 Mempelajari dan melakukan karakterisasi DNA dengan menggunakan elektroforesis


Agarosa
 Menentukan ukuran DNA hasil elektroforesis dengan menggunakan metode logaritmik

Prinsip:

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan DNA berdasarkan ukurannya di bawah medan


elektrik. Molekul DNA bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke kutub positif saat diletakkan di
dalam suatu medan elektrik. Jarak migrasi masing-masing molekul DNA pada suatu media akan
berbeda-beda tergantung pada ukurannya. Media yang dapat dipakai adalah gel agarose,
poliakrilamid, atau campuran keduanya. Media tersebut berupa suatu polimer berpori di mana
besar pori ditentukan oleh konsentrasinya. Semakin tinggi konsentrasi polimer maka pori yang
terbentuk semakin kecil. Dengan demikian DNA yang berukuran besar akan memiliki jarak
migrasi yang lebih pendek dibandingkan DNA berukuran kecil pada suatu media dengan
konsentrasi yang sama. DNA yang telah bermigrasi divisualisasi dengan metode tertentu, di
antaranya dengan staining Etidium bromide atau cyber green di bawah iradiasi ultraviolet.

Bahan:

 Agarosa
 DNA yang akan dikarakterisasi
 DNA marker/ DNA ladder
 Etibium bromida (EtBr)
 Buffer elektroforesis (Tris Acetate EDTA/ TAE buffer)
 Loading dye

Alat:

 Heater with magnetic strirer


 Electrophoresis horisontal system
 Transluminator UV
 Penggaris

16
Prosedur:

1. Timbang 0,4 g agarose dengan neraca


2. Encerkan TAE 10x hingga diperoleh buffer TAE 1x
3. Larutkan agarose yang telah ditimbang dalam 40 mL buffer TAE 1x, kemudian panaskan
hingga mendidih. Pastikan semua agarose telah larut dalam buffer.
4. Setelah larutan agarose agak dingin (±60⁰C), tambahkan 1µL EtBr, aduk hingga
homogen
5. Tuangkan larutan agarose+EtBr ke dalam cetakan yang telah disiapkan sebelumnya,
pastikan sisir telah terpasang dengan baik dan cetakan terletak pada permukaan yang
datar.
6. Tunggu hingga larutan agarose memadat
7. Setelah larutan agarose menjadi gel padat, masukkan ke dalam chamber elektroforesis.
8. Tuangkan buffer TAE 1x hingga seluruh permukaan gel terendam.
9. Load DNA yang akan dikarakterisasi yang telah ditambah dengan loading dye.
10. Hubungkan elektroda dengan power suply dan atur voltase dan waktunya.
11. Setelah elektroforesis selesai, matikan alat dan ambil gel; pindahkan ke transluminator
UV dan amati hasilnya.

Gambar 5.1. Proses persiapan gel agarosa (Sumber: VNTR Human DNA typing Using
PCR (Edvotek)

17
BAB IV

ISOLASI PROTEIN

Tujuan khusus:

Melakukan isolasi protein dari Staphylococcus aureus

Prinsip:

Isolasi protein merupakan suatu proses untuk memisahkan protein target dari komponen
penggangu lainnya, baik berupa protein lain atau komponen non-protein, sehingga protein target
dapat digunakan lebih lanjut, misalnya untuk dipelajari strukturnya, aktivitasnya, dsb. Materi
yang biasa digunakan dapat berupa jaringan atau kultur bakteri. Isolasi protein diawali dengan
pemecahan sel atau jaringan di mana terdapat protein target, dapat dilakukan dengan metode
fisik, misalnya freeze-thawing atau sonikasi, dan metode kimia dengan menggunakan pelarut
organik. Setelah protein terlarut dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan protein target dari
membran sel, DNA, dsb. Selanjutnya dapat dilakukan metode purifikasi lebih lanjut, misalnya
dengan kromatografi.

Bahan:

 Kultur S.aureus yang ditumbuhkan pada media cair yang sesuai


 Phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4
 NOG (N-octyl-L-D-glucopyranoside)

Alat:

 Sentrifuga
 Mikropipet
 Vortex

Prosedur:

1. Sentrifuga 1,5 mL kultur cair S.aureus dengan kecepatan 3000rpm


2. Buang supernatannya, resuspensi pelet sel dengan PBS sejumlah 15x jumlah pelet.
3. Tambahkan 0,5% NOG.
4. Homogenasikan dengan vorteks selama 1 menit
5. Sentrifuga pada kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4⁰C.
6. Supernatan yang berisi crude protein dapat digunakan untuk analisa berikutnya.

18
BAB VII

KUANTIFIKASI PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD

Tujuan khusus:

Memahami dan mampu melakukan kuantifikasi protein dengan menggunakan metode Bradford

Prinsip:

Metode Bradford merupakan metode analisis protein berbasis kolorimetri yang menggunakan
spektrofotometri UV-vis (595nm). Metode ini menggunakan Commasie Briliant Blue G-250
yang mengalami perubahan warna setelah berikatan dengan protein dalam suasana asam. Secara
umum, metode Bradford dapat digunakan untuk mendeteksi protein dengan rentang
konsentrasi 0 µg/ml to 2000 µg/ml. Keunggulan dari metode ini, diantaranya adalah cepat, tidak
perlu pemanasan sampel, dan memberikan reaksi kolorimetri yang relatif stabil dibandingkan
metode kolroimetri lainnya.

Bahan:

 Reagen Bradford: 100 mg Coomassie Blue G-250 dalam 50 ml 95% ethanol, tambahkan
100 ml 85% (w/v) phosphoric acid, add aquadest 1 Liter
 Protein yang akan dihitung kadarnya
 Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standard

Alat:

 Alat gelas
 Spektrofotometer

Prosedur:

1. Siapkan larutan standard BSA dengan konsentrasi 100µg/ml sebagai larutan baku induk.
2. Siapkan larutan baku kerja BSA, blanko, dan protein sampel sesuai dengan Tabel 1.
(Pengenceran protein perlu dilakukan agar terdeteksi dalam rentang absorbansi linier).
3. Inkubasi larutan selama 5 menit
4. Ukur absorbansinya pada 595nm menggunakan UV-vis spektrofotometer.
5. Tentukan konsentrasi protein sampel

19
Table 1: Jumlah Sampel dan Reagen Bradford

Test Sample Sample vol., Air, Bradford reagent,


µl µl µl
Blank 0 200 800

BSA Standard (10 µg/ml) 20 180 800

BSA Standard (20 µg/ml) 40 160 800

BSA Standard (30 µg/ml) 60 140 800

BSA Standard (40 µg/ml) 80 120 800

BSA Standard (50 µg/ml) 100 100 800

Protein Sample 100 100 800

20
BAB VIII

KARAKTERISASI PROTEIN DENGAN SDS-PAGE

Tujuan:

Memahami proses karakterisasi protein dengan menggunakan metode elektroforesis SDS-PAGE

Prinsip:

SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, merupakan metode


pemisahan protein yang sangat umum digunakan di bidang biologi molekuler. Metode ini
berdasarkan pada mobilitas protein sesuai ukurannya di bawah medan elektromagnetik. SDS
merupakan suatu senyawa surfaktan anionik yang dapat memberikan muatan negatif dan
melinierkan protein. Dengan adanya SDS, semua protein menjadi linier dan bermuatan negatif
sehingga dapat bergerak menuju muatan positif saat dilektroforesis.Setelah dielektroforesis, gel
fdapat distaining untuk menampilkan protein, misalnya dengan Commasie Briliant Blue G-250.

Bahan:

 Akrilamid 30%
 Separating buffer (Tris Cl 1,5 M pH 8,8)
 Stacking buffer (Tris Cl 0,5 M pH 6,8)
 APS (ammonium persulphate)10%
 TEMED ((N, N, N', N'- Tetramethylethylenediamine)
 Buffer elektroforesis

Alat:

 Bio Rad vertical electrophoresis system


 Power suply
 Micropipet+tips
 Heater

Prosedur:

1. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan menggunakan alat Bio-Rad Mini Protean II.


2. Lempengan kaca dan alat pencetak gel (gel sandwich) dibersihkan dan dikeringkan.
3. Gel Sandwich disusun dengan menggabungkan kedua lempengan kaca kemudian untuk
memastikan tidak adanya kebocoran dimasukkan aquadest ke ruang pencetak gel.
4. Disiapkan separating gel 15% (b/v) dan stacking gel 5% (b/v) dengan komposisi seperti
pada tabel di bawah ini :

21
5. APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan dengan
mem-pipet naik-turun secara perlahan. Polimerisasi mulai terjadi pada tahap ini, larutan
harus segera dituang ke gel sandwich.
6. Secara perlahan larutan separating gel dimasukkan ke dalam gel sandwich hingga
mecapai garis batas dengan stacking gel (sekitar 0,5 mm dari ujung sisir pencetak sumur
gel pada stacking gel)
7. Segera dimasukkan aquadest dibagian atas separating gel untuk mendapatkan permukaan
gel yang rata.
8. Separating gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 30 menit).
9. Setelah separating gel padat, aquadest pada bagian atas dibuang
10. Pada stacking gel yang telah disiapkan, ditambahkan APS 10% dan TEMED untuk
memulai proses polimerisasi.
11. Secara perlahan stacking gel dimasukkan ke gel sandwich hingga penuh.
12. Sisir pencetak sumur diselipkan pada stacking gel secara berhati-hati sampai menyentuh
bagian atas dari separating gel.
13. Stacking gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 15 menit).
14. Sambil menunggu gel memadat, sampel protein disiapkan. Ekstrak protein total induksi,
non-induksi dan protein murni diambil dalam jumlah yang setara dan ditambahkan bufer
sampel 5x (20 µL sampel protein, 5 µL bufer sampel).
15. Campuran sampel protein dididihkan selama 5-10 menit. Sampel protein di-spin sebentar
dan siap untuk dimasukkan ke sumur gel.
16. Pada stacking gel yang sudah memadat, sisir pencetak sumur ditarik dan gelembung
udara pada sumur dikeluarkan dengan menambahkan aquadest. Gel dikosongkan
kembali.
17. Gel sandwich yang berisi gel siap pakai dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis dan
chamber diisi dengan bufer elektroforesis hingga sumur penuh.
18. Sampel protein dimasukkan pada sumur sebanyak 20 µL dan juga marka protein.
19. SDS-PAGE dilakukan menggunakan pada tegangan 125 V selama 60 menit. Gel hasil
elektroforesis selanjutnya diwarnai dengan merendam gel dalam staining solution
Coomasie blue selama 15 menit
20. Selanjutnya gel di-destaining untuk menghilangkan sisa staining.

22