METODA ANALISIS SENYAWA ANTIOKSIDAN

Senyawa antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dari

radikal bebas dengan cara menetralisir radikal bebas tersebut. Pengujian aktivitas antioksidan

harus didasari atas efek farmakologis dari zat tersebut diantaranya adalah

1. Menyerupai aktivitas antioksidan endogen seperti SOD sintetis, katalase rekombinan.

2. Menangkap ion logam yang diperlukan untuk tujuan katalisis reaksi oksidasi oleh

radikal bebas seperti deferoksamin.

3. Menangkap (scavenging) atau memutus reaksi rantai (chainbreaking) dari radikal

bebas seperti Vitamin C, E, β-karoten dan senyawa fenol (flavonoid)

4. Menghambat aktivitas enzim-enzim yang terlibat dalam pembentukan radikal bebas

seperti allopurinol.

Analisis suatu senyawa antioksidan dapat dilakukan secara in vitro (di luar sel) dan in

vivo (di dalam sel). Secara in vitro (di luar sel) dapat ditentukan Kapasitas Antioksidannya

sedangkan secara in vivo (di dalam sel) dapat ditentukan aktivitas antioksidan endogennya

seperti aktivitas enzim SOD, GPx dan Katalase atau kadar Malondialdehid dan kadar 8-

OHdG.

Kapasitas antioksidan dapat diukur dengan metoda spektroskopi UV-Vis dengan

mempergunakan DPPH, sedangkan aktivitas antioksidan secara in vivo dapat dilakukan

dengan metoda ELISA dan imunohistokimia.

4.1 Kapasitas Antioksidan

Beberapa metode pengukuran kapasitas antioksidan secara in vitro yang digunakan

dewasa ini adalah beta karoten bleaching, 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl (DPPH Radical

Scavenging) method, Thiobarbituric Acid-Reactive-Substances (TBARS) assay, Rancimat

assay, Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) assay, Total Radical-Trapping

Antioxidant Parameter (TRAP) dan Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) assay,

Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) method, Peroxyl Radical Scavenging

Capacity (PSC) dan Total Oxyradical Scavenging Capacity (TOCS) method dan Folin-

Ciocalteau Total Phenolic Assay dan lain-lain (Zou, et.al., 2004 ; Aicha, et.al., 2006 ;

Mermelstein, 2009).

Klopotek, et.al., (2005) menyatakan bahwa metode FRAP assay dan TEAC assay

yang digunakan untuk mengukur perubahan aktivitas antioksidan buah strawberi segar dan
olahannya memberikan hasil yang tidak jauh berbeda. Penelitian yang dilakukan oleh Gill, et

al. (2002) menghasilkan bahwa aktivitas antioksidan pada buah plum menggunakan FRAP

assay lebih tinggi (40.4 mg sampai dengan 127.2 mg ekivalen vitamin C) dibandingkan

pengukuran dengan DPPH Radical Scavenging Method (27.4 mg sampai dengan 61.1 mg

ekivalen vitamin C). Penelitian lain menunjukkan bahwa analisis aktivitas antioksidan

menggunakan Total Phenolic Assay dan FRAP assay memiliki hubungan positif yang sangat

kuat (R2

= 94.8%) antara daun, batang, dan ekstrak buah tanaman Momordica charantia L

(Kubola and Siriamornpun, 2008).

4.1.1 Pengukuran Kapasitas Antioksidan dengan standar Asam Galat

Analisis Kapasitas antioksidan di mulai dengan pembuatan larutan standar asam galat,

selanjutnya dibuat kurva kalibrasi antara konsentrasi asam galat.dengan berbagai konsentrasi

(0-100 mg/L).. Perlakuan pada sampel dilakukan dengan menimbang 0,1 gram sampel pada

masing-masing sport , selanjutkan diencerkan dengan metanol 99,9% sampai volume 5 mL

dalam labu lalu divortek untuk menghomogenkan larutan , selanjutnya larutan disentrifuge

3000 ppm selama 15 menit.Standar dan supernatan / plasma darah dipipet 0,5 mL dan

ditambahkan 3,5 mL DPPH 0,1 mM dalam pelarut metanol pada tabung reaksi,lalu divortex.

Larutan ini selanjutnya diinkubasi pada suhu 250C selama 30 menit agar DPPH ada waktu

untuk bereaksi dengan atom H yang diberikan atau didonorkan oleh antioksidan sampel,ukur

absorbansinya pada λ mak 517 nm. Kapasitas antioksidan dihitung dengan menggunakan

persamaan regresi linier

y = ax + b (Almey, 2010).

Melalui hasil ini dapat diperlihatkan harga persen hambatan atau IC50 dimana pada

konsentrasi ini senyawa dapat menghambat 50% reaksi oksidasi dari radikal bebas.

4.1.2 Pengukuran Kapasitas Antioksidan dengan DPPH

Pengujian antiradikal bebas senyawa-senyawa bahan alam atau hasil sintesis secara

UV-Vis dapat juga dilakukan secara kimia menggunakan DPPH (difenilpikril hidrazil).

DPPH berfungsi sebagai senyawa radikal bebas stabil yang ditetapkan secara

spektrofotometri melalui persen peredaman absorbansi. Peredaman warna ungu merah pada

panjang gelombang (λ) 517 nm dikaitkan dengan kemampuan minyak atsiri sebagaiantiradikal bebas.
Penggunaan metode spektroskopi ini sudah divalidasi dengan pengukuran
beberapa antiradikal bebas yang umum seperti tokoferol, vitamin C, pinocembrin, dan

skualen yang memberikan hasil yang signifikan dengan uji antiradikal bebas yang lain.

Keaktifan dari golongan seyawa-senyawa yang berfungsi sebagai antiradikal bebas

ditentukan adanya gugus fungsi –OH (hidroksil) bebas dan ikatan rangkap karbon-

karbon, seperti flavon, flavanon, skualen, tokoferol, β-karoten, vitamin C, dan lain-

lain.(7,10)

Daun sirih digunakan untuk mengatasi sariawan, radang tenggorokan, kanker mulut,

dan lain-lain. Hal ini yang melatar belakangi daun sirih diindikasikan sebagai zat antikanker,

dimana kanker akan muncul bila sel normal mengalami kerusakan sehingga menyebabkan

mutasi ganetik, penyebab dari rusaknya DNA sel normal diantaranya adalah radikal bebas

dan senyawa-senyawa karsinogenik. Ini dikarenakan radikal bebas mampu bereaksi dengan

protein, lipid, karbohidrat atau DNA yang pada akhirnya menyebabkan kanker, penuaaan

dini, peradangan, jantung koroner, dan lain-lain. Untuk itulah diperlukan zat antioksidan

yang mampu bereaksi dengan radikal bebas.

Kapasitas antiradikal bebas DPPH diukur dari peredaman warna ungu merah dari

DPPH pada panjang gelombang 517 + 20 nm. Perhitungan kapasitas antiradikal bebas

sebagai persen peredaman (% peredaman DPPH) absorbansi pada puncak 517

menggunakan persamaan berikut ini :

x 100%

absorbansi hitung DPPH

absorbansi hitung sampel 1-

Absorbansi hitung sampel dan DPPH pada puncak 517 mn dapat dihitung

menggunakan persamaan berikut ini :

2

AA

A-

497 537

517

Nilai 0% berarti tidak mempunyai aktivitas antiradikal bebas, 100% berarti peredaman

total dan pengujian perlu dilanjutkan dengan pengenceran sampel untuk mengetahui
bataskonsentrasi aktivitasnya. Suatu bahan dapat dikatakan aktif sebagai antiradikal bebas

bila prosentase peredamannya lebih dari atau sama dengan 50%.