Anda di halaman 1dari 19

Nama : Thania Ayu Pramesty

NIM : 180342618029

Offering :I

TASK 1

1. Cari MSDS dan fungsi dari masing-masing chemicals pada protocol isolasi DNA!
Jawab:
Fungsi dari Masing-Masing Chemicals Isolasi DNA
 Digestion Solution = Untuk memutuskan ikatan matriks antar sel, sehingga sel-sel
terpisah dari jaringan (ex: PL1, Protease K, dan RNAse).
 Lysis Buffer = Untuk melisiskan atau memecahkan sel, sehingga DNA dapat
keluar dari dalam sel.
 Washing Buffer = Untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen lainnya.
Misal pelarutnya etanol yang berfungsi untuk melarutkan protein atau materi
lainnya.
 Elution Buffer (Nuclease Free Water) = Untuk melarutkan DNA atau agar ikatan
DNA dan H2O kuat sehingga DNA dan H2O dapat lolos dari penyaring membran
silika. Ikatan antara DNA dengan H2O lebih kuat dibandingkan dengan ikatan
membran silika dan DNA.

MSDS (Material Safety Data Sheet) dari Masing-Masing Chemicals Isolasi DNA
 Disgestion Solution
 Dapat menyebabkan iritasi.
 Dapat menyebabkan ketidaknyamanan pencernaan.
 Dapat menyebabkan iritasi pada saluran pernapasan.
 Dapat menyebabkan iritasi pada kulit.
 Lysis Buffer
 Berbahaya jika tertelan.
 Bahan mungkin mengiritasi selaput lendir dan saluran pernapasan bagian
atas.
 Mungkin berbahaya jika terhirup atau penyerapan kulit.
 Dapat menyebabkan iritasi kulit atau sistem pernapasan.
 Washing Buffer
 Dapat mengiritasi selaput lendir dan saluran pernapasan bagian atas.
 Berbahaya jika terhirup, tertelan, atau terserap kulit.
 Dapat menyebabkan iritasi mata, kulit, atau sistem pernapasan.
 Sifat toksikologis belum diselidiki secara menyeluruh.
 Elution Buffer (Nuclease Free Water)
 Bahan ini, sebagaimana disediakan tidak mengandung zat yang diatur
sebagai zat berbahaya menurut Komprehensif. Kompensasi dan Tanggung
Jawab Terhadap Lingkungan (CERCLA) (40 CFR 302) atau Amandemen
Superfund dan Reauthorization Act (40 CFR 355). Mungkin ada
persyaratan pelaporan khusus di tingkat lokal, regional, atau negara bagian
berkaitan dengan rilis materi ini.

MSDS (Material Safety Data Sheet, lainnya:


 Etanol : Presipitasi
 Protease: Mendegradasi protein

 CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide): proses lisis dinding sel tanaman


 Trizol: mendegradasi protein

 Buffer AW1 dan AW2: Binding (mengikat DNA pada silika)


 PVPP: mengurangi efek polifenol, quinon dan tannin

2. Cari metode dan protocol isolasi DNA selain contoh yang diberikan !
Jawab:
 Isolasi DNA Murni dengan Kit
Pada isolasi DNA di power point membahas tentang salah satu contoh isolasi
DNA pada sampel padat (misal jaringan hewan dan tumbuhan) serta sampel cair
(misal: darah).
 Isolasi DNA Organ dan Darah
(Fatchiyah dkk., 2011)
i. Isolasi DNA Leukosit Metode Salting-out
Prosedur Kerja:
1. Masukkan 2 mL darah ke dalam tabung EDTA-vacutainer, kemudian
goyangkan secara perlahan membentuk angka delapan.
2. Pindahkan darah dari tabung EDTA-vacutainer ke tabung sentrifuga
(tabung polipropilen), tambahkan 6 mL larutan pelisis sel darah merah
(RBC lysis solution) 1x, kemudian inkubasi pada suhu ruang selama 10
menit.
3. Sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm pada suhu ruang selama 10
menit.
4. Ambil supernatan (larutan bagian atas).
5. Jika pelet masih berwarna merah, ulangi lagi prosedur nomor 2 sampai
pelet berwarna putih menandakan adanya sel limfosit. Pelet yang berwarna
putih menandakan adanya sel limfosit. Pelet yang berwarna merah
menandakan masih adanya sel darah merah.
6. Tambahkan pelet dengan 750 µL larutan pelisis sel, kemudian
homogenasikan dengan cara memipet (pipetting).
7. Tambahkan 2 µL RNAse A (10 mg/mL), kocok.
8. Tambahkan 500 µL larutan presipitasi protein (NH4COOH), kemudian
divorteks.
9. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit.
10. Presipitat protein berwarna cokelat muda. Ulangi prosedur nomor 6 jika
presipitat belum terbentuk.
11. Pindahkan supernatan (mengandung DNA) yang diperoleh ke tabung
Eppendorf steril yang sudah berisi 1,5 mL etanol absolut.
12. Kocok tabung secara perlahan sampai sampai benang-benang DNA
berwarna putih. Sedot dengan tip baru dan pindahkan ke tabung baru.
13. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit
untuk mengendapkan DNA.
14. Buang supernatan. Tambahkan pelet dengan etanol 70%, kemudian
sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4ºC selama 15 menit.
15. Buang supernatan, kemudian keringkan pelet dengan inkubator bersuhu
57ºC.
16. Rehidrasi DNA dalam 50-100 bufer TE (pH 7,6), kemudian tempatkan
pada suhu 37ºC selama 2 jam untuk memperoleh DNA terlarut. Pastikan
larutan homogen. Simpan pada suhu −¿20ºC.
17. Ukur kemurnian dan konsentrasi DNA dengan spektrofotometer UV-Vis
pada OD260 dan OD280.

ii. Isolasi DNA dari Organ Hewan


Prosedur Kerja:
1. Timbang 0,5 g organ, masukkan ke mortar yang telah didinginkan, gerus
sampai halus. Atau lakukan dengan sonikator.
2. Tambahkan 0,5 mL buffer lisis dan campurkan sampai homogen.
3. Masukkan homogenat ke tabung 1,5 mL steril, sentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.
4. Tambah pelet pada tabung dengan 1× volume larutan fenol-kloroform,
vorteks sebentar sampai terlarut rata.
5. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 10
menit.
6. Pindahkan supernatan ke dalam tabung 1,5 mL yang baru, tambahkan 1×
volume larutan fenol-kloroform, vorteks sebentar sampai terlarut rata.
7. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 10
menit.
8. Pindahkan upernatan ke dalam tabung 1,5 mL yang baru, tambahkan 1×
volume etanol absolut, kocok dengan tangan dua kali, dan inkubasi pada
suhu ruang selama 5 menit.
9. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.
10. Buang Supernatan, tambahkan pelet dengan 2× volume 70% etanol,
vorteks selama 5 menit.
11. Sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit.
12. Ulangi langkah nomor 9-10 satu kali.
13. Keringanginkan pelet terakhir yang diperoleh pada suhu ruang selama 5
menit.
14. Larutkan pelet dengan buffer TE (pH 7,6) sebanyak 50 L, inkubasi pada
suhu 55ºC, campur dan disentrifugasi dengan kecepatan rendah sebentar
(spindown).
15. Simpan pada suhu −¿20ºC untuk jangka panjang.

 Isolasi DNA Organ dan Darah


(Listyorini dkk., 2020)
a) Isolasi DNA Sel Darah
Prosedur Kerja:
1. Mengambil ± 200 µL
2. Tambahkan 200 µL binding buffer
3. Tambahkan 40 µL Proteinase K, vortex dengan segera
4. Inkubasi 70ºC selama 10 menit
5. Tambahkan 100 µL isopropanol, vortex dengan segera
6. Masukkan campuran dalam high pure filter tube, sentrifugasi 8.000 x g
(7.000 rpm); 1 menit
7. Buang flow through dan buang collection tube, pasangkan filter tube pada
collection tube yang baru
8. Tambahkan 500 µL inhibitor removal buffer; sentrifugasi 8.000 x g (7.000
rpm); 1 menit
9. Buang flow through dan buang collection tube, pasangkan filter pada
collection tube yang baru
10. Tambahkan 500 µL wash buffer, sentrifugasi 8.000 x g (7.000rpm); 1
menit
11. Buang flow through dan buang collection tube, pasangkan filter tube pada
collection tube yang baru
12. Tambahkan 500 µL wash buffer, sentrifugasi 8.000 x g (7.000 rpm); 1
menit
13. Buang flow through dan buang collection tube, pasangkan filter tube pada
collection tube yang baru
14. Sentrifugasi 10 detik, 13.000 x g (11.375 rpm)
15. Buang flow through dan masukkan filter tube pada microsentrifuge baru
16. Tambahkan 200 µL buffer elution (buffer elution harus sudah di inkubasi
pada suhu 70ºC, sentrifugasi 8.000 x g (7.000 rpm) selama 1 menit
17. Buang filter tube, beri label pada tabung microsentrifuge, simpan pada
suhu -20ºC.

b) Isolasi DNA Total Jaringan Hewan


Prosedur Kerja:
1. Mencacah ± 25 mg sampel jaringan
2. Tambahkan 180 µL T1, inkubasi pada suhu 56ºC (1-3 jam/semalam)
3. Tambahkan 200 µL B3, divortex, inkubasi pada suhu 70ºC; 10 menit
4. Tambahkan 210 µL etanol, divortex
5. Pasangkan NucleoSpin Tissue Column dengan Collection Tube, pindahkan
sampel ke dalamnya
6. Sentrifuge 11.000 x g; 1 menit
7. Buang supernatan
8. Tambahkan 500 µL BW, sentrifuge 11.000 x g; 1 menit
9. Buang supernatan
10. Tambahkan 600 µL B5, sentrifuge 11.000 x g; 1 menit
11. Buang supernatan
12. Lakukan sentrifuge kembali pada tube yang kosong 11.000 x g; 1 menit
(untuk mengeringkan membran silica)
13. Buang Collection Tube, pasangkan NucleoSpin Tissue Column dengan
tabung microcentrifuge baru yang steril ukuran 1,5 ml
14. Tambahkan 100 µL BE, inkubasi pada suhu ruang selama 1 menit
15. Sentrifugasi 11.000 x g; 1 menit
16. Buang NucleoSpin Tissue Column, beri label pada tabung
microcentrifuge, simpan pada suhu -20ºC.

3. Jelaskan masing-masing perbedaan dan keunggulan protocol!


Jawab:
 Isolasi DNA Leukosit Metode Salting-out
(Fatchiyah dkk., 2011)
Bahan yang digunakan:
i. Buffer lisis eritrosit (RBC lysis silution): 155 mM NH4Cl; 10 mM
KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA.
ii. Larutan pelisis sel (cell lysis solution): 10 mM Tris-Cl pH 8,0; 25 mM
EDTA pH 8,0; 20% SDS.
iii. Larutan NH4COOH (larutan untuk presipitasi protein): Ambil 3,854 g
NH4COOH tambahkan dengan 10 mL aquades (untuk 10 mL).
iv. Buffer Tris-EDTA (TE) 0,01 M pH 8,0: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
ditambahkan dengan 1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8,0.
v. Buffer Tris-EDTA (TE) 0,01 M pH 7,6: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6)
ditambahkan dengan 1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8,0.

Kelebihan:

 Metode ini dapat dipakai untuk memisahkan protein albumin dari protein globulin
dalam plasma darah. Kelarutan protein dalam garam amonium sulfat atau
amonium asetat sangat bervariasi tergantung pada kekuatan ioniknya dan
konsentrasi amonium yang ditambahkan. Dengan metode salting out protein
globulin akan mengendap sebagai pelet, sedangkan protein albumin terlarut dalam
garam amonium sulfat atau amonium asetat sebagai supernatan.
 Penambahan buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel
DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu.
Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer
TE juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih
rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi
oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi
pada suhu -20ºC. 

 Isolasi DNA Organ dan Darah


(Listyorini dkk., 2020)
Bahan yang digunakan:
i. Darah hewan atau manusia
ii. Kit Isolasi DNA
 Binding Buffer
 Proteinase-K
 Isopropanol
 Inhibitor Removal Buffer
 Wash Buffer
 Buffer Elution

Kelebihan:
Penggunaan isopropanol dalam tahap presipitasi dapat menurunkan kelarutan
asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Penambahan isopropanol akan menghilangkan
molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi. Selain itu,
penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga
memudahkan presipitasi DNA. 

 Isolasi DNA dari Organ Hewan


(Fatchiyah dkk., 2011)
Bahan yang digunakan:
1. Buffer lisis (untuk 100 mL)
100 mM Tris-Cl (pH 8); 2 mM EDTA (pH 8); Nonidet-P40 2,5%.
Tambahkan 10 mg/mL proteinase-K sebelum digunakan.
2. Fenol-kloroform
Fenol : kloroform (25 : 24) yang ditempatkan dalam botol stok berwarna
gelap dan ditutup rapat.
3. Salin buffer fosfat (PBS) 0,15 M pH 7,4
137 mM NaCl ditambahkan 2,7 mM KCl; 8,0 mM Na 2HPO4.7H2O; dan
1,5 mM KH2PO4; kemudian larutkan dalam aquades steril hingga 1 L.

Kelebihan:
Penggunaan kloroform fenol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang
sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.000–50.000 bp).

 Isolasi DNA Total Jaringan Hewan


(Listyorini dkk., 2020)
Bahan yang digunakan:
iii. Jaringan Hewan
iv. Kit Isolasi DNA Hewan
 Pre-Lytic Buffer (T1)
 Lytic Buffer (B3)
 Ethanol (96-100%)
 Washing Buffer (BW & B5)
 Elution Buffer (BE)

Kelebihan:

Pemberian etanol berfungsi untuk melarutkan protein atau materi lainnya dengan
prinsip ikatan silika dengan DNA lebih kuat dibanding ikatan etanol dengan
protein.
TASK 2

1. Jelaskan masing-masing perbedaan dan keunggulan protocol RNA Isolation!


Jawab:

Tabel 1. Konsentrasi total isolasi RNA menggunakan protokol yang berbeda.

Kesimpulannya, terlepas dari protokol yang digunakan, DNAse-I untuk menghindari


kontaminasi gDNA adalah suatu keharusan jika RNA akan digunakan untuk analisis
ekspresi gen seperti RT-PCR. Dalam hal jumlah hasil, EZ-RNA memiliki kelemahan; dan
jika sampel jaringan yang akan digunakan dalam ekstraksi RNA dalam jumlah kecil,
pengguna harus menggunakan metode lain untuk mendapatkan jumlah RNA yang lebih
besar. Protokol berbasis kolom  (UltraCleanTM and E.Z.N.A.®) menghasilkan RNA
kontaminasi gDNA dengan jumlah besar. Karena itu, DNAse-I harus diperlukan. Dengan
protokol TRIzol dan TRItidy-G, jumlah RNA yang diisolasi serupa, namun DNAse-I sangat
disarankan.
TASK 3

1. Cari perbedaan dan keunggulan masing dari Taqman dan SYBR green pada qRT PCR!
Jawab:
 Taqman

Keuntungan dari kimia TaqMan

 Diperlukan hibridisasi khusus antara probe dan target untuk menghasilkan sinyal
fluoresens
 Probe dapat diberi label dengan pewarna reporter yang berbeda dan dapat dibedakan,
yang memungkinkan amplifikasi dan deteksi dua sekuens berbeda dalam satu tabung reaksi
 Pemrosesan pasca-PCR dihilangkan, yang mengurangi biaya pengujian dan biaya
material

Kerugian dari kimia TaqMan

Kerugian utama adalah bahwa sintesis dari probe yang berbeda diperlukan untuk urutan yang
berbeda.
 SYBR

Keuntungan pewarna SYBR

 Ini dapat digunakan untuk memantau amplifikasi dari setiap urutan DNA untai ganda.
 Tidak diperlukan pemeriksaan, yang dapat mengurangi pengaturan pengujian dan biaya
pengoperasian, dengan asumsi bahwa primer PCR Anda dirancang dengan baik dan reaksi
Anda dikarakterisasi dengan baik.

Kekurangan pewarna SYBR

Kerugian utama adalah dapat menghasilkan sinyal positif palsu; yaitu, karena pewarna SYBR
mengikat DNA beruntai ganda, ia juga dapat berikatan dengan sekuens DNA beruntai ganda
yang tidak spesifik. Oleh karena itu, sangat penting untuk memiliki primer yang dirancang
dengan baik yang tidak memperkuat urutan non-target, dan analisis kurva leleh dilakukan.

TASK 4

1. Cari satu artikel ilmiah internasional yang mana di dalamnya menggunakan teknik isolasi
DNA/RNA, PCR, dan elektroforesis.

Kemudian saudara meringkas dengan singkat penelitian tersebut


 Bagaimana dan tentang apa penelitian tersebut?
 Tujuannya apa?
 Metode penelitian yang digunakan (DNA/RNA, PCR, dan elektroforesis),
 Hasil dan kesimpulannya bagaimana?

Jawab:
 Bagaimana dan tentang apa penelitian ini?

Jawab:

Artikel Jurnal yang saya ambil berjudul “Easy and Efficient DNA Extraction from
Woody Plants for the Detection of Phytoplasmas by Polymerase Chain Reaction”.
Penelitian ini membahas tentang prosedur sederhana dan efisien untuk mengekstraksi
DNA dari tanaman berkayu dan herba yang terinfeksi fitoplasma dengan deteksi
Polymerase Chain Reaction (PCR).

 Tujuannya apa?
Jawab:

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memurnikan DNA fitoplasma dari seluruh daun,
tangkai daun, pelepah, akar, dan kayu aktif dari beragam pilihan bahan tanaman.

 Metode penelitian yang digunakan?


Jawab:
Metode penelitian yang digunakan menggunakan teknik isolasi DNA/RNA, PCR, dan
elektroforesis. Dalam tahap prosedur kerja pada penelitian ini tidak memerlukan fenol,
kloroform, atau alkohol untuk pengendapan asam nukleat. Bahan tanaman herba dan kayu
diekstraksi dengan cara yang identik tanpa diperlukan langkah pemurnian atau pengayaan
tambahan. Metode ini menggunakan matriks kolom microspin yang tersedia secara
komersial, dan ekstraksi total DNA dapat dicapai dalam waktu kurang dari 1 jam.

 Hasil dan Kesimpulannya bagaimana?


Jawab:

Elektroforesis gel agarose menunjukkan deteksi reaksi rantai polimerase (PCR) dari
fitoplasma pada pir yang terinfeksi, dimana mengalami penurunan pir (pada jalur 1 hingga
3), persik terinfeksi dimana gulungan daun persik berwarna kuning (jalur 4 hingga 6), barat
penyakit yang terinfeksi cherry X (jalur 7 sampai 9), persik yang terinfeksi roset persik
(jalur 10), apel yang terinfeksi proliferasi (jalur 11), anggur Australia, kuning anggur yang
terinfeksi (jalur 12), dan Periwinkle yang terinfeksi Vaccinium witches’-broom (jalur 13)
dalam total ekstrak DNA dari kedua tangkai daun dan pelepah (jalur 1, 4, 7, 11, 12), seluruh
daun (jalur 13), kayu tidak aktif (jalur 2, 5, 8 , 10), atau jaringan akar (jalur 3, 6, 9). Sampel
kontrol sehat yang ditunjukkan adalah pir (jalur 14), persik (jalur 15), ceri (jalur 16), apel
(jalur 17), anggur (jalur 18), dan periwinkle.

Kesimpulannya adalah fitoplasma yang terdeteksi oleh PCR termasuk penurunan pir,
penyakit X-barat, roll daun kuning persik, peach rosette, proliferasi apel, kuning anggur
Australia, dan Vaccinium witches room.