OXIDATIVE COUPLING OF COUMARINS CATALYZED BY

LACCASE

TUGAS MAKALAH
KLASTER III C

AVICIENA AKBAR E 1706032755

HEIDAR 1706033202
JUVALDO VIKENDRO SITORUS 1706032686
RAFLY ABRAR FADHILSYAH 1706025996

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK
2020
 ABSTRAK
Lakase(LAC) termasuk ke dalam enzim multi tembaga lignolitik oksidase ,
dan telah dianggap sebagai sebuah alat yang penting untuk membuat beberapa
dimer yang penting dalam aplikasi bioteknologi. Dalam studi ini, 16 kumarin 1-16
dideteksi untuk menyelidiki kemampuan katalis LAC dan 3 kumarin 6,7, dan 16
dapat di katalis untuk menghasilkan 3 turunan kopling kumarin dengan aseton
6a,7a, dan 16 a. Potensi mekanisme interaksi dari 3 kumarin 6, 7, dan 16 dengan
LAC dianalisis dengan molecular docking. Analisis kinetic dari reaksi katalisis
untuk kumarin 6,7, 16 dengan LAC dilakukan dengan menggunakan transformasi
produk 6a,7a, dan 16a sebagai bahan standar. Nilai Km dari kumarin 6,7, dan 16
berkisar berturut-turut dari 0.87 ± 0.07 µM sampai 2.74 ± 0.29 µM. Penemuan ini
menyarankan bahwa LAC adalah metode yang dapat diandalkan untuk
mengkatalisis kopling oksidatif.

i
 KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kami panjatkan akan kehadirat Allah SWT atas nikmat dan
karunia-Nya sehingga makalah yang berjudul “OXIDATIVE COUPLING OF
COUMARINS CATALYZED BY LACCASE” dapat terselesaikan. Penulisan makalah ini
dilakukan dalam rangka memenuhi tugas pada mata kuliah Klaster III. Selain itu,
makalah ini juga bertujuan untuk menambah wawasan tentang Oksidasi Kopling bagi
para pembaca dan juga bagi penulis. Kami mengucapkan terima kasih kepada semua
pihak yang telah membagi sebagian pengetahuannya sehingga kami dapat
menyelesaikan makalah ini. Kemudian kami juga mengucapkan terimakasih kepada
dosen pengampu mata kuliah klaster III yang telah membimbing kami menyelesaikan
makalah ini.
Dengan menyelesaikan makalah ini kami mengharapkan banyak manfaat yang
dapat dipetik dan diambil dari makalah ini. Semoga dengan adanya makalah ini dapat
menambah pengetahuan mengenai oksidasi kopling

Depok, 01 Maret 2020

Penulis

ii
 DAFTAR ISI

ABSTRAK..................................................................................................................................i

KATA PENGANTAR...............................................................................................................ii

DAFTAR ISI.............................................................................................................................iii

BAB I PENDAHULUAN..........................................................................................................1

1.1 LATAR BELAKANG.......................................................................................................................

1.2 RUMUSAN MASALAH...................................................................................................................

1.3 TUJUAN............................................................................................................................................

1.4 METODE PENELITIAN...................................................................................................................

1.4.1 METODE DAN BAHAN UMUM.............................................................................................

1.4.2 BIOTRANSFORMASI KUMARIN OLEH LAC......................................................................

1.4.3 MOLECULAR DOCKING........................................................................................................

BAB II PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN........................................................................5

2.1 PERCOBAAN PENYARINGAN.....................................................................................................

2.2 PREPARASI DAN PERCOBAAN...................................................................................................

2.3 IDENTIFIKASI STRUKTUR...........................................................................................................

2.4 POTENSI MEKANISME..................................................................................................................

2.5 ANALISIS KINETIK PEMBENTUKAN PRODUK 6A, 7A, DAN 16A........................................

BAB III.......................................................................................................................................9

3.1 KESIMPULAN..................................................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA..............................................................................................................10

iii
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Lakase(LAC) termasuk ke dalam enzim multi tembaga lignolitik oksidase
biru pertama kali ditemukan dalam Rhus vernicifera (pohon urushi) oleh Yoshida
pada tahun 1883, dan banyak ditemukan di prokariot, fungi, serangga, dan
tumbuhan tingkat tinggi. Secara umum, lakase adalah ekstraseluler glikoprotein
dengan berat molekul 60-80kDA dan aktivitas oksidasinya dengan potensi redoks
berkisar dari 450-480 mV hingga 760-790 mV. Karena hal tersebut, lakase dapan
mengkatalis reaksi oksidasi substratnya dengan seiring reduksi 4 elektron dari
molekul oksigen ke air, mengarahkan pembentukan radikal bebas. Lakase dapat
mengoksidasi substrat mirip seperti p-difenol seperti, polifenol, diamin dan fenol
tersubstitusi metoksi, menghasilkan turunan quinoid atau homomolekul dimer
yang dihubungkan melalui ikatan C=C atau C=O dengan kondensasi oksidatif
atau kopling oksidatif. Karena hal tersebut, lakase telah dianggap sebagai sebuah
alat penting untuk menghasilkan beberapa dimer penting untuk aplikasi dalam
bioteknologi.
Kumarin adalah jenis senyawa alamiah turunan dari turunan asam sinamat
yang tersebar luas pada tanaman rutaceae, umbellifers, polong dan anggrek.
Tanaman tersebut memiliki anti-inflammatory, anti-tumor, dan anti aktivitas
oksidasi, oleh karena itu tanamaan tersebut menarik perhatian kimiawan dan
apoteker(ahli farmasi). Sebagai bagian dari kelanjutan studi kami untuk
menemukan bioaktivitas kumarin, 16 kumarin 1-16(Tabel 1) digunakan untuk
memeriksa kemampuan katalitik dari LAC, mengarah ke produksi 3 turunan
kumarin kopling dengan aseton 6a,7a, dan 16a. Potensi mekanisme interaksi dari
3 kumarin 6,7, dan 16 dengan LAC dianalisis dengan molecular docking.

1
1.2 RUMUSAN MASALAH
a) Bagaimana pengaruh penggunaan LAC dalam oksidasi kopling kumarin?
b) Bagaimana pengaruh gugus fungsi hidroksil dalam reaksi oksidasi kopling
kumarin?

1.3 TUJUAN
a) Mengetahui pengaruh penggunaan LAC dalam oksidasi kopling kumarin
b) Mengetahui pengaruh gugus fungsi hidroksil dalam reaksi oksidasi kopling
kumarin

1.4 METODE PENELITIAN

1.4.1 METODE DAN BAHAN UMUM
Laccase dari Trametes versicolor (N0.5 U / mg) dibeli dari Shanghai
Yuanye Co. Ltd., China. 6,8-Dimethoxy-7-hydroxycoumarin (1), 6-hydroxy-
coumarin (2), 6-hydroxy-4-methylcoumarin (3), 7-hydroxy-coumarin (4), 7-
hydroxy-4-methylcoumarin ( 5), 4-metil-7,8-dihydroxycoumarin (6), 7,8-
dihydroxy-4-phenyl coumarin (7), esculin (8), 4-hydroxycoumarin (9),
ethylcoumarin-3-carboxylate (10) , coumarin-3-carboxylic acid (11), dicoumarol
(12), 6-Methylcoumarin (13), coumarin (14), 6,8-dimethoxy-coumarin-7-β-D-
glucoside (15), dan 7, 8-dihidroksi-kumarin (16) diisolasi oleh penulis,
kemurniannya N98% dianalisis dengan HPLC.

1.4.2 BIOTRANSFORMASI KUMARIN OLEH LAC

Biotransformasi skala layar dilakukan dalam sistem reaksi 1 mL termasuk
substrat (0,5 mg, dilarutkan dalam aseton atau MeOH, 350 μL) dengan atau tanpa
LAC (0,25 mg, dilarutkan dalam buffer PBS, pH = 4,0, 650 μL) atau buffer PBS
( pH = 4,0, 650 μL). Setelah 1 jam inkubasi pada 40 ° C, dan kemudian dianalisis
dengan HPLC-DAD.
Biotransformasi skala preparatif dilakukan pada kondisi yang disebutkan di
atas, dan 200 mg substrat digunakan. campuran reaksi diisolasi oleh HPLC

2
preparatif untuk menghasilkan com-pound 6a (Rt = 16 menit, 18% CH3CN-H2O)
ditransformasikan dari 6, com-pound 7a (Rt = 50 mnt, 15% CH3CN-H2O) diubah
dari 7 , dan senyawa 16a (Rt = 13 menit, 15% CH3CN-H2O) ditransformasikan
dari 16, masing-masing.

1.4.2.1 8-Hydroxy-4-methyl-8- (2-oxopropyl) -2H-chromene-

2,7 (8H) -dione (6a)
Bubuk amorf kuning; [α] 20D 11.0 (c, 0,1); UV (CH3OH)
λmax 303,2 nm; 11H (DMSO d6, 500 MHz) dan 13C
NMR (DMSO d6, 125 MHz), lihat Tabel 3; HRESIMS
m / z 271.0576 (dihitung untuk C13H12NaO5, 271.0582).
1.4.2.2 8-Hydroxy-8-(2-oxopropyl)-4-phenyl-2H-chromene-
2,7(8H)-dione (7a)
Bubuk amorf kuning; [α] 20D 11.0 (c, 0,1); UV (CH3OH)
λmax 297.1 nm; 1H (DMSO d6, 500 MHz) dan 13C

3
 NMR (DMSO d6, 125 MHz), lihat Tabel 3; HRESIMS
m / z 333.0733 (dihitung untuk C18H14NaO5, 333.0739).
1.4.2.3 8-Hydroxy-8-(2-oxopropyl)-2H-chromene-2,7(8H)-
dione (16a)
Yellow amorphous powder; [α]20D 15.6 (c, 0.1); UV
(CH3OH) λmax 303.5 nm; 1H (DMSO d6, 500 MHz) and
13
C NMR (DMSO d6, 125 MHz), lihat Tabel 3;
HRESIMS m / z 257.0428 (dihitung untuk C12H10NaO5,
257.0426).

4
 1.4.3 MOLECULAR DOCKING
Struktur kristal LAC didapatkan dari Bank Data Protein (PDB ID: 1KYA).
Struktur 3D ligan dibuat sketsa berdasarkan jenis atom dan kiralitas yang benar
oleh perangkat lunak Sybyl (Tripos Inc., St. Louis, MO, USA). Setiap molekul
mengalami minimalisasi energi dengan parameter medan gaya Tripos standar.
Tuduhan Gasteiger-Hückel dihitung sebelum melakukan docking. Konformasi
ikatan bioaktif dari kumarin 6, 7, dan 16 dalam LAC diselidiki menggunakan
Surflex-Dock [22-24

5
 BAB II
PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

2.1 PERCOBAAN PENYARINGAN

Enam belas kumarin dengan substituen yang berbeda, seperti hidroksil,
gugus metoksi, fenil, dan karbonil (Tabel 1), digunakan untuk menyaring substrat
LAC sebagai katalis dalam percobaan. Setiap substrat (0,5 mg) dan LAC (0,25
mg) ditambahkan ke buffer (1 mL) untuk inkubasi pada 25 ° C, dan kemudian
dianalisis oleh HPLC-DAD setelah diekstraksi dengan CH2Cl2. Menurut hasil
HPLC, beberapa kumarin (1, 6, 7, dan 16) bisa dikatalisis oleh LAC (Tabel 1).
Coumarin 6, 7, dan 16 bisa selektif dikatalisasi oleh LAC, yang mengarah ke
produksi produk utama, kumarin 1 menghasilkan banyak produk tanpa
selektivitas, sedangkan produk apa pun tidak terdeteksi dalam campuran reaksi
kumarin 2–5 dan 8–15.
Kopling oksidatif yang dikatalisis oleh LAC adalah reaksi radikal bebas
menurut literatur sebelumnya [2,7], oleh karena itu, gugus fenolik hidroksil
memainkan peran utama dalam reaksi kumarin dengan LAC. Kumarin tanpa
gugus hidroksil tidak dapat dikatalisis oleh LAC, yang didukung oleh hasil
skrining kami. Untuk menyelidiki potensi interaksi kumarin 6, 7, dan 16 dengan
LAC, docking molekuler digunakan untuk menganalisis mode interaksi. Seperti
yang ditunjukkan pada Gambar. 1 dan Tabel 2, kumarin 6, 7, dan 16 bisa masuk
ke dalam domain pengikat ligan LAC. Lebih lanjut, coumarin 6, dan 16 dapat
membentuk dua ikatan hidrogen antara Asp206 dan dua gugus fenolik hidroksil
OH-7 dan OH-8 untuk masing-masing 6 dan 16, sedangkan dua ikatan hidrogen 7
dengan LAC masing-masing berada di antara OH-7 dan Asp206 dan OH-8 dan
His458.
7
2.2 PREPARASI DAN PERCOBAAN
Menurut hasil penyaringan, biotransformasi preparatif kumarin 6, 7, dan 16
dilakukan. Secara singkat, 200 mg substrat 6, 7, dan 16 diinkubasi dengan LAC,
dan produk diisolasi dengan HPLC preparatif, yang mengarah ke isolasi produk
yang diubah 6a, 7a, dan 16a (Skema 1). Analisis data spektroskopi, termasuk
HRESIMS, 1H NMR (Tabel 3), 13C NMR (Tabel 3), HSQC, dan HMBC,
menentukan struktur produk ini menjadi tiga turunan kumarin dengan aseton 6a,
7a, dan 16a.

8
 Gambar. 2. (A) HPLC plot reaksi untuk kumarin 6 (dilarutkan dalam aseton) dan
buffer. (B) HPLC plot reaksi untuk kumarin 6 (dilarutkan dalam aseton), buffer dan
LAC. (C) HPLC plot reaksi untuk kumarin 6 (terlarut inMeOH), buffer, dan LAC. (D)
HPLC plot reaksi untuk kumarin 7 (dilarutkan dalam aseton) dan buffer. (E) HPLC plot
reaksi untuk kumarin 7 (dilarutkan dalam aseton), buffer dan LAC. (F) HPLC plot
reaksi untuk kumarin 7 (dilarutkan dalam MeOH), buffer, dan LAC. (G) HPLC plot
reaksi untuk kumarin 16 (dilarutkan dalam aseton) dan buffer. (H) HPLC plot reaksi
untuk kumarin 16 (dilarutkan dalam aseton), buffer dan LAC. (I) HPLC plot reaksi
untuk kumarin 16 (dilarutkan dalam MeOH), buffer, dan LAC.

9
2.3 IDENTIFIKASI STRUKTUR
Senyawa 6a diisolasi sebagai bubuk amorf kuning, dan memiliki rumus
molekul C13H12O5 oleh HRESIMS-nya (m / z 271.0576, calcd. Untuk
C13H12NaO5, 271.0582) dan data 13C NMR. The 1HNMRdata (Tabel 3) dari 6a
menampilkan sinyal dari tiga puncak olefinik khas pada δH 7,54 (d, J = 10,5 Hz),
6,07 (d, J = 10,5Hz), dan 6,24 (br), dan sinyal dari dua kelompok metil di δH 2,30
(s) dan 2,06 (s). Data 13C NMR dari 6a menunjukkan tiga belas resonansi karbon,
termasuk dua karbon karbonil pada 206C 206,3 dan 196,3, satu karbon karbonil
ester pada δC 159,3, enam karbon olefinik pada δC 163,8, 154,6, 137,3, 121,2,
111,8, dan satu beroksigen karbon pada δC 70.3. Perbandingan data 1H dan 13C
NMR dari 6a dan substratnya 6 menunjukkan bahwa perbedaan mereka ada pada
cincin aromatik, dan 6a memiliki tiga karbon tambahan dari 6. Dalam spektrum
HMBC 6a, korelasi H-5 dengan C-7 / C -9, H-6 dengan C-8 / C-10, dan H-1a ′ /
H-1b ′ dengan C-7 / C-8 / C-9 / C-2 ′ / C-3 ′ mengkonfirmasi hal di atas

10
 Pengurangan-disebutkan. Oleh karena itu, struktur 6a ditugaskan sebagai 8-
hidroksi-4-metil-8- (2-oksopropil) -2H-chromene-2,7 (8H) -dione. Rumus
molekul senyawa 7awas ditugaskan sebagai C18H14O5 berdasarkan HRESIMS
(m / z 333.0733, kalkulasi untuk C18H14NaO5, 333.0739) dan data 13C NMR.
Data NMR dari 7a mirip dengan 6a dengan pengecualian bahwa nilai pergeseran
kimia C-4 diturunkan dari 154C 154.6 di 6a ke δC 155.6 di 7a, sinyal enam
karbon aromatik (134C 134.2, 129.8, 129.1 × 2, dan 128,2 × 2) hadir dalam 7a,
dan sinyaldari metil [δH 2,30 (s) untuk 6a; δC 18.6 untuk 6a] tidak ada di7a. Itu
Spektrum HMBC dari 7a menampilkan korelasi H-3 dengan C-1 ″, H-2 ″
dengan C-4 / C-4 ″ / C-6 ″, dan H-3 ″ dengan C-1 ″ / C-5 ″, membutuhkan
keberadaan cincin aromatik yang terhubung pada C-4. Dengan demikian, struktur
7a didefinisikan sebagai 8-hydroxy-8- (2-oxopropyl) -4-phenyl-2H-chromene-2,7
(8H) -dione.
Analisis data HRESIMS mengungkapkan bahwa formula molekul
16aditugaskan sebagai C12H10O5. Data 1D NMR dari 16a identik dengan orang-
orang dari 6a kecuali untuk tidak adanya sinyal dari metil [δH 2,30 (s) untuk 6a;
δC 18.6 untuk 6a] di 16a dan lapangan C-4 dari δC 154.6 di 6a hingga δC 144.7 di
16a. Dalam spektrum HMBC 16a, puncak-lintas H-4 dengan C-2 / C-5 dan H-5
dengan C-4 menunjukkan bahwa gugus metil ditempatkan oleh proton dalam 16a.
Oleh karena itu, struktur 16a ditentukan sebagai 8-hidroksi-8- (2-oksopropil) -2H-
kromena-2,7 (8H)-dione.

2.4 POTENSI MEKANISME

Kopling oksidatif yang dikatalisis oleh LAC adalah reaksi radikal bebas
berdasarkan literatur sebelumnya [2,7], oleh karena itu, gugus fenolik hidroksil
memainkan peran utama dalam reaksi kumarin dengan LAC. Itu mekanisme
potensial kumarin dengan LAC ditunjukkan dalam Skema 1. Untuk
mengkonfirmasi mekanisme reaksi kumarin 6, 7, dan 16 dengan LAC, reaksi
kumarin 6, 7, dan 16 (dilarutkan dalam aseton atau MeOH) dan buffer dengan
atau tanpa LAC dilakukan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2A – C,
kumarin 6 tidak bisa bereaksi dengan buffer karena tidak adanya suara baru dalam
plot HPLC (Gambar 2A), sedangkan produk baru 6a diamati dalam plot HPLC

11
 kumarin 6 dengan LAC (Gambar 2B), yang menunjukkan reaksi kumarin 6 dan
aseton dikatalisis oleh LAC. Untuk mengkonfirmasi apakah reaksi yang terlibat
dalam aseton, kumarin 6 dilarutkan dalam MeOH, dan kemudian bereaksi dengan
LAC. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2C, tidak ada produk baru yang hadir
dalam plot HPLC dari kumarin 6 (dilarutkan dalam MeOH) dengan LAC,
menunjukkan bahwa aseton berpartisipasi dalam reaksi kumarin 6 dikatalisis oleh
LAC. Hasil yang sama diamati dalam reaksi kumarin 7 dan 17 dengan LAC
(Gambar 2D-I). Temuan ini menunjukkan bahwa aseton berpartisipasi dalam
reaksi kumarin 6, 7, dan 16 dikatalisis oleh LAC.

2.5 ANALISIS KINETIK PEMBENTUKAN PRODUK 6A, 7A, DAN 16A

Untuk menyelidiki karakteristik transformasi LAC menuju substrat kumarin
berbeda 6, 7, dan 16, analisis kinetik dilakukan, dan parameter kinetik tercantum
pada Tabel 4. Kumarin 6 mengikuti kinetika Hill yang menampilkan profil kinetik
sigmoidal untuk pembentukan 6a pada kisaran konsentrasi substrat dalam kinetik
menganalisis (Gbr. 3) berdasarkan plot Eadie-Hofstee (Gbr. 3) [25,26], yang
menunjukkan bahwa langkah aktivasi substrat dalam oksidasi kumarin selama
proses reaksi yang dikatalisis LAC, sedangkan kumarin 7 dan 16 ditugaskan
sebagai kinetika inhibisi substrat dengan nilai Ki 1,79 ± 0,56 μM dan 0,42 ± 0,19
μM menurut plot Eadie-Hofstee (Gbr. 3) [20,27-31]. Seperti yang ditunjukkan
pada Tabel 4, nilai Km dari kumarin 6, 7, dan 16 berkisar antara 0,87 ± 0,07 μM
hingga 1,58 ± 0,49 μM, menunjukkan hal itu coumarin 6 menampilkan afinitas
paling tinggi dengan LAC.

12
 BAB III
KESIMPULAN

3.1 KESIMPULAN
Singkatnya, enam belas kumarin 1–16 digunakan untuk mempelajari
kemampuan katalitik LAC, yang mengarah ke produksi tiga kumarin turunan
kopling dengan aseton 6a, 7a, dan 16a biotransformasi dari coumarins 6, 7, dan
16. Analisis kinetik dari reaksi katalitik untuk coumarins 6, 7, dan 16 dengan LAC
dilakukan, menunjukkan bahwa nilai Km dari kumarin 6, 7, dan 16 berkisar dari
Masing-masing 0,87 ± 0,07 μM hingga 1,58 ± 0,49 μM. Temuan ini disarankan
bahwa LAC adalah metode yang dapat diandalkan untuk mengkatalisasi oksidatif
kopling.

13
 DAFTAR PUSTAKA

dkk., J. W. (2015). Lignin Engineering through Laccase Modification : A Promising

Field for Energy Plant Improvement, Biotechnology . Biotechnology for
Biofuels.
dkk., R. R. (2013). Laccase versus Laccase-Like Multi-Cooper Oxidase : A
Comparative Study of Simillar Enzymes with Diverse Substrat Spectra . Public
Library of Science.
dkk., Y.-F. W. (2019). Oxidative Coupling of Coumarins Catalyzed by Laccase.
International Journal of Biological Macromolecule, 6.

14