Anda di halaman 1dari 3

3.

Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan proses RTqPCR


 Konsentrasi dan tingkat kemurnian RNA pada tahap isolasi RNA total
 Pembuatan primer mix dan reverse transcription mix pada tahap sintesis cDNA
 Melakukan inaktivasi RTase dengan cara pemanasan selama 5 menit pada suhu
±85 ºC, sebelum masuk ke tahap qPCR
 Pembuatan komponen master mix untuk qPCR
 Melakukan proses running di dalam mesin qPCR yang di program sesuai dengan
berikut:

Sumber: Rahardianti dan Maftuti (2017).


5. Cara mengetahui perubahan ekspresi suatu gen
Kuantifikasi ekspresi gen dilakukan melalui real time PCR (qPCR) dengan metode
comparative CT, yaitu dengan menggunakan rumus matematis untuk menghitung
perbedaan tingkat ekspresi pada gen target (Schmittgen & Livak, 2008). Analisis melt
curve pada amplifikasi gen target dan β-aktin dari data yang digunakan dalam perhitungan
ekspresi gen melalui comparative CT juga menunjukkan single peak dengan kisaran Tm
83-84 oC yang mengindikasikan bahwa amplifikasi target telah spesifik (Gambar 1).

Gambar 1. Kurva melt curve pada saat amplifikasi gen PmVRP15 (kiri) dan reference gene
β-aktin (kanan) menunjukkan single peak sebagai penanda spesifitas produk. Sumber:
Agilent (2012).

Dalam kuantifikasi gen secara relatif, perubahan tingkat ekspresi relative (fold
change) > 1 menunjukkan adanya peningkatan ekspresi; sebaliknya jika perubahan
perubahan tingkat ekspresi < 1, maka dinilai terjadi penurunan ekspresi. Nilai angka 1
merupakan kuantitas yang disepakati untuk penetuan gen target (Agilent, 2012).
Daftar Rujukan

Agilent, T. 2012. Introduction to Quantitative PCR: Methods and Applications Guide. IN 70200
D. Totowa: Humana Press Inc.
Rahardianti, R. dan Maftuti, E. 2017. Akurasi Metode Real PCR untuk Analisa Ekspresi Gen
PmVRP15. Jepara: Balai Besar Perikanan Budidaya Air Payau.