Universidad Autónoma de

Coahuila

Escuela de Ciencias Biológicas

Apuntes del curso de

Análisis Instrumental

Dra. Erika Flores Loyola

1
 Índice
Pág.

Unidad I. Introducción al análisis instrumental 3

1.1.Clasificación de los métodos analíticos 3
1.2. Instrumentación en el análisis. 5

Unidad II. La radiación electromagnética y sus interacciones con la

materia. 12
2.1. Naturaleza de la energía radiante. 12
2.2. Teoría ondulatoria y teoría cuántica. 12
2.3. Espectro electromagnético. 14
2.4. Interacción de la radiación con la materia. 15

Unidad III. Espectroscopía de absorción de radiación UV y visible 18

3.1. Aspectos cuantitativos de las mediciones de absorción. 18
3.2. instrumentación 20
3.3. Procedimientos para la realización de un análisis
espectrofotométrico. 23
3.4. Aplicaciones. 24

Unidad IV. Espectroscopía de absorción infrarroja 39

4.1. Teoría de la absorción infrarroja. 40
4.2. Instrumentos IR. 42
4.3. Regiones espectrales importantes en IR. 46
4.4. Interpretación de espectros IR. 46
4.5. Aplicaciones. 46

Unidad V. Espectroscopia de absorción atómica 53

5.1. Principios de la absorción atómica. 53
5.2. Instrumentación para absorción atómica. 55
5.3. Aplicación e interpretación de datos. 58

Unidad VI. Cromatografía 61

6.1. Conceptos generales 61
6.2. Tipos de cromatografía (Clasificación) 65
6.2.1. Cromatografía de adsorción 67
6.2.2. Cromatografía de partición 67
6.2.3. Cromatografía de intercambio iónico 68
6.2.4. Cromatografía de exclusión por tamaño 70
6.2.5. Cromatografía de afinidad 70
6.3. Aplicaciones 72

BIBLIOGRAFIA 73

2
 Unidad I. Introducción al análisis instrumental.

1.1. Clasificación de los métodos analíticos

El análisis químico es una herramienta muy importante en el estudio de la

química en general ya que es por medio del análisis que puede llevarse a cabo
la evaluación de nuevos productos, además de que el cuidado del medio
ambiente requiere de técnicas analíticas especializadas.

El análisis químico no se enfoca únicamente a la química pura, sino que abarca

áreas muy diversas, tal es el caso de la ecología, mecánica, biología, medicina,
etc. La instrumentación proporciona los límites de detección más bajos
requeridos para que podamos disponer de alimentos, agua y aire no
contaminados.

Es necesario distinguir entre una técnica analítica y un método analítico. Una

técnica es un proceso científico fundamental que se utiliza para obtener
información sobre la composición de una sustancia determinada, mientras que
un método analítico consiste en la aplicación de la técnica analítica para
resolver un problema analítico específico.
Generalmente existen procedimientos estandarizados descritos para la
aplicación de un método de análisis desarrollados por la ASTM (American
Society for Testing and Materials) y por la ADAC (Association of Official
Analytical Chemists) los cuales describen los pasos a seguir para la realización
de análisis específicos.

Clasificación de las Técnicas Instrumentales

Las técnicas instrumentales que proporcionan la base para el estudio de la
instrumentación química se clasifican de la siguiente manera:

Espectroscopia
Técnicas
Electroquímica
Instrumentales
Cromatografía
Ópticas

Sin embargo existen algunas técnicas como el análisis térmico y la

espectrometría de masas que no se ajustan de manera apropiada a esta
clasificación.

Cada una de las técnicas instrumentales considera un buen número de

técnicas. Entre las principales que considera cada una de ellas se encuentran:

Técnicas espectroscópicas Técnicas Cromatográficas

UV-Visible Cromatografía en columna
Infrarrojo Cromatografía en papel
Raman Cromatografía en capa fina
Fluorescencia Cromatografía de gases
Absorción Atómica Cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC)

3
Emisión en plasma Cromatografía de permeación en gel
Emisión de flama (GPC)
Resonancia magnética nuclear
Rayos X
Espectrometría de masas

Técnicas Electroquímicas Técnicas ópticas

Potenciometría Refractometría
Electrogravimetría coulométrica Polarimetría
Voltametría y polarografía
Conductimetría

Para la elección del método de análisis adecuado es necesario considerar las

propiedades químicas y físicas que se puedan utilizar en el análisis cualitativo o
cuantitativo. En la tabla I.1 se muestran la mayoría de las propiedades
características que se utilizan actualmente en el análisis instrumental. La
mayor parte de ellas requiere de una fuente de energía para estimular una
respuesta medible que procede del analito. Por ejemplo, en emisión atómica
se requiere de un aumento en la temperatura del analito para que, en primer
lugar se produzcan átomos en estado gaseoso y después para excitar dichos
átomos a niveles de mayor energía. Posteriormente, dichos átomos emiten
una radiación electromagnética característica que es la cantidad medida por el
instrumento.

Tabla I.1. Propiedades de la radiación que emplean las técnicas

instrumentales
Técnicas Instrumentales

4
Como puede observarse en la tabla I.1, las seis primeras entradas
corresponden a interacciones del analito con radiación electromagnética. En la
primera, el analito origina la señal radiante, mientras que las cinco siguientes
implican cambios en el haz de radiación producidos por su interacción con la
muestra. Las cuatro que siguen son eléctricas. Por último cuatro propiedades
diversas se agrupan conjuntamente: la relación masa/carga, la velocidad de
reacción, las señales térmicas y la radiactividad. La segunda columna de la
tabla indica los nombres de los métodos instrumentales relacionados con las
propiedades físicas y químicas. Debe tenerse en cuenta que no siempre es
fácil elegir el método óptimo de entre la cantidad de técnicas instrumentales
disponibles, así como sus homólogos clásicos debido a que para la selección
adecuada deben considerarse, además de la sensibilidad del instrumento la
naturaleza fisicoquímica de la muestra a analizar.

1.2. Instrumentación en el análisis

Para resolver un problema analítico, frecuentemente se sigue una serie de

pasos que involucran

1 2 3 4
Definición Selección de Tratamiento Realizar las
del los métodos previo a la mediciones
problema apropiados medición requeridas

1. En este punto se debe conocer la naturaleza de la muestra a analizar.

Por ejemplo, en el caso de una muestra orgánica se debe conocer si se
encuentra en estado puro o es una mezcla de componentes.
Generalmente esa información es proporcionada al analista por el
proveedor de la muestra problema.
2. En esta etapa debe tenerse mucho cuidado para la selección del método
de análisis. Por tal motivo es necesario conocer las limitaciones y
alcances de cada uno de los métodos debido a que de eso depende en
gran medida la calidad de la información obtenida.
3. Esta etapa consiste en realizar un tratamiento previo a la muestra para
favorecer las condiciones idóneas para el análisis. Entre los
tratamientos que pueden realizarse se encuentran: disolución,
separación, dilución, concentración, entre otras.
4. Para evaluar la precisión y resultados de los análisis es necesario
realizar las determinaciones más de una vez y con la ayuda de métodos
estadísticos (curvas de distribución, limites de confianza, regresión
lineal, etc.) obtener los resultados más confiables posible.

El propósito de la instrumentación química es el de obtener información básica

de la sustancia que se está analizando. Estas sustancias al pasar a través de
un instrumento de análisis se convierten en una serie de datos que una vez
analizados proporcionan la información necesaria para conocer las
características químicas de los componentes.

5
Un instrumento para el análisis químico transforma la información relacionada
con las propiedades físicas o químicas del analito en información que pueda
ser manipulada e interpretada por el analista, Por lo tanto, dicho instrumento
puede ser considerado como un dispositivo de comunicación entre el sistema
objeto de estudio y el científico. Para conseguir la información deseada del
analito es necesario proporcionar un estímulo, generalmente en forma de
energía electromagnética, eléctrica, mecánica o nuclear como se muestra en la
Figura I.1. Dicho estímulo provoca una respuesta del sistema objeto del estudio
cuya magnitud depende de sus propiedades fisicoquímicas.

Figura I.1. Diagrama de bloques del proceso de medición instrumental.

En general los instrumentos analíticos constan solo de algunos componentes

básicos entre los que se encuentran:
1. Generador de señales.
2. Transductor de entrada (Detector)
3. Modificador de señal
4. Transductor de salida

1. En este primer punto la señal es generada por la interacción del analito

de manera directa o indirecta con una forma de energía que puede ser
radiación electromagnética, corriente eléctrica o energía térmica.
2. Los transductores de entrada o detectores son dispositivos que
transforman las propiedades físicas o químicas el analito en una señal
eléctrica.
3. Los modificadores de señal son componentes electrónicos que ejecutan
operaciones tales como amplificación y filtrado de las señales
provenientes de los detectores de entrada.
4. Finalmente, el transductor de salida convierte la señal eléctrica
modificada en información que puede ser leída, registrada en
interpretada por el analista.

Características de funcionamiento de los instrumentos parámetros de

calidad

En la tabla I.2 se enumeran los criterios cuantitativos de funcionamiento de los

instrumentos, criterios que se pueden utilizar para decidir si un determinado
método instrumental es o no adecuado para resolver un problema analítico.
Estas características se expresan en términos numéricos y se denominan
parámetros de calidad. Para un problema analítico dado, los parámetros de
calidad permiten reducir la elección de los instrumentos a tan solo unos pocos y
entonces la selección entre ellos se hace con los criterios cualitativos de
funcionamiento señalados en la tabla I.3.

6
Tabla I.2.Criterios analíticos para seleccionar técnicas analíticas

Tabla I.3. Otras características a tener en cuanta para la elección de la técnica son

Precisión. La precisión de las técnicas analíticas se define como el grado de

concordancia mutua entre los datos que se han obtenido de una misma forma. La
precisión indica la medida del error aleatorio, o indeterminado de un análisis. Los
parámetros de calidad de la precisión son la desviación estándar absoluta, la desviación
estándar relativa, el coeficiente de variación y la varianza, los cuales se definen en la
tabla I.4

Tabla I.4. Parámetros

de calidad para la
precisión de los
métodos analíticos

7
8
9
10
11
 Unidad II.
La radiación electromagnética y su interacción con la materia

La espectroscopia consiste en la medición e interpretación de fenómenos de

absorción dispersión o emisión de radiación electromagnética que ocurren en
átomos y moléculas. Esta absorción o emisión está asociada con cambios en
los estados de energía de las especies químicas y dado que cada especie tiene
estados energéticos característicos, la espectroscopia puede utilizarse con
fines de identificación de diversas especies químicas.

2.1. Naturaleza de la energía radiante

La radiación electromagnética, o luz, es una forma de energía cuyo
comportamiento está descrito por las propiedades tanto de onda como
partícula. Las propiedades ópticas de la radiación electromagnética, tales
como la difracción y la dispersión son mejor descritas considerando a la luz
como una onda. Sin embargo, muchas de las interacciones entre la radiación
electromagnética y la materia, tales como absorción y emisión, se describen de
una mejor manera considerando a la luz como un haz de partículas o fotones.
La naturaleza exacta de la radiación electromagnética permanece aún sin
aclarar desde su aparición con la mecánica cuántica a principios del siglo XX.
Sin embargo, los modelos del comportamiento dual, como onda y partícula,
proporcionan una descripción útil para la radiación electromagnética.

2.2. Teoría ondulatoria y teoría cuántica

Propiedades de onda de la Radiación electromagnética
La radiación electromagnética consiste en un campo magnético y un campo
eléctrico oscilantes que se propagan a través del espacio a lo largo de una ruta
lineal y con una velocidad constante (Figura 1.). En el vacío, la radiación
electromagnética viaja a la velocidad de la luz, c, esto es, a 2.99792x108 m/s.
Sin embargo cuando ésta se mueve a través de un medio diferente del vacío,
viaja con una velocidad, v, menor que la velocidad de la luz. Dado que la
diferencia entre v y c es muy pequeña (<0.1%) el valor de 3.00x108 se
considera bastante preciso para propósitos de cálculo en espectroscopia.

Campo eléctrico

Campo magnético

Dirección de
propagación

12
Figura 1. Radiación electromagnética polarizada en un plano. Se muestran los
campos eléctrico y magnético así como la dirección de propagación.

Los campos magnético y eléctrico que componen a la luz se encuentran en una

posición perpendicular, uno con respecto al otro y a la dirección de propagación
de las ondas. La figura 1 muestra un ejemplo del plano polarizado de la
radiación electromagnética, el cual consiste en un campo eléctrico oscilante y
un campo magnético oscilante, cada uno está restringido a un solo plano.
Normalmente la radiación electromagnética está no polarizada, con los campos
magnético y eléctrico oscilantes en todos los planos posibles orientados de
forma perpendicular a la dirección de propagación.
La interacción de la radiación electromagnética con la materia puede ser
explicada utilizando ya sea un campo eléctrico o un campo magnético. Por
esta razón, solo el componente eléctrico se muestra en la figura 2. El campo
eléctrico oscilante es descrito como una onda de la forma
E = Ae sin(2πνt + Φ)

Donde, E, es la magnitud del campo eléctrico en el tiempo t, Ae es la amplitud

máxima del campo eléctrico, ν es la frecuencia o el número de oscilaciones en
el campo eléctrico por unidad de tiempo y Φ es un ángulo de fase.

+
Fuerza del campo eléctrico

Tiempo o
distancia

-
Figura 2. Componente del campo eléctrico de la radiación electromagnética.

Una onda electromagnética, por lo tanto, está caracterizada por varias

propiedades fundamentales, incluyendo su velocidad, longitud de onda,
frecuencia, ángulo de fase, polarización dirección de propagación. La longitud
de onda de una onda electromagnética, λ, está definida como la distancia entre
máximos sucesivos o mínimos sucesivos (Figura 2). Para radiación
electromagnética UV y visible, la longitud de onda es expresada normalmente
en nanómetros (nm, 10-9 m) y la longitud de onda para radiación infrarroja está
dada en micras (mm, 10-6 m). A diferencia de la frecuencia, la longitud de onda
depende de la velocidad de las ondas electromagnéticas, donde

13
 c
λ=
ν
Otra unidad utilizada para describir las propiedades de onda de la radiación
electromagnética es el número de onda ν , el cual es el recíproco de la longitud
de onda
1
ν=
λ
Los números de onda son usados frecuentemente para caracterizar la
radiación infrarroja, con sus unidades dadas en centímetros recíprocos (cm-1).
Dos propiedades adicionales son la potencia P y la intensidad I, las cuales
proporcionan el flujo de energía a partir de una fuente de radiación
electromagnética.

Propiedades de partícula de la radiación electromagnética

Cuando una muestra absorbe radiación electromagnética, esta sufre un cambio
de energía. La interacción entre la muestra y la radiación electromagnética es
más fácil de entender si se asume que la radiación electromagnética consiste
de un haz de partículas llamadas fotones. Cuando un fotón es absorbido por
una muestra. Este es destruido y su energía es adquirida por la muestra. La
energía de un fotón, en joules, está relacionada con su frecuencia, longitud de
onda o número de onda por las siguientes ecuaciones:

donde h es la constante de Planck, la cual tiene un valor de 6.626 x 10-34 J s.

La energía de un fotón proporciona una propiedad característica adicional de la

radiación electromagnética.

2.3. El espectro electromagnético

La frecuencia y longitud de onda de la radiación electromagnética varía en
muchos órdenes de magnitud. Por conveniencia, la radiación electromagnética
está dividida en diferentes regiones basadas en el tipo de transición atómica o
molecular que da lugar la absorción o emisión de fotones (Figura 3).

14
Longitud de
onda (m)

Frecuencia (s-1)

Electrones cercanos Electrones Vibraciones Rotaciones Spin

Tipo de al núcleo
de valencia
moleculares
moleculares
nuclear
Spin electrónico
transición

Microondas Ondas de radio

Región espectral

Longitud de onda (nm)

violeta azul verde amarillo naranja rojo

Figura 3. Espectro de la radiación electromagnética.

Los límites descritos en el espectro electromagnético no son rígidos y es

posible un traslape entre las regiones espectrales.

2.4. Interacción de la radiación con la materia.

Medición de los fotones como señal
La espectroscopia es únicamente posible si la interacción de los fotones con
una muestra determinada conduce a un cambio en una o más de las
propiedades que caracterizan a la radiación electromagnética, tal es el caso de
su energía, velocidad, longitud de onda, frecuencia, ángulo de fase,
polarización y dirección de propagación.

15
La espectroscopía está dividida en dos clases principales. Una clase
corresponde a aquellas técnicas en que la energía es transferida entre los
fotones y el analito. En la espectroscopia de absorción la energía que porta un
fotón es absorbida por el analito, promoviendo al analito desde un estado de
baja energía hasta un estado de mayor energía o estado excitado (Figura 4).
La fuente del estado energético depende de la energía de los fotones. Por
ejemplo en el caso de luz visible, la absorción de energía por el analito conduce
a que los electrones de valencia se desplacen hacia un nivel energético más
alto energía. Por otra parte, cuando un analito absorbe radiación infrarroja, uno
de sus enlaces químicos experimenta un cambio en su energía vibracional.

Figura 4. Diagrama de energía simplificada que muestra la absorción de un

fotón

La intensidad de los fotones que pasan a través de la muestra es atenuada

debido a la absorción de energía. La medición de esta atenuación, a la cual se
le denomina absorbancia, es la cantidad que se determina durante el análisis
espectroscópico. Un gráfico de absorbancia en función de la energía de los
fotones es llamado espectro de absorción (Figura 5).

16
 Absorbancia

Longitud de onda (nm)

Figura 5. Espectro de absorción ultravioleta-visible de azul de bromotimol.

La emisión de un fotón ocurre cuando un analito en un estado de energía

mayor regresa a su estado de menor energía (Figura II.6). A una absorción
seguida de una emisión se le llama fotoluminiscencia.

Figura II.6. Diagrama de energía simplificada que muestra la emisión de un

fotón
Una segunda clase de espectroscopia es aquella en que la radiación
electromagnética sufre un cambio en longitud de onda, ángulo de fase,
polarización o dirección de propagación como resultado de su refracción,
reflexión, dispersión, o difracción por la muestra.

Teoría de Orbitales Moleculares

Para comprender las transiciones electrónicas producidas por absorción de
radiación UV-visible, es necesario establecer la forma en que los electrones
están distribuídos en una molécula. Esto puede ser explicado por la teoría de
orbitales moleculares.

La Teoría de Orbitales Moleculares (T.O.M.) es la segunda aproximación al

estudio del enlace covalente, y la más ampliamente empleada para explicar la
estructura y la geometría de muchos sólidos inorgánicos. El punto de partida
consiste en asumir que si los dos núcleos implicados en el enlace se ubican a
la distancia de equilibrio, los electrones se alojarán no en orbitales atómicos de
cada elemento, sino en orbitales moleculares, que son análogos a los
atómicos, y que presentan características similares, como se verá más

17
adelante. Esta analogía es de tal grado que al igual que ocurría con los átomos
polielectrónicos, no es posible resolver la ecuación de Schrödinger de forma
exacta para la molécula, y de nuevo hay que recurrir a métodos aproximados
para conocer la forma de las funciones de onda que representen los
mencionados orbitales moleculares.

Uno de los métodos más empleados es el que hace uso de las Combinaciones
Lineales de Orbitales Atómicos (CLOA). Esta aproximación puede entenderse
de forma simple si se piensa que cuando un electrón esté cerca de uno de los
núcleos, es decir, cuando esté “controlado” por un núcleo, su función de onda
será muy similar a la de un orbital atómico. Los orbitales moleculares de la
molécula de H2 se obtienen de forma aproximada mediante la combinación
lineal de los orbitales atómicos 1s de cada átomo de hidrógeno. Únicamente se
pueden escribir dos combinaciones lineales:

Ψ+ = cAφA +cBφB
Ψ- = cAφA – cBφB

Los coeficientes ci que aparecen en la combinación lineal reflejan la

contribución de cada orbital atómico al orbital molecular: cuanto mayor sea el
valor del coeficiente mayor será la participación del orbital atómico en el
molecular. Para la molécula de H2 la contribución de ambos orbitales atómicos
a los orbitales moleculares es la misma, esto es, cA = cB = 1, de forma que las
expresiones matemáticas de las funciones de onda se pueden simplificar:

Ψ+ = φA + φB
Ψ- = φA – φB

Ψ + (izquierda) y Ψ- (derecha)

En la figura anterior se representan las funciones Ψ+ y Ψ- (parte radial) frente a

la distancia internuclear. La función Ψ+ concentra la densidad electrónica entre

18
los dos núcleos, debido a una interferencia constructiva φA y φB, lo que aumenta
la amplitud en la región internuclear. Por el contrario, la función de onda Ψ-
concentra la densidad electrónica fuera de la zona comprendida entre los dos
núcleos. La interferencia de tipo destructivo entre las funciones de onda φA y φB
cancela sus amplitudes y da lugar a la formación de un plano nodal en la región
internuclear. Obviamente, la molécula será más estable si los electrones se
encuentran en el orbital Ψ+, porque esto origina un aumento de la atracción
electrón-núcleo y una disminución de las repulsiones nucleares. La
combinación Ψ+ = φA + φB corresponde al orbital molecular de menor energía y
se denomina orbital molecular enlazante, que ahora se representa como Ψe.
Por el contrario, la combinación Ψ- = φA – φB, representa al orbital molecular de
mayor energía denominado orbital molecular antienlazante (Ψa). Las energías
relativas de los dos orbitales moleculares se muestran en la siguiente figura,
que constituye un ejemplo de lo que se conoce como Diagrama de Orbitales
Moleculares o Diagrama de Niveles de Energía.

De forma análoga a las limitaciones en el caso de átomos, el principio de

exclusión de Pauli limita a dos el número de electrones que pueden ocupar un
orbital molecular, lo que obliga a su apareamiento. La molécula de H2 posee
una energía menor que los dos átomos de H por separados porque los dos
electrones ocupan el orbital molecular enlazante y ambos contribuyen a una
disminución de la energía del sistema.

Diagrama de Orbitales Moleculares de la molécula de Hidrógeno.

En definitiva, el enlace en la molécula de hidrógeno puede ahora explicarse en

función de la formación de dos orbitales moleculares a partir de dos orbitales
atómicos. De forma general, N orbitales atómicos pueden conducir a la
formación de N orbitales moleculares. Los electrones ocuparán los Orbitales
moleculares siguiendo las mismas reglas que las especificadas para las
configuraciones electrónicas de los elementos.

19
 Unidad III. Espectroscopía UV-visible.

3.1. Aspectos cuantitativos de las mediciones de absorción.

La absorción molecular en la región UV visible del espectro depende de la
estructura electrónica de la molécula.

En el análisis por absorción UV visible se cuantifica la energía absorbida que

da por resultado la elevación de los electrones del estado básico a orbitales de
mayor energía en un estado excitado.

Todas las moléculas pueden absorber radiación UV visible debido a que

contienen electrones (e-) compartidos y sin compartir que pueden ser excitados
a niveles de energía más elevados. Las longitudes de onda en los que ocurre la
absorción dependen de que tan fuerte estén unidos los electrones en la
molécula.

Ejemplo. Los electrones en un enlace covalente están unidos fuertemente por

los dos átomos y para su excitación se necesita radiación de alta energía. En el
caso de los alcanos cuyos átomos se encuentran unidos por enlaces
covalentes se necesitan energías con longitud de onda por debajo de 160 nm
para que presenten transiciones. Por ejemplo, el metano CH4 presenta una
transición σ-σ* en 122 nm, mientras que una molécula que contiene halógenos,
por ejemplo –Cl: tiene e- de sin compartir y uno de estos puede sufrir una
transición electrónica de n-σ*.

En la práctica la espectroscopía ultravioleta está limitada en gran parte a los

sistemas conjugados.

Sin embargo se tiene la ventaja en cuanto a la selectividad de la

absorción UV. Los grupos característicos pueden reconocerse en moléculas de
complejidad ampliamente variable.

El espectro UV (Figura III.1) esta formado por una gráfica de longitud de onda
en función de la intensidad de absorción que puede estar en forma de
transmitancia o absorbancia, siendo la transmitancia la cantidad de luz que
pasa a través de la muestra que se está analizando y la absorbancia la
cantidad de luz absorbida por la misma.

200 210 220 230 240 250

Figura III.1. Benzoato de hexametil amonio

20
Generalmente, las transiciones generadas por la radiación UV visible consisten
en la excitación de un electrón desde un orbital molecular lleno (normalmente
un orbital π de enlace) a siguiente orbital de energía mayor: (un orbital π de
antienlace π*). El orbital de antienlace se designa con un asterisco π - π*

La ecuación que describe la relación entre la energía absorbida en una

transición electrónica y la frecuencia, longitud de onda y número de onda de la
radiación que produce la transición es:

hC
∆E = hν = = hν C
λ

h= constante de Planck
C= velocidad de la luz
∆E= la energía absorbida en una transición electrónica desde un estado de
energía básico hasta un estado de mayor energía (estado excitado).

La energía absorbida depende de la diferencia de energía entre el estado

básico y el excitado. Cuanto menor es la diferencia de energía mayor es la
longitud de onda de la absorción.

Debido a que la ecuación se requiere para producir una transición tiene un

valor determinado, el espectro de absorción debería consistir en una línea
simple. Sin embargo los espectros de una absorción consisten en bandas de
absorción muy anchas en un intervalo de longitud de onda, esto es debido a
que la energía de la radiación UV visible produce además de cambios en los
niveles electrónicos, transiciones rotacionales y vibraciones traslapadas.

Las principales características de una banda de absorción son su posición y su

intensidad:
• La posición de la absorción corresponde a la λ de la radiación con energía
igual a la que se necesita para que suceda una transición electrónica.
• La intensidad de la absorción puede expresarse como transmitancia T
definida por:
T= I / I0

Fracción de energía incidente que es transmitida por una muestra

I0 = intensidad de la energía radiante que incide sobre la muestra

I = intensidad de energía radiante que sale de la muestra

Existe una expresión más conveniente para la intensidad de la absorción que

es lo que se deriva de la ley de Lambert-Beer, la cual establece una relación
entre la transmitancia, el espesor de la muestra y la concentración de las
especies absorbentes:

Log10 (I0 / I) = kcb = A

21
Donde: k es una constante característica del soluto
c es la concentración del soluto
b la longitud de la trayectoria a través de la muestra
A es la absorbancia

Cuando “C” se expresa en mol/L y considerando que la longitud de la

trayectoria (b) a través de la muestra se expresa en cm la expresión anterior se
transforma en

A = εbc

Donde ε = absortividad molar o coeficiente de extinción molar.

En el caso que “c” este dado en g/L

A = abcg/L

a = absortividad

ε = aM

M = peso molecular del soluto.

De la ecuación puede observarse que a absorbancia es directamente

proporcional a la concentración (A α concentración)

A T %T log T
Pendiente=εb

C C C

3.2. Instrumentación

Un espectrómetro es un instrumento para medir la transmitancia o la

absorbancia de una muestra en función de la λ determinada. También:

Manuales
Clasificación Simple (un haz)
De registro
Doble haz

22
En la práctica, los instrumentos de un solo haz (Figura III.2.) por lo general se
operan en forma manual y los de doble haz poseen registro automático de los
espectros de absorción.

Figura III.2. Disgrama del sistema óptico de un espectrofotómetro de un solo

haz.

Espectrofotometría de un solo haz

Los componentes esenciales son:
1. Una fuente de energía continua que cubre la región del epicentro en la cual
opera el instrumento.
2. Un monocromador. Esta es la parte que aísla una longitud de onda o un
pequeño intervalo de longitud de onda de todo el espectro emitido por la
fuente (en la mayoría de los casos se considera que no es posible alcanzar
una monocromación completa)
3. Recipiente para la muestra. (Celda de cuarzo, vidrio o polipropileno)
4. Detector (transductor que convierta la energía radiante en una señal
eléctrica.
5. Amplificador y un circuito asociado que traduce la señal eléctrica a la
lectura apropiada.
6. Un sistema de lectura de la medición que pone de manifiesto la magnitud
de la señal eléctrica.

Fuente > Monocromador > Muestra > Detector

Amplificador

Instrumento
para lectura

23
Fuente de energía
La fuente de energía radiante para la región UV visible es una lámpara
incandescente con filamento de Tg. en condiciones de operación ordinaria la
capacidad de la lámpara de Tg es útil en un intervalo de 350nm – 3000nm. La
energía que emite el filamento caliente varía con la longitud de onda.

Energía

100 1000 1200 2000 nm

El calor de la lámpara puede ser problemático por lo que el lugar donde

se encuentra la lámpara posee un ventilador para evitar que se caliente la
muestra u otros componentes del instrumento. Por debajo de los 350nm se
debe emplear una fuente diferente. La más común es un tubo de descarga de
hidrógeno (o deuterio) el cual se utiliza de 175 – 400nm. La luz emitida por
cualquiera de las 2 fuentes es dirigida hacia la muestra a través de espejos.

Monocromador
Instrumento óptico que sirve para separar de una fuente de radiación
continua un haz de elevada pureza espectral y de cualquier longitud de onda.
Los componentes esenciales de un monocromador con rendijas y un elemento
dispersor. La radiación de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada y es
colimada (seleccionada) por una lente o por un espejo para que el haz llegue
paralelo al elemento dispersor el cual puede ser un prisma o una rejilla de
difracción. Al mover el prisma o la rejilla de difracciones del espectro que
produce el elemento dispersor se enfocan sobre la rendija de salida de donde
se dirigirá hacia la muestra.

Los espectrofotómetros que abarcan la región UV visible del espectro

utilizan monocromadores de cuarzo. La pureza espectral de la radiación que
emerge del monocromador depende del poder del elemento dispersor y del
ancho de la rendija de salida.

Portamuestras
La mayor parte de la espectrofotometría utiliza soluciones y por esta
razón la mayoría de los recipientes para las muestras son celdas para colocar
líquidos en el haz del espectrofotómetro, la celda debe transmitir la energía
radiante a la región del análisis. Por ejemplo las celdas de vidrio sirven para la
región visible y las de cuarzo para la región UV.

Las celdas deben tener superficies planas (Figura III.3) para que no
intervenga la óptica de la superficie con la luz incidente.

24
Figura III.2. Celdas típicas usadas en espectroscopía UV-visible.

Las celdas deben ser llenadas de tal forma que el haz pase a través de
la solución con el menisco por arriba del haz. Por lo general las celdas se
mantienen inmóviles en la cavidad que las contiene o mediante sujetadores de
resorte que aseguran una posición reproducible.

Las celdas típicas para las regiones UV visible tienen 1cm de paso de
luz (cuadrados 1x1cm) pero pueden existir celdas con camino óptico desde
fracciones de cm hasta 10 cm.

Detector
Características que debe tener un detector: sensibilidad elevada en la
región espectral que nos interesa, respuesta lineal para la energía radiante,
tiempo de respuesta rápido, buena disponibilidad para la amplificación y alta
estabilidad o bajo nivel de ruido. Sin embargo en la práctica no se pueden tener
todas estas características sin afectar alguna otra, por ejemplo sensibilidad
elevada incrementa en el ruido.

Los detectores más comunes en espectro UV visible son los detectores

fotoeléctricos de los cuales el más común es el fototubo. El fototubo consiste
en un tubo al vacío con una ventana transparente que contiene un par de
electrodos)

3.3. Procedimiento para realización de un análisis

Los pasos a seguir para cualquier análisis espectrofotométrico, son los
siguientes:
1. Selecciona la longitud de onda.
2. Coloca un blanco (solvente puro).
3. Ajustar escala del instrumento para leer cero absorbancia (100%
transmitancia)
4. Colocar la muestra y leer absorbancia o transmitancia.

Cada vez que se cambie la longitud de onda se debe registrar la escala

para compensar cualquier absorción que pudiera tener la solución de
referencia con la nueva longitud de onda: por lo general se emplean 2 celdas,
25
una para la solución de referencia y la otra para la muestra que se va a medir,
el único requisito es que sean celdas iguales.

3.4. Aplicaciones

Interpretación de los espectros UV visible.

Los valores de longitud de onda de una molécula conjugada dependen de la
naturaleza exacta del sistema conjugado y de sus sustituyentes.

R.B. Woodward y L.F. Fieser 1940 desarrollaron un conjunto de

correlaciones entre las estructuras moleculares y sus máximos de absorción y
enunciaron las reglas de Woodward – Fieser los cuales consideran que pueden
realizarse algunas generalidades sencillas para estimar los valores
aproximados de longitud de onda máxima.

Por ejemplo en el caso de dobles enlaces aislados, las moléculas presentan

máximos de absorción entre 170 y 180nm por centímetro.

H2C CH2

Etileno Ciclohexeno 1,4 hexadieno

171 nm 182 nm 180 nm

En el caso de dienos conjugados la longitud de onda máxima se desplaza

hacia mayores longitudes de onda debido a la mayor deslocalización de los
electrones por resonancia (menor energía para transiciones electrónicas)

2,4 hexadieno 3 metileno ciclohexeno

217 nm 227 nm 256 nm 232 nm

(Al agregar un doble enlace)

La adición de un doble mas a un sistema conjugado conduce a un
incremento en la longitud de onda máxima entre 30 – 40nm.
Los grupos alquilo también incrementan cada valor de longitud de onda
máximo en aproximadamente 5nm por cada uno. Por ejemplo:

λmac 217 nm λmac 232 nm

1,3 butadieno 2, 4 diemtil – 1, 3 - pentadieno

Ejercicio
26
 185 nm 235 nm 273 nm 300 nm

Términos utilizados en UV visible

• Efecto batocrómico de grupos alquilo. Desplazamiento de la longitud de
onda hacia mayores longitudes de onda.
• Efecto desplazamiento hipsocrómico. Desplazamiento hacia longitudes de
onda más corta.
• Auxocromo: sustituyente que no es cromóforo por sí mismo pero que altera
la longitud de onda o el coeficiente de extinción cuando se fija a un
cromóforo.
• Cromóforo: grupo funcional responsable de la absorción. Ejemplos:
o Dienos y polienos
o Poliinos y eninos
o Aldehídos y cetonas
o Ácidos α, β insaturados, lactones y esteres
o Aromáticos y heterocíclicos

Espectros de absorción UV de dienos y polienos

Efecto batocrómico de grupos alquilo

Cada grupo alquilo funciona como un auxocromo, produciendo un
desplazamiento batocrómico pequeño de aproximadamente 5nm.

Número de grupos alquilo Compuesto λmax (nm)

0 H H 217
H2C C C CH2
1 H H H 224
H3C C C C CH2
1 H 220
H2C C C CH2

CH3
2 H2C C C CH2 226

CH3 CH3
2 H H H H 227
H3C C C C C CH3
3 H 232
H3C C C C CH2

CH3 CH3

27
 4 H H 241
H3C C C C C CH3

CH3 CH3

Efectos de conformación para los dienos que tienen principalmente la

conformación trans se forma un valor base de longitud de onda máximo igual a
217nm que es el valor del butadieno no sustituido. A este valor se le suma 5nm
por cada sustituyente alquilo. Para dienos sujetos a una conformación cis por
un anillo de 6 miembros, el valor base es de 253nm + 5nm por cada
sustituyente alquilo por ejemplo:

217 nm 217 nm + 10 nm 253 nm + 10 nm

Dobles enlaces conjugados adicionales

Para trienos y sistemas conjugados mayores se suman 30nm a los
valores base por cada doble enlace adicional. Sin embargo el doble enlace
debe estar unido al extremo del sistema conjugado para aumentar la longitud
del sistema polienico.

217 nm + 30 nm = 247 nm 253 nm + 30 nm + 10 nm = 293 nm

Existe una contribución más que es la suma de 5 nm mas si alguno de

los dobles enlaces en el sistema conjugado es exocíclico con respecto a un
anillo. Un enlace exocíclico es aquél que está unido por extremo a un anillo.
Por ejemplo:

Reglas de Woodward Fieser para dienos conjugados

1. Agrupamiento
2. Corrección por sustituyente (nm)
3. Otro C=C conjugado +30
4. Grupo alquilo +5

28
 5. Doble enlace exocíclico +5 además del aumento por longitud del
solvente

253 + 4(5) + 2(5) = 283 nm 253 + 30 + 5(5) + 3(5) = 323 nm 253 + 2(30) + 5(5) + 3(5) = 353 nm

Absorción de grupos carbonilo

Los grupos carbonilo tienen 2 tipos de electrones fácilmente disponibles
que pueden sufrir transiciones en UV: los e- π y los pares de electrones no
compartidos o e- n sobre el oxígeno. Transiciones n→π* requieren de menor
energía que las transiciones π→π*. Las primeras se encuentran a mayores
valores de longitud de onda.

En el caso de sistemas conjugados como las cetonas α, β – insaturadas

muestran las 2 transiciones n→ π* y π →π* desplazadas hacia longitudes de
onda mayores que la de los sistemas aislados. La naturaleza de la transición
puede ser anulada por el efecto del cambio en la polaridad del disolvente sobre
la longitud de onda máxima.

Disolventes más polares producen transiciones n→π* desplazadas hacia

longitudes de onda menores y hacen que las transiciones π→π* sean
desplazadas hacia longitudes de onda mayores.

Para explicar el efecto que tienen estos disolventes se considera la

formación de enlaces por puentes de hidrógeno entre el grupo carbonilo y el
hidrógeno de grupos hidroxilo.

En disolventes polares, los electrones no enlazados del átomo de

hidrógeno están coordinados con disolventes hidroxílicos disminuyendo la
carga neta de los electrones no enlazantes por lo que transición n→π* es de
mayor energía o de menor longitud de onda. La cantidad del desplazamiento
hacia una longitud de onda menor es de hecho una medida de la fuerza de los
enlaces por puentes de hidrógeno en ese disolvente

R
C O H OR
R

Por otro lado, la transición π→π* es desplazada hacia longitudes de

onda mayores en un disolvente más polar: esto es debido a la estabilización del
sistema excitado por la presencia de un grupo polar, por ejemplo.

29
 C O C O

Esto disminuye la distancia entre π→π* disminuyendo la energía o

aumentando la longitud de onda de la transición

π*
π*

n
n

π π

Disolvente no polar Polar

El efecto del disolvente sobre las transiciones n→π y π→π* de la 4–

metil –3–penten–2–ona se muestra en la siguiente tabla.

CH3 O

Disolvente π → π* n → π*
Hexano 229.5 327
Eter 230 326
Etanol 237 315
Metanol 238 312
H2O 244.5 305

Predicción de las transiciones π → π en cetonas α,β–insaturadas

Valores base

O
210 nm, si R = H
215 nm si R = alquilo

30
Por cada grupo alquilo ubicado en posición α al grupo carbonilo, la longitud de
onda máxima se incrementa en 10 nm; por cada grupo alquilo en posición β la
longitud de onda máxima se incrementa en 12 nm. Cada grupo alquilo en
posición γ y δ incrementa la longitud de onda en 18 nm.

Cada doble enlace exocíclico desplaza la longitud de onda máxima en 5 nm.

Cada doble enlace conjugado adicional incrementa la longitud de onda en 30

nm.

Por ejemplo:

O
H3C
H
C C C CH3

H3C

CH3

O O

31
 O

Aplicaciones de la espectrofotometría UV-visible

%T Vs. λ A Vs. λ Energía Vs. λ

A = abC
A = εbC
A %T
Log T
Pend = ab

C C
C

1
A = log
T

La forma del espectro de absorción depende de la concentración de las

muestras. Si consideramos la ley de Beer podemos observar que a cada
concentración hay un cambio en la absorbancia a cada longitud de onda.

Figura III.4. Variación del (a) % de transmitancia y (b) la absorbancia en

función de la concentración de la muestra.

Identificación de sustancias químicas

El espectro de absorción de una muestra se puede considerar como una
característica física más de un compuesto que no varía y puede ser utilizada
junto con Pf, índice de refracción y otras propiedades para caracterizarlo.

32
 Debe tenerse en cuenta que el espectro de absorción no solo depende
de la naturaleza química del compuesto en cuestión sino de la presencia de
disolventes que puede producir una desviación de la longitud de onda en las
bandas de absorción.

La forma de una banda y en particular la definición de las bandas

pueden depender de las características del instrumento, como son resolución,
velocidad de banda y ganancia.

Existen ya registrados los espectros de eventos de compuestos por lo

que para identificar muestras desconocidas se recurre a una comparación.
Para identificación de compuestos desconocidos con frecuencia son muy útiles
las correlaciones de espectro – estructura en las regiones UV – infrarrojo.

Análisis multicomponentes
En algunos casos no es completamente necesario que los componentes
individuales de una mezcla compleja sean separados de los demás, por
ejemplo en espectroscopía UV–visible, algunas veces es posible medir más de
un componente en solución. Supongamos que una solución tiene dos
componentes X y Y que absorben radiación. La complejidad de la situación
depende de los espectros de absorción de X y Y.

Caso 1(Figura III.5).

Y
X

λ1 λ2
Figura III.5. Espectros no superpuestos.

En el caso en que los espectros no se sobreponen, o al menos es posible

encontrar una longitud de onda en donde X absorbe y Y no. Los componentes
X, Y se miden sencillamente en las longitudes de onda, λ1 y λ2
respectivamente.

Caso 2
Sin embargo en el caso en que los espectros se sobreponen
paralelamente (Figura 2). Y no interfiere con la medición de X en λ1, pero X si
absorbe en forma apreciable junto con Y en λ2. La concentración de X se
determina directamente a partir de la absorbancia de la solución en λ1.
Después, la absorbancia Y tiene esta concentración de X en λ2 se calcula a
partir de la absortividad molar de X en λ2. Esta contribución se resta a la

33
absorbancia del componente Y, cuya concentración se calcula después en la
forma acostumbrada.

Y
X

λ1 λ2

Figura III.6. Espectros parcialmente superpuestos.

Caso 3
Los espectros se sobreponen por completo cuando no se pueden
encontrar una longitud de onda en la que X o Y absorban de forma exclusiva,
como se sugiere en la figura 3. Es necesario resolver dos ecuaciones
simultáneamente con dos incógnitas.

X+Y

A1 absorbancia medida en λ1
A2 absorbancia medida en λ2
ε X1 absortividad molar de X en λ1
ε X2 absortividad molar de X en λ2
ε Y1 absortividad molar de Y en λ1
ε Y2 absortividad molar de Y en λ2
Cx Concentración molar de X
34
 Cy Concentración molar de Y
B Ley de trayectoria

Puesto que la absorbancia es la suma de las contribuciones de

absorción de cada uno de los componentes de la solución

A1 = εX1bCx + εY1bCy
A2 = εX2bCx + εY2bCy

Incógnitas Cx y Cy
Los valores de ε deben conocerse a partir de la medición de las
soluciones, puras de X y Y en las dos longitudes de onda.

Se pueden establecer las ecuaciones para cualquier número de

componentes siempre y cuando se midan los valores de absorbancia de cada
uno de ellos en todas las longitudes de onda. Sin embargo la importancia de
pequeños errores al hacer la medición se incrementa al aumentar el número de
componentes y en la práctica este sistema por lo general se limita a un sistema
de dos o posibles tres componentes.

Preparación de muestras
Algunos de los elementos de la tabla periódica absorben con fuerza en
la región visible o en UV, pero sólo cuando presentan ciertos estados de
oxidación para preparar estas muestras se requiere de incluir tanto reacciones
redox como separaciones, por ejemplo. El Mn2+ frecuentemente se determina
espectrofotométricamente después de una oxidación a Mn (VII) mediante
adición de persulfato o peryodato.

2 Mn2+ + 5 S2O82- + 8 H2O > 2 MnO4- + 10 SO42- + 16 H+

La solución púrpura de se MnO4- mide alrededor de 525nm.

El Cr se determina en forma similar después de que se oxida a Cr (VI).
El Fe puede determinarse mediante el color rojo que se obtiene al tratar
soluciones de Fe (III) con tiocianato.

Fe3+ + SCN- > (Fe SCN)2+

Otros ejemplos de complejo coloridos que se forman con reactivos

inorgánicos son el complejo azul de tetra amincobre (Cu (NH3)4)2+ y diversos
complejos ácidos como el ácido fosfomolibdico (H3P (Mo3O10)4)·29 H2O que se
utilizan para determinar elementos como el P y el Si. El ion yoduro forma iones
complejos amarillentos que presentan un máximo de absorción en la región UV
con varios metales incluyendo Br, Sb y Pd, por ejemplo.

PdI42-

Los complejos coloridos que se forman con los iones metálicos y los
reactivos orgánicos ofrecen una variedad impresionante de métodos

35
espectrofotométricos que son especialmente útiles en el análisis de trazas de
algún compuesto (aguas de desecho).

Algunas veces la baja solubilidad acuosa de muchos de los compuestos

metálicos quelatos pero, por otra parte, la extracción de los metales en
disoluciones no acuosas por medio de agentes quelantes puede llevar a
métodos analíticos muy poderosos. En los casos favorables puede ser posible
encontrar el metal, separarlo de las interferencias y desarrollar el sistema
absorbente en una sola etapa. Por ejemplo los quelatos de la 8
hidroxiquiroleína (oxina) con metales como Al, Fe (III) y Cd, Ga, Pb y Cu, son
solubles en cloroformo y antes de hacer una determinación espectro
fotométrica se realizan extracciones con este disolvente. La extracción se
puede hacer de forma muy selectiva controlando el pH de la fase acuosa y
adicionando agentes formadores de complejos que enmascaran ciertos iones
metálicos. Con las soluciones de cloroformo que tienen una concentración de
µg/ml. Por lo general se obtienen valores ed absorbancia razonables. Sin
embargo en los procedimientos espectrofotométricos en algunas regiones del
espectro no únicamente debe disolver la muestra, sino que además no debe
absorber en forma apreciable en la región en donde se va a realizar la
determinación.

Disolvente Mínima aprox. Disolvente

(nm)
Agua 190 Cloroformo 250
Metanol 210 Tetracloruro de C. 265
Ciclohexano 210 Benceno 280
Hexano 210 Tolueno 285
Eter dietílico 220 Pridina 305
P. dioxano 220 Acetona 330
Etanol 220 Bisulfuro de C. 380

Problemas de la ley de Beer

1. El compuesto orgánico 3–ciano–5–metilpiridina (C7H6N2 PM 118.14)
presenta una banda de absorbancia UV en 272nm en solución de etanol. Una
solución que contienen 0.274mg de este compuesto en 10ml de etanol dio una
absorbancia de 0.7 con una celda de 1cm. Calcule la absortividad y (b) la
absortividad molar de compuesto en una longitud de onda de 272nm.

2. El reactivo orgánico soluble en agua e incoloro 1, 10 fenantrolina

forma un ion complejo con el Fe2+ de color rojo intenso (Fe(Fen)3)2+ que
algunas veces se utiliza para la determinación espectrofotométrica del hierro.
La longitud de onda para la máxima absorción es 310nm. Para desarrollar el
color, la solución que contiene hierro se trata con un agente reductor como la
hidroxilamina, que convierte todo el hierro a Fe2+ y después se le adiciona un
exceso de fenantrolina.
Siguiendo este procedimiento se trató una alícuota de 5.00 ml de una
solución estándar con un total de 20µg de Fe y se diluyó a un volumen final de
10ml. Se encontró que la absorbancia de la solución a 510nm en una celda de
1.0cm fue de 0.397. Calcule la absortividad molar del Fe en el ion complejo.

36
 3. Una alícuota de 5ml de una solución que contenía una cantidad de
hierro desconocida se trató con el mismo procedimiento del problema #2. La
absorbancia en 510 nm fue de 0.142 con una celda de 1cm. Calcule los
contenidos de Fe presente en µg/mL.

4. Un compuesto cuyo peso molecular es 100 tiene una absortividad

molar de 1*105 ¿Cuántos gramos de este compuesto se deben disolver en
exactamente 1 litro de solución para que después de diluirla 200 veces la
solución tenga una A=0.5 en una celda de 1cm?

5. Una muestra de 1.0g de un acero desconocido se disolvió en HNO3 y

el Mn se oxidó a MnO4- con persulfato de potasio. Después la solución se
diluyó a 500ml en un matraz volumétrico. Se trató de igual forma 0.578g de una
muestra de acero certificada por la asociación nacional de estándares con
0.25% de Mn. La absorbancia de la muestra desconocida fue 236 veces más
que la del estándar. Calcule el % de Mn presente en la muestra de acero
desconocido.

6. Una muestra de 0.525g de una aleación de acero se disolvió; el Mn se

oxidó a MnO4-2 y la solución se diluyó a 100ml en un matraz volumétrico. La A a
525nm en una celda de 1cm = 0.496. La ε del MnO4- a 525nm es 2.24*103.
Calcule el % de Mn en el acero. PM MnO4 = 118.93

7. El volumen de sangre de una persona se puede estimar inyectándole

en una vena una cantidad conocida de tintura innocua y determinando su
concentración en el plasma sanguíneo por medio de espectrofotometría unos
minutos después cuando toda la tintura se ha mezclado bien por la circulación.
Se supone no hay sangre que se acumule o estanque dentro del cuerpo, que la
tintura permanece en el sistema vascular y que solo está en el plasma
sanguíneo, esto es, que no forma parte de las células de la sangre. Al haber
obtenido el volumen del plasma, se calcula el volumen total de la sangre que a
partir de la información sobre la fracción del plasma en toda la sangre. Un
laboratorio utiliza una solución estéril en ampolleta que contiene tintura
conocida como azul de Evans. A una persona del sexo masculino que pesa
75kg se le inyecta por vía intravenosa exactamente 1mL de esta solución, 10
min después se le saca una muestra de sangre. La sangre se centrifugó para
separar cada plasma de las células y se encontró que el plasma representaba
el 53% del volumen total. La absorbancia del plasma representaba en una
celda de 1cm en la longitud de onda apropiada fue 0.323. Otra muestra de 1ml
de la solución de tintura original se diluyo exactamente a 1 litro en un matraz
volumétrico. Se tomó una alícuota de 10 mL de esta solución y se diluyó a 50
mL en un matraz de aforación. La A de la solución final fue de 0.20. Calcule el
volumen de sangre del hombre expresada en litros.

8. Muchas aminas forman sales cristalinas con el ácido pícrico. Todas

las soluciones en etanol de estas sales tienen casi el mismo espectro UV con
una λmax = 380nm y ε= 1.35*104, debido al componente picrato. El peso
molecular del ácido pícrico (2, 4, 6 trinitrofenol) C6H3N3O7 es de 229.1. Una
muestra de una amina desconocida se convirtió en picrato y la sal se

37
recristalizó y se secó. Se disolvieron 16.2 mg de la sal en 100 mL de etanol y
10 mL de esta solución se diluyeron a 100 mL. La A de esta solución fue de
0.624 a 380nm en una celda de 1cm.
a. Calcule el peso molecular de la amina
b. El químico orgánico que tenía la amina sospechaba que se trataba de
la 4 etil anilina C5H11N. Es la determinación del peso molecular confirmatoria?

Solución a los problemas

.0274mg 0.274 *10 −3 l

1. C = = = 0.027 g / l
10ml 10 *10−3 g
A 0 .7
a= = = 25.92
bc (1cm)(0.0274 g / l )

ε = aM
ε = (25.54)(118.14 g / mol )
ε = 3018.17

2.
20 µg 20 *10 −6 g
C= = = 2 *10 −3 g / l
10ml 10 *10 −3 l
A 0.397
a= = = 188.5
bc (1cm)(2 *10 −3 g / l )

ε = aM = (198.5)(55.85 g / mol )
ε = 1.108 *10 4

3.
A 0.142
C= = = 7.15 *10 −4 g / l
ab (198.5)(1cm)
A 0.142
C= = = 1.29 *10 −5 mol / l
εb 1.1*10 4

1mol > 55.85 g

1.29*10-5 >>>>>>>>>>>>> 7.2*10-4 g/l

A 0 .5
4. C = = = 5 *10 −6 mol / l Diluida
εb (1*10 )(1cm)
−5

38
C.sol´n _ original = (5 *10 −6 mol / l )(200)
C = 1*10 −3 mol / l

g
M =
PM .V
g = ( M )( PM )(V )
g = (1*10−3 mol / l )(100 g / mol )(1l )
g = 0.1g

5.
1g acero + HNO3 0.578g acero estándar

A = abCacero 0.25% Mn
Ast = abCst

Aacero = 2.36 Ast

abCacero = (abCst )2.36
Cacero = 2.36Cst

0.25% de 0.578g = 1.445*10-3g de Mn

Cst = 1.445 *10 −3 g / vol
Cacero = (2.36)(1.445 *10 −3 g / vol )
Cacero = 3.41*10 −3 g / vol
6.82 *10 −5 g / l

2g/L > 100%

6.82*10-3 >>>>>>>>>>>> 0.341% Mn

6.
A 0 .4 %
CMnO4 = = −3
= 2.214 *10 −4 mol / l
ab (2.24 *10 )(1cm)
(2.214 *10 −4 mol / l )(54.93 g / mol )

1mol MnO4 / l > 54.93 g de Mn +2 / l

2.214 *10 −4 mol >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 0.012 g / l Mn +2

0.525g / 0.1l > 2.25 g / l 2.25 g / l > 100%

0.012 g / l >>>>>> 0.23%

39
 7.
Solución en sangre Solución de Evans
As = as bCs AE = abC E
As AE
= ab = ab
Cs CE

As A
= ab = E
Cs CE
CE As
Cs =
AE

0.01ml 0.01ml
CE = = = 0.2ml / l
50ml 0.05l
(0.2ml / l )(0.323)
Cs = = 0.323ml / l
0 .2

En la sangre se tienen 0.323ml de solución de Evans por cada litro de

sangre ∴ 1ml se encuentra en 3.096 litros de sangre. #.096 represente el 53%

Total de sangre 5.84 litros.

8.
PM = 229.1
Amina + Acido pícrico > PM picrato ε = 1.33*104

16.2mg 100ml

100ml 10ml

1.62mg 16.2mg (1g )

Concentración = = = 0.162 g / l
0.1l l (1000mg )
A 0.624
a= = = 38.518 ε 1.35 *10 4
bC (1cm)(0.0162 g / l ) M = =
a 38.518
ε = aM
M = 350.48 del picrato
M de la amina = 350.48 − 229.1 = 121.38 g / mol

40
 Unidad IV. Espectroscopía infrarroja (I.R.)

La espectrometría del infrarrojo es sumamente útil para determinaciones

cualitativas de compuestos orgánicos y para deducir estructuras moleculares a
partir de sus grupos funcionales tanto de compuestos orgánicos como
inorgánicos.

En el análisis cualitativo la espectroscopia de infrarrojo puede usarse para la

identificación de sustancias puras o para la absorción, localización e
identificación de impurezas.

Para localizar una impureza en una sustancia se hace una comparación en el

espectro de las sustancia que se estudia y una muestra de la sustancia pura.
Las impurezas causan bandas de absorción adicionales que aparecen en el
espectro.

En el IR también se está encontrando uso cada vez mayor en el análisis

cuantitativo, el principal campo de aplicación de este tipo de análisis se halla en
la cuantificación de contaminantes atmosféricos que provienen de procesos
industriales.

La región del infrarrojo (del latín infra = debajo) del espectro corresponde a
energía que va desde valores inferiores a las frecuencias del visible hasta
valores que colindan con frecuencias más altas que el microondas y radar: es
decir abarca longitudes de onda entre 8*10-5cm–1 y 10-2 cm-1. Los
espectrofotómetros infrarrojos normales trabajan a la mitad de esta región a
longitudes de onda 2.5*10-4 cm y 25*10-4 cm que corresponde a energías desde
1.1 – 11 Kcal por mol. Aunque los fotones infrarrojos no tienen la energía
suficiente para provocar transiciones electrónicas pueden hacer que vibren
grupos de átomos con respecto a los enlaces que los unen. Al igual que las
transiciones electrónicas, estas transiciones vibracionales corresponden a
energías específicas y las moléculas solo absorben radiación infrarrojo a
ciertas longitudes de onda y frecuencias.

La posición de una banda de absorción infrarrojo se especifica por su

longitud de onda medida en micrómetros o micras (µm). 1 micra = 10-6 m. Sin
embargo la unidad mas empleada en la reacción infrarrojo es el número de
onda ν que corresponde al número de ciclos (longitudes de onda) de la onda
en 1 cm. Este número de onda es el recíproco de la longitud de onda en
centímetros. Las unidades del número de onda son cm-1.

1 10000 µm / cm
ν (cm −1 ) = =
λ (cm) λ ( µm)

10000 µm / cm
λ ( µm) =
ν (cm −1 )

Por ejemplo:

41
 10000 µm / cm
ν = = 4000cm −1
2.5µm
10000 µm / cm
λ= = 4 µm
2500cm −1

El número de onda es proporcional a la frecuencia ν y por lo tanto

también es proporcional a la energía de la radiación ya que E = hν

3.1. Teoría de la absorción IR

Para explicar las vibraciones de una molécula, los enlaces covalentes
entre los átomos son representados como un resorte el cual si se estira, tiene
que haber una fuerza de restauración que jala entre si a los dos átomos hacia
la longitud de enlace de equilibrio. Por el contrario si el enlace es comprimido,
la fase de restauración empuja a los dos átomos, alejándolos. El estiramiento o
compresión del enlace para soltarlo es lo que hace que los átomos vibren.

Fuerza del resorte Fuerza del resorte

Long. de enlace en elequilibrio Estirado Comprimido

La frecuencia de la vibración de tensión depende de dos cantidades: las

masas de los átomos y la rigidez del enlace. Los átomos más pesados vibran
más lentamente que los más ligeros por ejemplo en un enlace C–D tiene una
característica L que el enlace C–H. En un grupo de enlaces con energías de
enlace similares. La D disminuye cuando aumenta el peso atómico.

Los enlaces más fuertes por lo general son más rígidos y necesitan de
mayor fuerza para extenderlos o comprimirlos por lo tanto vibran más
rápidamente que los enlaces más débiles (suponiendo que los átomos tengan
masas semejantes) por ejemplo los enlaces O – H son más fuertes que C – H y
por lo tanto los primeros vibran a mayor frecuencia. De igual manera los dobles
enlaces vibran a mayores frecuencias que los enlaces sencillos.

En un grupo de enlaces con átomos de masas semejantes la frecuencia

aumenta con la energía de enlace.

Frecuencia de tensionamiento de enlaces

Tipo de enlace Energía enlace kcal Frecuencia de tensión
C-C 83 1200
C=C 146 1660
C=C 200 2200
C–N 73 1200

42
 C=N 147 1650
C=N 213 2200
C–O 86 1100
C=O 178 1700
C–H 100 3000
C–D 100 2100
C–C 83 120

Existen muchas absorciones diferentes aparte de las vibraciones de

flexión. En una vibración de flexión las longitudes de los enlaces permanecen
constantes, pero los ángulos de enlace vibran con respecto a sus valores de
equilibrio.

Por ejemplo, los modos de vibración del grupo metileno serán:

Una molécula no lineal con n átomos tiene por lo general 3n – 6 modos

fundamentales de vibración por lo tanto CH4 tiene (3)5–6=9 modos
fundamentales y el etano 3(8) – 6 = 18 modos fundamentales por lo que el
número de absorciones en un espectro infrarrojo es bastante grande para
moléculas sencillas.

Es poco probable que dos campos diferentes tengan las mismas

fracciones para todas sus ubicaciones complejas. Por este motivo se considera
que el espectro infrarrojo de una huella dactilar de una molécula. De hecho la
región del espectro que contiene la mayor parte de estas vibraciones complejas
(600 – 1400 cm-1) se llama normalmente región dactilar del espectro.

43
 Como las vibraciones de tensión simple son las más características y
predecibles, el estado de la espectroscopia infrarroja se concentrará en ellas
aunque por el momento se ignoren las vibraciones de flexión.

Vibraciones activas e inactivas en infrarrojo

No todas las vibraciones moleculares absorben radiación infrarroja. Para
comprender cuales lo hacen y cuales no es necesario tener en cuenta la
interacción entre el campo electromagnético con un enlace molecular. La clave
de esta interacción esté en el momento dipolar del enlace. Un enlace con
momento bipolar puede visualizarse como una carga (+) y una (–) separadas
por un resorte. Si se coloca este enlace en un campo eléctrico este se estira o
se comprime dependiendo de la dirección del campo.

Cuando el campo eléctrico se encuentra en la misma dirección que un

enlace dipolar el enlace se comprime y disminuye su momento dipolar. Cuando
el campo se opone al momento dipolar, el enlace se estira y aumenta su
momento dipolar. Si esta por tensión y compresión alternas de enlace por la
onda electromagnética ocurre a la frecuencia de la velocidad natural de
vibración de la molécula se absorberá energía. Las vibraciones de enlaces con
momentos dipolares generalmente ocasionan absorciones infrarrojo y se dice
que son activas en infrarrojo.

Por otra parte si un enlace es simétrico y tiene momento dipolar cero, el

campo eléctrico no interacciona con el, por ejemplo el triple enlace del acetileno
tiene momento dipolar cero y sigue siendo cero si se estira o se comprime.
Como la ubicación no produce cambio en el momento dipolar no puede haber
absorción de energía y se dice que esta vibración es inactiva en infrarrojo y no
se observa una frecuencia característica con el espectro infrarrojo, por lo tanto
la clave de vibración activa en infrarrojo es que la vibración debe cambiar el
momento dipolar de la molécula.

En general si un enlace tiene un momento dipolar su frecuencia de

tensión origina una absorbancia en el infrarrojo sin embargo los enlaces con
momentos dipolares cero a veces tienen absorciones (generalmente débiles)
debido a las colisiones moleculares, rotaciones y otras vibraciones que las
hacen asimétricas durante una pequeña porción de tiempo.

4.2. Instrumentación
Medición del espectro infrarrojo
Un espectrofotómetro infrarrojo (Figura IV.1) mide las frecuencias de la
luz infrarroja que absorbe un compuesto. En un instrumento típico se emplean
dos rayos de luz. El rayo de muestra pasa a través de la celda de la muestra
que la mantiene en forma de capa delgada o en disolución. El rayo de
referencia pasa a través de la celda de referencia que contiene sólo disolvente.
Un espejo rotatorio permite que la luz de cada rayo llegue en forma alternada al
monocromador.

44
Figura IV.1. Esquema de un espectrofotómetro de doble haz. Las líneas
gruesas y obscuras indican una conexión mecánica; las líneas delgadas una
conexión eléctrica; las líneas de trazos indican la trayectoria de la radiación.

El monocromador emplea prismas o rejillas de difracción para permitir el

paso de solamente una frecuencia de luz hacia el detector.

La fuente más común de radiación infrarrojo es un filamento de Nicromo

con un centro de cerámica el cual brilla cuando una corriente eléctrica pasa a
través de el. Esta fuente es relativamente barata y accesible sin embargo tiene
poca intensidad. Una fuente más intensa es la Globar, la cual consiste de un
anillo de carbono de silicio de 50mm de largo y 4mm de diámetro.

• Monocromador. Prisma de NaCl o rejillas de dispersión.

• Detector. La mayoría de los detectores son simplemente termopares que
registran el calor incidente. Un tipo de estos detectores consiste en una
pieza de lámina de oro obscurecida.
• Detector Golay. Consiste en una celda de gas xenon que tiene una placa
de un metal conductor del calor. Cuando el metal es calentado por la luz,
este expande el gas atrapado produciendo una señal que es detectada por
un fototubo.

TRATAMIENTO DE MUESTRAS

MUESTRAS DE GASES
Se pueden obtener espectros de un líquido de bajo punto de ebullición o gas
permitiendo que la muestra se expanda en una celda especial y adecuada.
Este tipo de celdas puede variar desde centímetros hasta metros en la longitud
de la trayectoria de la luz. Las mayores longitudes de trayectoria se obtienen en
celdas compactas proporcionando superficies reflectoras internas de modo que
el haz hace numerosas pasadas por la muestra antes de salir de la celda. Por
lo general las celdas son de 10 cm de longitud. Las celda se vacía y se llena a
través de una válvula de aguja.

45
MUESTRAS LIQUIDAS
Al trabajar con soluciones diluidas en el infrarrojo ofrece ventajas como la
reproductividad de los datos, y además, eligiendo bien la concentración y la
longitud de la celda puede hacerse clara y evidente la forma y estructura de las
bandas que aparecen en el espectro de absorción y que son de mayor
importancia. A pesar de estas ventajas es difícil y a veces imposible encontrar
un líquido con la capacidad de disolvente deseada que no sea absorbido
fuertemente en la región espectral de interés y además puede ser que haya
alguna reacción entre muestra y disolvente por lo que es obvio evitar esta
técnica.

Entre los disolventes usados se encuentran: acetona, acetonitrilo, benceno,

ciclohexano, cloroformo, el disulfuro de carbono, el tetracloruro de carbono
estos dos últimos son volátiles, tóxicos y deben ser usados con precaución.
Cuando se necesario usar disolventes polares que afectarían la celda de sal
por que la disuelve se usan celdas de Irtran.

Los disolventes usados en el infrarrojo deben ser previamente desecados para

evitar las bandas de absorción del agua y prevenir el ataque a las ventanas de
la celda.

Las celdas infrarrojas suelen ser de 0.015 a 1 mm y son un poco más

estrechas que las usadas en la región del UV -Visible. La trayectoria de la luz
en esta gama normalmente requiere concentraciones de muestras de 0.1 a
10%. Generalmente las celdas son desmontables con espaciadores para
permitir variación en la longitud de la trayectoria.

Celdas de longitud fija de trayectoria son llenadas o vaciadas con una jeringa
hipodérmica.

Generalmente las celdas son de cloruro de sodio; estas finalmente se velan

debido a la absorción de humedad (Guardarlas en el desecador).

Cuando la cantidad de muestra es pequeña o cuando se dispone del disolvente

apropiado es común correr el espectro de líquido puro, la manera de llevar a
cabo el experimento es comprimir una gota de liquido puro entre dos placas de
sal de roca de 0.015 mm o menos de espesor. Las dos placas unidas por
capilaridad se montan en la trayectoria de la luz, este proceso no da datos de
transmitancia muy reproducibles, pero es satisfactoria para investigaciones
cualitativas.

Los líquidos puros o volátiles los podemos trabajar en las celdas desmontables.

46
Figura IV.2. Vista extendida de una celda desmontable de infrarrojo para
muestras líquidas. Se dispone de espaciadores de teflón con grosores de 0.015
a 1 mm.

MUESTRAS SOLIDAS
Cuando los sólidos no pueden disolverse en disolventes trasparentes en el IR
pueden ser suspendidos en un medio trasparente apropiado formando una
mezcla de dos fases. Una característica importante es que el tamaño de
partícula del sólido suspendido debe ser menor que la longitud de onda de la
radiación ya que si no se cumple esta condición se pierde parte de la radiación
por dispersión. Las técnicas comunes son dos:

Técnica del Amasado. Consiste en triturar finamente de 2 a 5 mgrs. de la

muestra en estudio (tamaño de partícula menor de 2m), colocar en un
portaobjetos una cantidad mínima de estos cristales y agregar de 1 o 2 gotas
de aceite pesado de hidrocarburo (Nujol). Si interfieren las bandas de
hidrocarburos, puede usarse fluoroluble o perfluoroqueroseno, y con la esquina
del portaobjetos o con una espátula hacemos una “masa”. Se toma una gota de
la muestra y se pone en la ventana de NaCl. Lo que hace el aceite es bloquear
la refracción de los cristales de la muestra.

Técnica de Pastillaje. Un miligramo de la muestra finamente triturada se

mezcla íntimamente con 100 mg de polvo de KBr desecado. La mezcla puede
hacerse en un mortero de ágata. Después se vierte con una espátula y con
mucho cuidado la cantidad suficiente de muestra para cubrir la matriz, para
uniformar la superficie cubierta se le pueden dar golpecitos. Después se cubre
con el émbolo y se le lleva a un prensa hidráulica a 240 Kgr/cm2 para obtener
un disco trasparente, al llegar a esa presión se deja unos 2 minutos y se
descomprime lentamente para evitar la ruptura de la pastilla. Se saca la matriz
de la prensa y se desliza delicadamente el émbolo, para separar la pastilla y
pasarla cuidadosamente al portamuestras. Se obtienen mejores resultados si
se forma el disco en el vacío para eliminar el aire ocluido, para eso es la
boquilla.

Después el portamuestras que contiene la pastilla se coloca en el paso del haz

del instrumento colocando el atenuador al 80% de transmitancia se corre el
espectrograma y se obtiene el espectro de absorción.

47
Film. Se recorta una cartulina de 4.9 cm de ancho por 7.6 cm de largo. A 2 cm
de uno de los extremos se dibuja una ranura exactamente centrada de 0.9 cm
de ancho por 2 cm de largo y se recorta. Sobre esta base se monta el polímero:
poliestireno, celofán, etc.

Se pone frente al haz del aparato colocando el atenuador de tal manera que el
graficador quede al 80% de transmitancia y se corre el espectrograma.

Se puede determinar el grosor del film , si se calcula el número de ondas (ΛN ) entre
dos longitudes de onda determinadas λ 1 y λ2, y se sustituye en la ecuación :

b= ΛN
2( λ1-λ2 )

4.3 Regiones espectrales importantes en IR

Presentación del espectro infrarrojo

El espectro infrarrojo puede dividirse en 3 regiones:

• Región de grupos funcionales 4000–1400
• Región dactilar 1400–910
• Región aromática 910–650 cm-1

Grupos funcionales: –OH, CH, -NH, -SH, C=O, C≡C, C=C, C=C-H y C≡C-H

4.4. Interpretación de espectros IR y aplicaciones

Espectroscopía de hidrocarburos
Los hidrocarburos solo tienen enlace C-C y C-H por lo que las
frecuencias de los enlaces C-C y C-H pueden indicar la presencia de dobles y
triples enlaces C-C (Figura IV.1). Los enlaces más fuertes absorben a
frecuencias más altas que los débiles debido a la mayor rigidez, los enlaces C-
C absorben a 1200, C=C en 1660 y C=C 2200.

Las absorciones de los dobles enlaces C=C son de mucha utilidad para
la determinación de estructura. La mayor parte de los enlaces sustituidos
asimétricamente producen vibraciones de tensión observables en la región
entre 1000-1680 cm-1. La frecuencia de vibración de tensión del doble enlace
depende si hay otro doble enlace cercano. Por ejemplo, cuando se tienen dos
dobles enlaces conjugados, el traslape de los enlaces π provoca una mayor
densidad electrónica en los dobles enlaces, por lo tanto son menos rígidos y
vibran a menor energía que un doble enlace aislado. Los dobles enlaces
absorben entre 1640 y 1680 cm-1 y los dobles enlaces conjugados entre 1620 y
1640 cm-1.

El efecto de la conjugación es aún marcado en compuestos aromáticos.

Los dobles enlaces aromáticos corresponden aproximadamente a 1 ½ enlaces
más que dobles enlaces verdaderos y por lo tanto son menos rígidos y por
consecuencia presentan una menor frecuencia de absorción, pues se
presentan alrededor de 1600 cm-1.

48
 C= aislado 1640 – 1680
C=C conjugado 1620 – 1640
C=C aromático aprox – 1600

Los triples enlaces en los alquinos son más fuertes que los enlaces
sencillos dobles y por lo tanto absorben luz infrarroja a mayores frecuencias. La
mayor parte de los triples enlaces tiene fracciones de tensión entre 2100 y
2200 cm-1. Los alquinos terminan por lo general dan señales nítidas de tensión
C=C de intensidad moderada. La absorción de tensión en los enlaces triples de
un alquino interno puede ser débil o estar ausente debido a la simetría del triple
enlace disustituído con momento dipolar muy pequeño o cero.

R–C=C–H tensión 2100 – 2200 cm-1

R–C=C–R tensión débil

Tensión de enlace C–H

Los enlaces C–H absorben generalmente en fracciones inferiores, muy
cercanos a 3000 cm-1, mientras que los que tienen carbonos hibridados sp2
absorben en valores superiores y cercanos a 3000 cm-1.

Un orbital sp3 tiene ¼ parte de carácter s mientras que un orbital sp2

tiene 1/3 parte de carácter s por lo que se espera que el enlace con el orbital
sp2 sea más fuerte que el enlace con sp3 y por lo tanto el primero tenga mayor
fuerza de vibración. El C–H de alquino terminal se forma con un orbital híbrido
sp con ¼ s el cual es más rígido que sp 2 y sp3 y absorbe a mayor frecuencia.

49
Figura IV.1. Espectros IR de hidrocarburos.

Otros grupos funcionales

El aspecto típico de un espectro IR es el que se muestra en la figura:

50
Cada absorción observable en el espectro corresponde a una vibración determinada de algún
enlace dentro de la molécula.

MODOS DE VIBRACIÓN DE LOS ENLACES

Hay diferentes modos normales de vibración en las moléculas, llevan asociado un movimiento
característico de los átomos, los principales son: las deformaciones de enlace, angulos de
valencia, angulos diedros, deformaciones fuera del plano, etc.

Deformación de enlace

Cada uno de estos tipos de vibración tiene asociada una frecuencia característica,
que puede ser calculada mediante la ecuación de Hooke para el movimiento
vibratorio:

υ = (1/2π)—√k/mA (ec. 1)

υ = (1/2π)—√k/u (ec. 2)

donde k es la constante de fuerza del enlace y u es la masa reducida del

sistema. Según sea la relación entre las masas de los átomos que intervienen
en el enlace, así usaremos la ecuación (1) cuando mA << mB o la (2) cuando
ambas masas sean equiparables.

Como ya se mencionó, en una molécula con n átomos deben aparecer 3n-6

bandas de tensión y flexión (3n-5 cuando la molécula es lineal); de todas ellas
solo darán una banda observable en el IR aquellas vibraciones que produzcan
un cambio en el momento bipolar (las vibraciones simétricas no aparecen en el
IR, pero se podrían observar en la espectroscopia Raman).

A la hora de identificar los grupos funcionales con la espectroscopia IR vamos

a considerar el espectro de IR dividido en varias zonas tal y como se mencionó
anteriormente. De acuerdo con dicha división se podrán identificar diversos
grupos funcionales, tal y como se indica en la siguiente Tabla:

51
 NUMERO NUMERO
GRUPO
GRUPO FUNCIONAL DE ONDA DE ONDA
FUNCIONAL
(cm-1) (cm-1)
OH 3100-3200 -C ≡ C- 2300-2100
(enlace de hidrógeno)
OH 3600 -C ≡ N ~ 2250
(sin enlace de hidrógeno)
Cetonas 1725-1700 -N=C=O ~ 2270
Aldehídos 1740-1720 -N=C=S ~ 2150
Aldehídos y cetonas α,β- 1715-1660 C=C=C ~ 1950
insaturados
Ciclopentanonas 1750-1740 NH 3500-3300
Ciclobutanonas 1780-1760 C=N- 1690-1480
Ácidos carboxílicos 1725-1700 NO2 1650-1500
1400-1250
Esteres 1750-1735 S=O 1070-1010
Esteres α,β-insaturados 1750-1715 sulfonas 1350-1300
1150-1100
δ-Lactonas 1750-1735 Sulfonamidas y 1370-1300
sulfonatos
1180-1140
γ-lactonas 1780-1760 C-F 1400-1000
Amidas 1690-1630 C-Cl 780-580
-COCl 1815-1785 C-Br 800-560
Anhidridos 1850- C-I 600-500
1740(2)

Como se puede observar la mayor parte de los grupos funcionales más

frecuentes en Química Orgánica presentan una absorción característica en el
espectro IR. Valgan como ejemplos los que se muestran a continuación:

52
53
54
 Unidad V. Espectroscopía de absorción atómica

5.1 Principios de la absorción atómica

Mientras que la mayoría de las técnicas espectroscópicas se utilizan para el

estudio y caracterización de moléculas o iones en su entorno cristalino, la
espectroscopía de emisión y absorción atómica se usa casi exclusivamente
para el análisis de átomos. Por consiguiente, la técnica resulta casi insuperable
como método de análisis elemental de metales. En principio, la espectroscopía
de emisión puede utilizarse para la identificación y para la determinación
cuantitativa de todos los elementos de la tabla periódica.

Cuando la transición se produce desde el estado fundamental hasta un estado

excitado del átomo mediante la absorción de radiación de una determinada
frecuencia (característica para cada átomo), estamos en el caso de las técnicas
de absorción. En el caso en que los átomos se lleven previamente a un estado
excitado y se mide la intensidad de la radiación emitida a la frecuencia
característica correspondiente a la transición desde el estado excitado al
estado fundamental, hablamos de técnicas espectrofotométricas de emisión. A
continuación se tratan las técnicas espectrofotométricas de absorción atómica,
de fotometría de llama y de emisión por plasma.

Pueden identificarse tres clases diferentes de procesos de emisión que

difieren en cómo la sustancia alcanza el estado excitado previo a la emisión.

a) Emisión a partir de una excitación electromagnética.

b) Emisión a partir de excitación térmica.

c) Emisión a partir de excitación eléctrica.

Los tipos más importantes de espectros de emisión se basan en la utilización

de energía no electromagnética para llevar a un átomo o a una molécula al
estado excitado, a partir del cual se miden las emisiones de radiación. El
proceso puede describirse según:

X + (energía eléctrica o térmica) ® X* (excitación)

X* ® X + hv (emisión)

• Fotometría de llama

Es una técnica de emisión que utiliza una llama como fuente de excitación y
un fotodetector electrónico como dispositivo de medida. Se trata principalmente
de un método de análisis cuantitativo y es uno de los métodos más sencillos y
precisos para el análisis de metales alcalinos, la mayor parte de los metales
alcalinotérreos y algún otro elemento metálico. También es posible realizar un
análisis cualitativo examinando todas las longitudes de onda del espectro de
emisión (espectrofotometría de llama o fotometría de llama). Su aplicación es
limitada si se compara con la espectroscopía de emisión ordinaria, ya que la

55
energía de la llama permite excitar únicamente de 30 a 50 elementos, siendo
este número función del tipo de llama utilizada. La muestra debe estar disuelta.

Espectroscopía de absorción atómica

Es una técnica muy relacionada con la fotometría de llama ya que se utiliza

una llama para atomizar la disolución de la muestra de modo que los elementos
a analizar se encuentran en forma de vapor de átomos. Ahora bien, en
absorción atómica existe una fuente independiente de luz monocromática,
específica para cada elemento a analizar y que se hace pasar a través del
vapor de átomos, midiéndose posteriormente la radiación absorbida.

En la siguiente figura se compara un esquema de espectrofotómetro de

emisión de llama (a) y él de absorción atómica (b).

Dada la estrecha relación existente entre absorción atómica y fotometría de

llama es inmediata una comparación entre ellas. En fotometría de llama la
sensibilidad es proporcional al número de átomos que se han excitado,
mientras que, en absorción atómica la sensibilidad depende del número de
átomos que se encuentran en el estado fundamental. Normalmente, tan sólo un
pequeño porcentaje de átomos se encuentran en estado excitado en la llama.
Por lo tanto, la absorción atómica da lugar, en general, a una mayor
sensibilidad que la fotometría de llama para un gran número de elementos.

56
 Además, la absorción atómica es una técnica que presenta menos
interferencias y es más simple que la fotometría de llama, lo que explica el
espectacular desarrollo de la técnica en los últimos años. Hay que señalar que
a pesar de ello, la absorción atómica no ha eliminado el uso de la fotometría,
sino que ambos métodos deben considerarse complementarios, siendo la
sensibilidad de cada uno de ellos superior a la del otro para determinados
elementos.

Las ventajas fundamentales de la utilización de la llama como fuente de

excitación son que los espectros son muy sencillos y que los resultados
cuantitativos tienden a ser más reproducibles. Los espectros son sencillos
debido a la baja energía de excitación de la llama que da lugar a pocas líneas
de emisión. Este hecho hace disminuir el problema de las interferencias
espectrales a partir de líneas y bandas de otros elementos y además no implica
la necesidad de un monocromador de elevada resolución. La mayor
reproducibilidad de estos métodos se debe al mejor control de las variables en
una excitación por llama.

Las dos desventajas más importantes de los métodos de emisión en llama

son que la energía de excitación es demasiado baja para la mayoría de los
elementos y que la muestra debe estar disuelta. En absorción atómica la baja
energía no es una desventaja tan importante ya que la misión de la llama, en
ese caso, es únicamente atomizar la muestra y formar un vapor de átomos sin
excitar; por esta razón es aplicable a un mayor número de elementos que la
fotometría de llama.

La diferencia entre fotometría de llama y absorción atómica radica

principalmente en los distintos métodos de medida de las señales.

5.2. Instrumentación para absorción atómica

Un espectrofotómetro de absorción atómica es básicamente un

espectrofotómetro de llama al que se le ha añadido una fuente de radiación.
Para conseguir eliminar la señal de fotometría de llama y recoger únicamente la
de absorción se modula la fuente de cátodo hueco.

a) Fotómetros de llama

Existe una gran variedad de equipos que van desde los fotómetros de filtro de
haz único a los espectrofotómetros de multicanal con corrección automática del
ruido de fondo.

b) Espectrofotómetros de absorción atómica

En los últimos años se han desarrollado a gran velocidad los

espectrofotómetros de absorción atómica y en el mercado existen desde los
instrumentos muy sencillos de haz simple hasta diseños complejos
automatizados. La mayoría de los instrumentos se diseñan de modo que
puedan utilizarse en fotometría de llama. En la siguiente figura se recoge el

57
diagrama de bloques de espectrofotómetros de absorción atómica.

Función y condiciones de las llamas

La llama tiene tres funciones básicas: permite pasar la muestra a analizar del
estado líquido a estado gaseoso; descompone los compuestos moleculares del
elemento de interés en átomos individuales o en moléculas sencillas y excita
estos átomos o moléculas.

Las condiciones que debe cumplir una llama para considerarla satisfactoria
es que tenga la temperatura adecuada y que en ella se forme un ambiente
gaseoso que permita las funciones mencionadas. Además, el ruido de fondo de
la llama no debe interferir las observaciones a efectuar.

Una llama típica consta de: cono interno, cono externo y zona entre conos
como podemos observar en la siguiente figura.

58
 El cono interno es la zona en que tiene lugar, generalmente, una combustión
parcial, es decir sin equilibrio térmico. Esta zona se calienta por conducción y
radiación a partir de la región más caliente que se encuentra sobre ella. En ella
se forman los productos de oxidación intermedios, se produce una gran
emisión de luz (a partir del combustible y no de la muestra), una elevada
ionización y una gran concentración de radicales libres. Es muy poco utilizada
para trabajo analítico.

Inmediatamente encima de la región del cono interno se encuentra la zona

interconal Es la llamada parte caliente de la llama y en ella tiene lugar una
combustión completa y se alcanza casi un equilibrio termodinámico. Esta llama
es la que se utiliza prácticamente en análisis por fotometría de llama y
espectroscopía de absorción atómica. La altura de esta zona sobre el
quemador varía considerablemente con el tipo de quemador, la naturaleza de
los gases utilizados y su velocidad de flujo.

La región del cono externo es una zona de combustión secundaria en la que

los productos parcialmente oxidados como el monóxido de carbono pueden
completar su combustión. Esta región se enfría por el aire circundante y es, en
general, una región poco útil.

Fenómenos que tienen lugar en la llama

1. - Se evapora el agua o los otros disolventes dejando como residuo

diminutas partículas de sal seca.

2. - La sal seca se vaporiza, es decir, pasa al estado gaseoso.

3. - Las moléculas gaseosas, o una parte de ellas, se disocian

progresivamente dando lugar a átomos neutros o radicales. Estos átomos
neutros son las especies absorbentes en espectroscopía de absorción atómica
y son las especies emisoras en fotometría de llama.

59
 4. - Parte de los átomos neutros se excitan térmicamente o se ionizan. La
fracción excitada térmicamente es importante en análisis por fotometría de
llama ya que el retorno al estado fundamental de los electrones excitados es el
responsable de la emisión de la luz que se mide.

5. - Parte de los átomos neutros o de los radicales que se encuentran en la

llama pueden combinarse para formar nuevos compuestos gaseosos. La
formación de estos compuestos reduce la población de los átomos neutros en
las llamas y constituye las llamadas interferencias químicas que se presentan
en los métodos de análisis que utilizan llamas.

La eficacia con que las llamas producen átomos neutros tiene mucha
importancia. La llama de óxido nitroso-acetileno, que es más caliente que la de
aire acetileno, parece ser más efectiva para la formación de átomos neutros.
Los metales alcalinos son una excepción, probablemente debido a que la
ionización es apreciable en la llama caliente. En cualquier caso, estos dos tipos
de llama son los más adecuados para fotometría de llama y absorción atómica.

A las temperaturas ordinarias de llamas es relativamente baja la fracción de

átomos del estado fundamental que se excita. Únicamente si la temperatura de
la llama es muy elevada la fracción de átomos excitados empieza a ser
apreciable. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de controlar la
temperatura de la llama cuidadosamente para fotometría de emisión. Por el
contrario, la fracción de átomos en el estado fundamental es muy elevada y,
por lo tanto, pequeñas fluctuaciones en la temperatura de la llama no son
importantes para el análisis por absorción atómica.

La ionización que tiene lugar en las llamas produce normalmente la pérdida

de un sólo electrón y se puede representar:

A ® A+ + e-

A = átomo neutro

A+ = su ion positivo

e- = electrón libre

Este proceso de disociación depende de la concentración o de la presión, ya

que una especie se disocia en dos. Al aumentar la presión parcial de los
átomos en la llama, el porcentaje de ionización disminuye tal como debe
esperarse de la aplicación de la ley de Le Chátelier.

A la temperatura de la llama acetileno-oxígeno la mayor parte de los

elementos se encuentran apreciablemente ionizados. El grado de ionización del
elemento a analizar puede disminuirse por adición de una elevada
concentración de otro elemento que sea más fácilmente ionizable (tampón de
radiación o supresor de ionización).

60
 Es preferible, por lo general, suprimir de este modo la ionización a utilizar
temperaturas de llama más bajas que hacen aumentar las interferencias
químicas.

UNIDAD VI. CROMATOGRAFÍA

6.1. Conceptos generales

La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos
físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases
mutuamente inmiscibles. La fase estacionaria y la móvil. Una muestra que se
introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que
contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra
experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los
componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase
móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden
creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos
retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El
reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas
y/o químicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes
(picos) se separan cuando el pico que sale después es retardado lo suficiente
para impedir la sobreposición con el pico que emergió antes.

Una amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y

estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus
propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la distribución de un
soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las
moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o
repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases
competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza
polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden
deberse a fuerzas de dispersión del tipo London.

Parámetros teóricos que afectan la separación cromatográfica

- Comportamiento cromatográfico de los solutos.

El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas
formas. Se considera importante introducir las definiciones de algunos términos
importantes para la cromatografía en columna (ver figura), como son:

Tiempo de retención, tr. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se

mide desde el momento de la inyección hasta la elusión del pico máximo. Es

61
característico del soluto para condiciones de operación constantes. Auxiliar en
la identificación de los solutos.

Tiempo muerto, t0. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en
la fase estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase móvil.
Representa el espacio vacío de la columna.

Tiempo de retención ajustado, t’r. Mide el tiempo que el componente

permanece en fase estacionaria.
t’r = tr – t0
Ancho a la base, W b. Es la porción de la línea base intersectada por las
tangentes al pico. Para un pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado
en el cálculo de la eficiencia del sistema.

Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida mas reproducible, adecuada

para evaluar manualmente la eficiencia del sistema (platos teóricos).

Número de platos teóricos (N). Cada plato teórico representa un equilibrio

teórico de distribución del soluto entre las fases. El número total de platos
teóricos de una columna representa el poder de separación de la columna. Una
buena columna tiene un número alto de platos teóricos. Se calcula con
cualquiera de las ecuaciones:

Comportamiento de retención
El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase
móvil y la estacionaria. El volumen de fase móvil necesario para transportar la
banda de soluto desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el
detector (en el máximo del pico del soluto) se define como el volumen de
retención, Vr. Se puede obtener directamente del cromatograma multiplicando
el tiempo de retención correspondiente, tr, por el gasto o flujo volumétrico, Fc,
expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo.

Vr = tr Fc

El gasto o flujo volumétrico, en términos de los parámetros de la columna,

depende la sección transversal de la columna vacía, la porosidad total del
relleno (empaque) de la columna y la velocidad lineal promedio de la fase
móvil.

Coeficiente de repartición
Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o
distribuye entre la fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en
cualquier momento el soluto establece un equilibrio de distribución entre las
dos fases. La concentración en cada fase está dada por el coeficiente
termodinámico de partición (o reparto):

K = Cs / Cm
62
donde Cs y Cm son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y
móvil, respectivamente.
Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos
fases. El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona
de soluto, más específicamente, del centro de la zona de soluto conforme la
fase móvil avanza a lo largo de la columna.

Resolución
El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como
la distancia entrelos picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las
bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo
(ver figura 2), la resolución está dada por:

Rs= 2(tr,2 – tr,1)/(W b,2+Wb,1)

donde los tiempos de retención y los anchos se expresan en las mismas

unidades. La resolución mínima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver
figura 3), una resolución de 1.5 representa separación a la línea base.

La resolución alcanzada en un sistema es proporcional al producto de la

selectividad, la eficiencia y la capacidad del sistema, que son los tres más
importantes parámetros de control en una columna cromatográfica, siendo la
expresión analítica para Rs la siguiente:

La resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la

separación de los picos o disminuyendo los anchos de los picos individuales.

63
Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan más los picos y la
eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico.

Factor de Capacidad
El factor de capacidad o retención k es la cantidad más importante de
cromatografía en columna. Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra
dentro de la columna con las propiedades termodinámicas de la columna y con
la temperatura. Para un conjunto dado de parámetros de operación, k es una
medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relación el tiempo
transcurrido en fase móvil. Se define como el cociente de los moles de un
soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase móvil:

La razón volumétrica de fases, Vm / Vs, se denota usualmente por β. Así, k’ = K

/ β. Dicho de otra forma, la razón de reparto es el tiempo adicional que una
banda de soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido
(para el cual k’ = 0), dividido entre el tiempo de elusión de una banda no
retenida:

Capacidad
La capacidad en un intercambiador iónico es una medida cuantitativa de su
habilidad de tomar contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser
expresada como la capacidad iónica total, capacidad disponible o capacidad
dinámica. La capacidad iónica total es el número de sustituyentes cargados por
gramo drenado de intercambiador iónico o por mL de gel hidratado. La
capacidad total puede medirse por titulación con un ácido o base fuerte.

Eficiencia
La eficiencia de la columna está relacionada con el ensanchamiento de la
banda que se encuentra en la columna y puede ser calculada:

donde W 1/2 es el ancho del pico a una altura media y se expresa como un
número de platos teóricos (N) para la columna bajo condiciones experimentales
específicas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el número de
platos teóricos por metro de cama cromatográfica, o expresada como H que es
la longitud de la cama (L) dividida por el número de platos teóricos.

H=L/N

A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales

tales como la velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las

64
comparaciones sean hechas bajo condiciones idénticas. En el caso de la
cromatografía de intercambio iónico, la eficiencia se mide bajo condiciones
isocráticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por
ejemplo, la acetona. Mejorar la cinética del sistema aumenta la eficiencia de la
separación.

Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama

cromatográfica es la difusión longitudinal de moléculas de soluto. El efecto se
minimiza si las distancias disponibles para difusión, en ambos la fase móvil y la
fase estacionaria, son mínimas. En la práctica esto se logra usando tamaños
de cuentas uniformes y pequeños. La mayor eficiencia se logra con
minicuentas de 3µm de diámetro, no porosas diseñadas para aplicaciones
analíticas y micropreparativas. Después del tamaño de cama, el segundo factor
importante es una buena técnica experimental. Las camas cromatográficas
empaquetadas irregularmente y burbujas de aire en ellas, producirán canales,
ensanchamiento de la zona y pérdida de la resolución. Las buenas
separaciones requieren columnas bien empaquetadas.

Selectividad
La selectividad (α) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por
ejemplo la distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser
calculado del cromatograma usando la expresión:

Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad

implica alterar la termodinámica del sistema cromatográfico.

Rs está relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de

forma cuadrática con la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro
veces en la eficiencia es necesario para duplicar la resolución en condiciones
isocráticas.

La selectividad en la cromatografía de intercambio iónico depende no solo de la

naturaleza y número de grupos iónicos en la matriz, también depende del pH y
fuerza iónica.

6.2. Tipos de cromatografía (Clasificación)

La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado,
mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. Así la
cromatografía puede ser de (1) adsorción, (2) partición, (3) intercambio iónico,
(4) exclusión, y (5) afinidad (ver figura 4).

65
Nota. Estas son clasificaciones arbitrarias de la técnicas cromatográficas, y
algunos tipos de cromatografía se les considera juntas como una técnica
separada, como la cromatografía de gases para la cromatografía gas-sólido y
gas-líquido. En cualquier caso, los equilibrios sucesivos son los que determinan
cuanto tiempo el analito permanecerá unido o se moverá con el eluyente (fase
móvil).

66
6.2.1. Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son
adsorbidos. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o
un gas (cromatografía gas-sólido); los componentes se distribuyen entre dos
fases a través de la combinación de los procesos de adsorción y desorción. La
cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por
adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte
sólido en un plato inerte.

6.2.2. Cromatografía de partición

La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en
un sólido inerte. De nueva cuenta, la fase móvil puede ser un líquido
(cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición
gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de
partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una
hoja de papel.

La cromatografía de gases es la técnica a elegir para la separación de

compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles. La
disponibilidad de detectores versátiles y específicos, y la posibilidad de acoplar
el cromatógrafo de gases a un espectro de masas o a un espectrofotómetro de
infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la cromatografía de gases.

Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados

para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase
móvil), 2) permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de
gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4)
mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa
de temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen
de la columna, y 6) proveer una señal legible proporcional en magnitud a la
cantidad de cada componente.

Sólo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por
cromatografía de gases, ya sea por que son insuficientemente volátiles y no
pasan a través de la columna, o porque son térmicamente inestables y se
descomponen en las condiciones de separación.

La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-

performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar
macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales
poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso
molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La
separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones
específicas entre las moléculas de la muestra con ambas fases, móvil y
estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase móvil
para la cromatografía de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases
estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones
selectivas y más posibilidades para la separación.

67
El recobro de la muestra es fácil en la HPLC. Las fracciones separadas se
recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la
columna. El recobro es usualmente cuantivativo (exceptuando la adsorción
irreversible en la columna) y los componentes separados son fácilmente
asilados del disolvente de la fase móvil. Adicionalmente al tipo usual de
compuestos orgánicos, la cromatografía líquida en columna puede manejar
separaciones de compuestos iónicos, productos lábiles de origen natural,
materiales poliméricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular.

En el modo normal de operaciones de partición líquido-líquido, una fase

estacionaria polar (p. ej. agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no
polar (p. ej. hexano). Esto favorece la retención de compuestos polares y la
elusión de compuestos no polares y se le conoce como cromatografía fase
normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase móvil polar,
entonces los solutos no polares serán retenidos y los solutos polares eluidos.
Esto se conoce como cromatografía por fase reversa.

El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa depende de

interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el
ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de
las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el
resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión
de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo
cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las
moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto que une
al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta
hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua
disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.

6.2.3. Cromatografía de intercambio iónico

La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción
reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de
carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de
intercambio iónico. Muchos de los experimento de intercambio iónico se llevan
a cabo en cinco etapas.

La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se

encuentra en las condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá
la unión de las moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se
intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente
aniones o cationes simples, como cloruro o sodio).

En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción,

en la cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento
de carga de los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias
que no se unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer
inicial.

68
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las
condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las
moléculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se
logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH.
En la cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no
eluídas bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de
las condiciones iniciales para la siguiente purificación.

La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen

diferentes grados interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias
en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie.
Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la
fuerza iónica y el pH. Las diferencias en propiedades de carga de compuestos
biológicos son a menudo considerables, y tomando en cuenta que la
cromatografía de intercambio iónico es capaz de separar especies con
propiedades poco diferentes. Se pueden llevar a cabo separaciones por
intercambio iónico en una columna, mediante un procedimiento en lote o por
adsorción en cama extendida.

La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la

cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se
asocian a contra-iones móviles. Estos contra-iones pueden intercambiarse
reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.

La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los
intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados
negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por lo que son
llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados
negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les
conoce como intercambiadores catiónicos.

La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o

polisacáridos. Las características de la matriz determinan sus propiedades
cromatográficas tales como su eficiencia, capacidad y recuperación, así como
su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz
afectará su comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de
la actividad biológica.

Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad

fundamental de un intercambiador iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y
fuerza del intercambiador iónico; su número total y disponibilidad determina la
capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para usarse en
intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación.

69
Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores
iónicos fuertes, los otros grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los
términos fuerte y débiles se refieren a la extensión de variación de ionización
con pH y no a la fuerza del enlace.

Los intercambiadores iónicos fuertes están completamente ionizados en un

amplio rango de pH mientras que con los intercambiadores iónicos débiles, el
grado de disociación y la capacidad de intercambio varían más marcadamente
con el pH.

6.2.4. Cromatografía de exclusión por tamaño

En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de
acuerdo a su tamaño y habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase
estacionaria).

La separación en cromatografía de partición y en cromatografía de intercambio

iónico se logra de diferentes interacciones de solutos con la fase móvil y la fase
estacionaria. En contraste, las separación en cromatografía de exclusión por
tamaño se lleva a cabo por diferencias en tamaño molecular y la habilidad de
diferentes moléculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a
diferentes tamaños o magnitudes.

La cromatografía de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las

separaciones preparativas de macromoléculas de origen biológico, así como
para la purificación de polímeros orgánicos sintéticos.

6.2.5. Cromatografía de afinidad

Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un
tipo de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente
(inmovilizada) a la fase estacionaria. Por ejemplo, la molécula inmovilizada
podría ser un anticuerpo específico para un proteína particular.

Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de
una columna, sólo una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la
columna. Después de lavar todos los otros solutos de la columna, la proteína
deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el pH, la fuerza iónica o la
polaridad.

70
Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el
resultado de interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas
de van der Waals y/o puentes de hidrógeno.

La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser

unido covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe
retener su afinidad específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después
de lavar el material no unido, la unión entre la molécula blanco y el ligando
debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean removidas en
forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para
purificar a su compañero respectivo. Algunas interacciones biológicas típicas
usadas frecuentemente en cromatografía de afinidad son:

Enzima sustrato análogo, inhibidor, cofactor.

Anticuerpo antígeno, virus, célula.

Lecitina polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula.

Ác. nucleico secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de
ácidos nucleicos, proteína de unión al DNA.

Hormona, vitamina receptor, proteína acarreadora.

Glutatión glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST

Iones metálicos proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con
histidina, residuos de cisteína y/o triptofano en sus superficies.

La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o

indirectamente acoplado.
Algunas características importantes para ésta son:

adsorción no específica extremadamente baja es esencial ya que el éxito
de la cromatografía de afinidad depende de interacciones específicas,

los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a
un ligando, proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de
afinidad,

la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún
para biomoléculas grandes porque el interior de la matriz estaría disponible
para el ataque de ligandos,

propiedades de fluido buenas para la rápida separación,

estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH
alto y bajo, detergentes y agentes disociadores.

El ligando. Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas

o grupo de moléculas, capacita la purificación por cromatografía de afinidad.
La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por
dos factores:
El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la
sustancia blanco y debe tener grupos químicamente modificables que permitan
ser unidos a la matriz sin destruir su capacidad de unión.

Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se

localizan dentro de la molécula y un medio de afinidad preparado con
pequeños ligandos acoplados directamente a la columna puede exhibir una
capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por ejemplo, el
ligando no podría accesar al sitio de unión de la molécula blanco. En estas

71
circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para
facilitar la unión específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para
maximizar la unión específica.

6.3. APLICACIONES
La cromatografía de adsorción es particularmente adecuada para el análisis de
moléculas no ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que
frecuentemente son isómeros o compuestos muy relacionados. El intervalo de
compuestos que pueden separarse se extiende desde los hidrocarburos muy
polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta
cromatografía se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y más
por los grupos funcionales específicos. En consecuencia, la separación por
adsorción de compuestos que difieren solamente en el grado o tipo de
sustitución alguilo, como en los miembros de las series homólogas, es pobre.
Esta cromatografía se utiliza en la separación de la vitamina D3 y sus
metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas
vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos
tricíclicos, bloqueadores beta y los PTHamino ácidos. Los aceites naturales y
los extractos de esencias se analizan fácilmente y los pigmentos menos
polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han
separado con éxito durante muchas décadas. Los ésteres también son factibles
de ser separados, siendo los glicéridos y los ftalatos típicos de esta clase de
compuestos. También han sido separadas en clumnas de sílice las aflatoxinas
y otras micotoxinas.

En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis

cuantitativo de las drogas de abuso por medio de la cromatografía de fase
reversa. Los productos farmacéuticos que se analizan en forma rutinaria
incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y sedantes.
Aplicaciones adicionales de los métodos de fase reversa son los conservadores
alimentarios, herbicidas y azúcares. En el campo farmacéutico ha venido en
aumento el uso de esta técnica a costa de la cromatografía de adsorción. Un
amplio espectro de biomoléculas, lipofílicas o iónicas, pequeñas o grandes,
pueden ser separadas debido a que el contenido de agua en la fase móvil
puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en
absoluto.

Los compuestos lipofílicos, tal como los triglicéridos, que tienen una solubilidad
muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con frecuencia
pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna
empacada de octadecilo y disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo o
el tetrahidrofurano.
En la actualidad, la cromatografía ha alcanzado tal nivel de fineza y
especialización que cada uno de sus tipos constituyen herramientas
imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la industria
química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica, en
alimentos, etc.

72
BIBLIOGRAFÍA

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73