EPA = eicosapentaenoic acid
Hal
EPA-ME = EPA methyl ester
m-CPBA = m-chloroperbenzoic acid
NPSC = normal phase short column
Sintesis dan NMR karakterisasi metil ester dari monoepoxides asam eicosapentaenoic
Sitokrom P450 enzim berjenis hemeprotein yang berfungsi sebagai katalis oksidator
pada metabolisme steroid, asam lemak, xenobotik, obat, racun, karsinogenik.
Metode Sintesis
Di bawah nitrogen, EPA (1g) dikonversi menjadi EPA-ME dengan penambahan asetil
klorida (1.25mL) dalam anhidrat metanol (25 mL) dengan pengadukan pada suhu
kamar selama 1,5 jam. Penghapusan methanol dilakukan dengan mengurangi tekanan
dan ekstraksi dengan CH2Cl2 ( 2 × 5 mL) memberikan EPA-ME sebagai minyak
kuning. M-CPBA (3mm) dalam CH2Cl2 ( 2 mL) ditambahkan untuk satu ekuivalen
EPA-ME dan diaduk pada suhu kamar selama 1 menit. Larutan natrium hydrogen
karbonat (5%, 2 mL) ditambahkan, diekstraksi dengan CH2Cl2 ( 2 × 5 mL),
dikeringkan (anhidrat Na2SO4) dan diuapkan pada tekanan rendah untuk memberikan
campuran monoepoxides, polyepoxides dan EPA-ME yang tidak bereaksi. Campuran
dimurnikan dengan kromatografi vakum kolom pendek menggunakan ethyl asetat:
heksana (2:98; 5 × 100mL). Fraksi yang mengandung polyepoxides dielusi dari
kolom dengan gradien langkah heksana: etil asetat (rasio 88:12 menurun sampai
20:80,5 × 100mL fraksi).
Sintesis
Dalam studi ini, EPA dikonversi ke EPA-ME sebelum epoksidasi oleh m- CPBA.
ini dilakukan untuk meminimalkan poliepoksida dan memfasilitasi pemisahan isomer
monoepoksida. NPSC digunakan untuk memisahkan EPA-ME dari monoepoxide
dan poliepoksida turunannya dan sebagian memurnikan monoepoxides regioisomeric
sebelum semi-preparatif NPHPLC. Monoepoxides dielusi pada 2% etil asetat dalam
heksana, sedangkan polyepoxides dan kotoran lainnya dielusi ketika etil asetat
meningkat menjadi 80%; hasil keseluruhan monoepoxides adalah 34%. NPSC
pemurnian meningkatkan resolusi monoepoxides individu dengan HPLC, tetapi hasil
dari isomer individu tidak dioptimalkan.
Monoepoxides dari EPA-ME menjadi sasaran semi-preparatif NP-HPLC
menggunakan heksana:etil asetat (97: 3) dan dielusi sebagai lima fraksi dengan waktu
retensi dari 21 ke 38min. Ini fraksi (senyawa 2 - 6) awalnya dianalisis dengan LC-MS
dan 1 H NMR (300MHz); kotoran berada di bawah batas deteksi, sehingga kemurnian
semua monoepoxides diperkirakan setidaknya 95%. Pada NP-HPLC urutan
monoepoxide elusi adalah 14,15-epoxy, 11,12-epoksi, 8,9-epoksi, 17,18-epoksi dan
5,6-epoksi. Dengan demikian, molekul dengan epoksida terletak di antara dua ikatan
olefinic dielusi sebelum molekul epoksida terletak di antara ikatan olefenic. Waktu
retensi lebih pendek ketika kelompok epoksida lebih dekat ke kelompok metil
terminal dan lebih lama ketika kelompok epoxy lebih dekat ke bagian ester.
Monoepoxides dianalisis lebih lanjut oleh LC-MS / MS menggunakan C 18
reverse-fase kolom dan fase gerak asetonitril / air. Dengan pengecualian dari 5,6-
epoksida, waktu retensi meningkat dengan kedekatan kelompok epoxy ke karboksil
metil ester. Dengan demikian, urutan elusi diamati adalah 17,18-epoksi, 14,15-epoksi,
11.12-epoxy, 5,6-epoksi dan 8,9-epoksi; ketidakstabilan relatif dari 5,6-epoksida
mungkin dipengaruhi urutan elusi.
m/z ion molekul: 332
O O

m/z = 261

Dengan LC / MS, semua epoksida dipamerkan ion molekul [M + H] + di m/z 333.

Dalam kasus senyawa 2, base peak diamati pada m/z 315 (M-H 2O) dan fragmen unik
di m/z 261 (kelimpahan 22) diperkirakan muncul dari sebuah cincin epoksida pada
posisi C17-18 ( 2; Gambar. 2 dan Tabel 1 ).

Dalam spektrum senyawa 2, itu resonansi metil muncul di saya H 1.055ppm, yang
konsisten dengan lokasi cincin epoksida di posisi omega 3. Sinyal pada H 2.8ppm
berkoresponden dengan proton methylenic yang allylic terhadap dua ikatan ganda.
Integrasi sinyal ini mengindikasikan penurunan jumlah proton dari delapan
induk EPA-ME untuk enam senyawa 2, yang konsisten dengan penurunan jumlah
ikatan ganda methylene berdekatan dari lima ke empat; dengan demikian, senyawa 2
adalah metil cis-17,18-epoksi-5Z, 8z, 11Z, 14z-eicosatetraenoate.