Methode Amplifikasi

(ELISA)
Prof. Dr.dr. I W P Sutirta Yasa, M.Si
⚫ Tujuan:
⚫ Mahasiswa dapat memahami sistimatika pemilihan
methode pemeriksaan bahan
⚫ Mahasiswa dapat memahami konsep dasar pemeriksaan
zat/ analit memakai metode serologi
⚫ Mahasiswa memahami pengertian tentang metode
amplifikasi
⚫ Mahasiswa dapat memahami perbedaan beberapa metode
pada ELISA
⚫ Mahasiswa memahami pengertian tentang metode RIA
⚫ Mahasiswa memahami pengertian tentang metode Flow
cytometry
Ganbar Sistimatika Pemilihan methode Pemeriksaan Bahan
 Access is an
Immunoassay System
Chemical (Clinical Chemistry)
10-12 10-9 10-6 10-3 10-0

pg/mL ng/mL μg/mL mg/mL gm/mL

Immunological (Immunoassay)
Therapeutic Drugs
Thyroid Hormones
Fertility Hormones
Cardiac Markers
Cancer Markers
Infectious Disease
Vitamins
Allergy Markers
 Basic concepts (konsep dasar)
⚫ Based on : Ab + Ag = Ab:Ag (are not visualized)
⚫ Ab:Ag (in proportions at or near equivalence, can be
seen by color (enzyme, fluorescence, protein stain);
solid phase (ery, bentonite, latex); X ray (α,β,γ : detect
by machinery counter), as marker.
⚫ In vivo similar to in vitro
⚫ Van der Waals Energy : specificity of Ag & Ab
⚫ Columbic Energy : electricity
⚫ Distance between antigen and antibody
⚫ pH, hydrogen, hydrophobic, electrostatic, etc

5
 Bahan: Mana yang lebih baik ?????
Lithium Heparin, putar 3000 rpm,
Serum : tunggu sekitar 30 menit, putar 3000 rpm
simpan dalam beberapa alikuot

The effect of iron deficiency anemia on the function of the immune system
Ceyda Ekiz1, Leyla Agaoglu1, Zeynep Karakas*,1, Nuray Gurel2 and Is¸ık Yalcin3
The Hematology Journal (2005) 5, 579–583. doi:10.1038/sj.thj.6200574
Direct Method
⚫ Metode langsung adalah metode pewarnaan satu langkah, dan
melibatkan antibodi berlabel (misalnya antiserum terkonjugasi
FITC) yang bereaksi secara langsung dengan antigen pada
bagian jaringan.
Teknik ini hanya menggunakan satu antibodi dan prosedurnya
sederhana dan cepat.
Namun, hal itu dapat mengalami masalah dengan sensitivitas
karena sedikit amplifikasi sinyal dan kurang umum digunakan
daripada metode tidak langsung.

Dr. Gihan Gawish

Indirect Method
⚫ Metode tidak langsung melibatkan antibodi primer
tanpa label (lapisan pertama) yang bereaksi dengan
antigen jaringan, dan antibodi sekunder berlabel
(lapisan kedua) yang bereaksi dengan antibodi primer.
(Antibodi sekunder harus mengikat IgG spesies hewan
di mana antibodi primer telah meningkat.) Metode ini
lebih sensitif karena amplifikasi sinyal melalui
beberapa reaksi antibodi sekunder dengan tempat
antigenik berbeda pada antibodi primer. Antibodi lapis
kedua dapat diberi label dengan pewarna fluoresensi
atau enzim

Dr. Gihan Gawish

 JENIS IMUNOASAI
Ada 2 jenis imunoasai.
I. IMUNOASAI TAK BERLABEL
II. IMUNOASAI BERLABEL

I. IMUNOASAI TAK BERLABEL

♦ UJI PRESIPTASI
♦ UJI AGLUTINASI
♦ UJI FIKSASI KOMPLEMEN
♦ UJI NETRALISASI TOKSIN
II. IMUNOASAI BERLABEL
1. CAT FLUORESENS: IF
2. RADIOISOTOP: RIA
3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA )
A. EIA HOMOGEN
B. EIA HETEROGEN (ELISA)
C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE
4. EMAS KOLOIDAL:
ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)
Asai berlabel enzim
Dibandingkan IF & RIA, lebih sederhana,lebih murah, reagen lebih
tahan lama, mudah dibuat otomatisasi

⚫ EIA (Enzyme-Immuno-Assay)
⚫ Asai yang reagent- observed
⚫ Asai yang analyte- observed
⚫ Asai yang reagent- observed untuk pemeriksaan analyte ukuran kecil, mudah
diisolasi, disintesis, dan mudah dilabel, senitivitas asai tidak diperlukan syarat
khusus.
⚫ Asai yang analyte- observed untuk pemeriksaan berat molekul besar, , sukar
dimurnikan untuk pelabelan, dibutuhkan sensitivitas tinggi
⚫ EIA (Enzyme-Immuno-Assay)
⚫ EIA Homogen
⚫ EIA Heterogen

Dasar Imunoasai berlabel : Sutirta Yasa 12

 Metode Amplifikasi, Pemberian Label
Contoh : Enzim, dll

⚫ Pemberian label enzim pada antigen,

⚫ Pemberian label enzim pada antibodi,
⚫ Pemberian label enzim secara imunologis,
(peroksidase-antiperoksidase = PAP)
⚫ Pemberian label enzim pada anti imunoglobulin,
EIA (Enzyme-Immuno-Assay)
⚫ EIA Homogen
⚫ Label enzim pd reagen menunjukkan perbedaan sifat bila berada dlm keadaan
terikat pd lawan reaksinya dibanding berada dalam keadaan bebas, sehingga
tidak memerlukan pemisahan (pencucian) antara yg bebas dan terikat
⚫ Teknik :
⚫ asai kompetitif (analyte , BM rendah banyak dipakai rutin)
⚫ asai non kompetitif

Zat X Kro
mog
Foto
en meter
&
⚫ EIAAg-Berlabel
stop
Heterogen Enzim Tdk Cuci
er

Kro
Zat X mog
en Foto
& meter
Harus Cuci stop
Ag-BerlabelDasar
EnzimImunoasai berlabel : Sutirta Yasa er 14
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) = EIA Heterogen
⚫ Tidak ada perbedaan sifat label enzim bila reagennya berada dalam
keadaan terikat (bound =B) maupun bebas (free =F) shg perlu
pemisahan (pencucian)
⚫ Syarat
Pemisahan Ag-Ab tidak menimbulkan gangguan equilibrium reaksi tsb
Reproduksible
Tidak mengganggu aktifitas marka enzim
Dapat diadaptasikan menjadi automatisasi
⚫ Cara pemisahan:
Presipitasi fraksional (polyethylen glycol 6000 (PEG 6000) 15%; Amonium
sulfat (35-50%), ethanol dingin 60%.
Prisipitasi imunologis : dgn double antibody
Absorpsi : membran ion –exchange, charcoal berlapis dextran, Staphylococus
aureus strain Cowan I atau protein A murni tak larut
Sistem fase padat (solid phase) : sistem permukaan (tabung, butir polisteren);
media fase padat khusus (selulose, butir agarose, partikel magnetik).

Dasar Imunoasai berlabel : Sutirta Yasa 15

What Is An ELISA?
⚫ Teknik ini dirancang untuk
⚫ E- Enzyme memberikan proses yang
⚫ L- Linked sangat sensitif dengan hasil
⚫ I- Immuno yang andal.
Ini menggunakan piring
⚫ S- Sorbent 96-sumur untuk mengukur
⚫ A- Assay protein atau zat berdasarkan
reaksi antigen / antibodi.
What is an ELISA?
⚫ Enzyme-linked immunosorbent assay
⚫ tiga komponen
Antibodi
Memungkinkan untuk deteksi spesifik analit yang
dipentingkan
Fasa padat (sorben)
Memungkinkan seseorang untuk mencuci semua materi
yang tidak ditangkap secara khusus
Amplifikasi enzimatik
Memungkinkan Anda untuk mengubah sedikit tangkapan
menjadi perubahan warna yang terlihat yang dapat diukur
dengan menggunakan pembaca ditampakkan sebagai
absorbansi
What is it used for?
⚫ Measure antibody levels (allergies, vaccines)
⚫ Detect viruses (hepatitis, HIV, venereal diseases)
⚫ Detect hormonal changes (pregnancy)
⚫ Detect circulatory inflammatory markers (cytokines)
Advantages
⚫ Sensitivity
⚫ Quantitative
⚫ Reproducible
⚫ Kit format
 Antibodies

Polyclonal Monoclonal
limfosit B/plasma sel individu diklon dan
Antibodi yang dikumpulkan
dikultur. Antibodi dikumpulkan dari media
dari sera hewan yang terpapar
kultur

recognize
multiple antigenic sites recognize
of injected biochemical. ONE antigenic site
of injected biochemical
Differences of Screening and Confirmatory
Tests.
Screening test Confirmatory test

High degree of Sensitivity High degree of specificity

Few false negatives Few / No false positive

results.
Features of the
Antigen-Antibody Interaction

•Reversibility
Non-covalent Interactions

•Affinity
Measure of the strength of the binding
Ease of association or dissociation

•Avidity
Increase in affinity due to multivalent binding
The summation of multiple affinities
Affinity and Avidity
1. Coat solid phase with
antigen when analysing antibody
antibody when analysing antigen

Analyte = antibody Analyte = antigen

Incubate, wash
2. Block free binding sites. Incubate. Wash.

Analyte = antibody Analyte = antigen

3. Add sample. Incubate. Wash

Analyte = antibody Analyte = antigen

4. Add conjugate. Incubate. Wash.

E E E
E

Analyte = antibody Analyte = antigen

5. Add substrate

6. Incubate, stop, measure colour change

ENZYME

Colourless

OD

CONCENTRATION
AMPLIFICATION
E

Directly conjugated developing

antibody may give weak signal
amplify with
E
E

unlabelled (rabbit) anti-(human) Ig

followed by
anti-(rabbit) Ig-enzyme
 E
or
S
E-S B S-E

Biotin-labelled anti-Ig
followed by
streptavidin-enzyme
Sequence of Events in ELISA test
 Asai kompetitif & asai non kompetitif
Competitive Assay
Foto
Zat X
Kro meter
mog
en

Adsorben
&
stop
Ag-Berlabel Enzim Tdk Cuci
er

Sandwich Assay Kadar Zat

Kro
mog
en
Foto
&
meter
Tdk Cuci stop
er
Adsorben

Kadar Dasar
Zat Imunoasai berlabel : Sutirta Yasa 33
signal/concentration curve

Functional concentration
Signal (enzyme activity)

range

Antigen concentration
 Competitive RIA/ELISA for Ag
⚫ metode
Tentukan jumlah Ab Prior to Test
yang dibutuhkan untuk
+
mengikat sejumlah Ag
yang berlabel Labeled
Ag
Test
• Gunakan jumlah Ag dan
Ab berlabel yang telah + + +
ditentukan dan tambahkan
Labeled Patient’s
sampel yang mengandung Ag sample
Ag yang tidak berlabel
sebagai pesaing
 Specific Ab immobilisation surface

Ag E antigen- enzyme conjugate

Coating Incubation
E
E
E

S
E
E Enzym. reaction

Product
P
measurement
Affinity reaction
I. No analyte - high detection signal

E E E E E E

II. Analyte present - detection signal reduced

E E
Indirect competitive ELISA format

ENZYMATIC
SECONDARY REACTION
FREE Ag and LABELLED S
SPECIFIC Ab Ab
ADDITION
P
ANTIGEN
COATING

BLOCKING

The enzymatic product concentration is inversely

proportional to the analyte (standard or sample)
amount
Different Methods of ELISA testing.
Jenis Tes ELISA:
•Label pada antigen:
•Kompetitif ELISA
•Titration ELISA=Sequential saturation ELISA
•Solid phase anti-IgM ELISA (Ab IgM)
•Label pada antibody:
•Double Antibody Sandwich ELISA
•Inhibition ELISA
•Label pada antiglobulin:
•Indirect ELISA
•Indirect inhibition ELISA
•Double Ab sandwich antiglobulin ELISA= indirect
sandwich ELISA
Thank you ！