Makalah
Makalah
Oleh :
Yuliana daima ( 17650095 )
Ayutya Helgayanti ( 17650110)
Nina nur jannah ( 19650332 )
Puji dan syukur kita panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
keberkahanNya, lah akhirnya kita mampu menyelesaikan tugas makalah ini sesuai dengan
waktu yang telah ditentukan. Puji syukur juga kami panjatkan karena sesuai dengan jadwal
SPEKTROFOTOMETRI MASSA”.
Saya telah berusaha maksimal sesuai dengan kemampuan saya untuk menyusun makalah
ini sehingga dapat terselesaikan dengan baik. Sumber dari makalah ini adalah literatur-literatur
Kami menyadari sepenuhnya bahwa masih banyak kekurangan baik dari segi isi maupun tata-
cara kami menyampaikanya. Oleh karena itu dengan tangan terbuka kami menerima segala saran
dan kritik dari pembaca agar kami dapat memperbaiki tugas macam – macam alat kesehatan dan
penggolongannya ini.
Penyusun
DAFTAR ISI
BAB I
PENDAHULUAN
Bisphenol (BPs) memiliki aktivitas estrogenik dan telah dikaitkan untuk obesitas,
penyakit kardiovaskular dan diabetes mellitus. Bisphenol A (BPA) adalah bahan kimia industri
di mana-mana ditemukan dalam varietas wadah plastik untuk penyimpanan makanan dan di
lapisan resin epoksi kaleng makanan dan minuman dari logam. Beberapa penelitian telah
dilakukan yang juga digunakan dalam pembuatan resin epoksi , bisphenol Z (BPZ), digunakan
dalam menyembuhkan bahan plastik yang sangat tahan panas atau untuk isolasi listrik, dan 2,2
-biphenol (BP), yang mengurangi keberadaan karet dan terjadinya oksidasi plastic.
Selain itu, asosiasi antara konsentrasi BPA urin dan status kesehatan orang dewasa telah
diselidiki, sebagian besar penelitian menunjukkan bahwa paparan BPA yang lebih tinggi,
sebagaimana tercermin dalam kemih yang lebih tinggi konsentrasi, dapat dikaitkan dengan
morbiditas yang dapat dihindari di populasi dewasa yang tinggal di komunitas . Kebijakan saat
ini dan pandangan badan pengatur nasional dan internasional mengenai keamanan BPA
diringkas . Lingkungan Amerika Badan Perlindungan menetapkan bahwa BPA muncul dalam
darah dan urin dari 95% orang yang diuji. Baru-baru ini, para peneliti telah menemukan
kemungkinan hubungan antara BPA dan resistensi insulin . Meskipun BPA sering diukur dalam
sampel urin dari populasi umum, data terbatas pada bentuk bebas (bioaktif) dari fenol ini. Pada
manusia, konjugasi molekul BPA dengan glukuronida atau sulfat dianggap sebagai mekanisme
detoksifikasi karena metabolit ini lebih larut dalam air, dan sedang diekskresikan dalam urin.
Bentuk glucuronide dari BPA umumnya ditemukan sebagai bentuk yang dominan, sedangkan
kromatografi cair (LC), ditambah dengan spektrometri massa (MS), telah diusulkan untuk
analisis jejak BPA dalam matriks yang berbeda, seperti sampel urin . Rendah batas deteksi dan
resolusi tinggi dapat dicapai dengan GC-MS, meskipun langkah derivatisasi didasarkan pada
sililasi atau asetilasi umumnya direkomendasikan untuk meningkatkan volatilitas senyawa dan
sensitivitas metode. Prosedur normal untuk menentukan kadar BPA urin membosankan sebagai
sampel diserahkan ke beberapa langkah ekstraksi cair-cair (LLE) dengan pelarut organik,
penguapan pelarut, dan kemudian fase padat ekstraksi (SPE). Prosedur ini memakan waktu,
memerlukan sejumlah besar reagen dan menghasilkan banyak residu. Sebagai alternatif, metode
persiapan sampel miniatur menawarkan prosedur analitik yang ramah lingkungan dengan
peningkatan analisis mempercepat dan menurunkan jumlah pelarut organik. Mikro ekstraksi cair
cair cair (DLLME) dispersi melibatkan komponen terner sistem pelarut yang dibentuk oleh
larutan berair yang mengandung analit, pelarut ekstraksi yang tidak dapat larut dalam air dan
larut dalam air pelarut disperser. Injeksi cepat campuran pelarut organik ke dalam air
menyebabkan pelarut yang tidak larut dalam air terdispersi dalam massa air sebagai tetes mikro
Jumlah referensi yang terkait dengan teknik miniatur diterapkan untuk penentuan BPs
rendah, meskipun fase padat microextraction (SPME) telah digunakan untuk analisis dari
untuk analisis minuman, kertas printer termal, mainan dan peralatan bayi, satu-drop
microextraction (SDME) untuk sampel air sungai, berbasis cairan ionik teknik dalam sampel air
dan ekstraksi batang pengaduk aduk (SBSE) untuk penentuan BPs di perairan tanah, bodyfluids ,
migrasi dari botol bayi, minuman kaleng dan produk perawatan pribadi DLLME telah diterapkan
untuk analisis air, urin, minuman dan bayi formula dan studi migrasi.
Dalam penelitian ini, data konsentrasi BPA bebas dan terkonjugasi dari urin ditentukan
untuk yang pertama. waktu dalam kontrol dan manusia diabetes menggunakan DLLME sebagai
teknik persiapan sampel hijau dan GC-MS. BPF dan BP juga bisa ditentukan, berdasarkan pada
hubungan kimianya dengan BPA dan kemungkinan mereka muncul dalam sampel urin. BPZ
digunakan sebagai pengganti standar setelah mengkonfirmasikan bahwa sampel urin bebas dari
senyawa ini. Hasilnya divalidasi oleh pemulihan mempelajari dan menggunakan bahan referensi
1.3 Tujuan
duametode analisis senyawa yaitu kromatografi gas (GC) untuk menganalisis jumlahsenyawa
secara kuantitatif dan spektrometri massa (MS) untuk menganalisis struktur molekul senyawa
analit.
kromatografi gas dan spectrometer massa untu mengidentifikasi senyawa yang berada dalam
analisis sampel. Kromatografi gas dan spektrpmeter massa memiliki keunikan masing-masing,
dimana keduanya memiliki kelebihan dan kekurangan. Dengan menggabungkan kedua teknik
tekniknya. Untuk kedua teknik tersebut sampel yang dibutuhkan dalam benuk fase uap, dan
keduany juga sama-sama membutuhkan jumlah sampel yang sedikit (umumnya kurang dari
1mg). Disisi lain, kedua teknik tersebut memiliki perbedaan yang cukup besar yaitu pada kondisi
operasinya. . Senyawa yang terdapat pada kromatografi gas adalah senyawa yang digunakan
sebagai gas pembawa dalam alat GS dengan tekanan kurang lebih 760 torr, sedangkan
spketometer massa beroperasi pada kondisi vakum dengan kondisi tekanan 10-6 – 10-5 torr.
Gas kromatografi merupakan salah satu teknik spektroskopi yang menggunakan prinsip
terdapat pada campuran gas da juga menentukan konsentrasi suatu senyawa dalam fase gas.
mencari perbandingan massa terhadap muatan dari ion yang muatannya diketahui dengan
mengukur jari-jari orbital yang melingkarnya dalam medan magnetic yang seragam.
keduanya dapat menghasilakn data yang lebih akurat dalam pengidentifikasiansenyawa yang
Kromatografi gas ini juga mirip dengan distilasi fraksional, karena kedua proses
memisahkan komponen dari campuran terutama berdasarkan pada perbedaan titik didih (atau
tekanan uap). Namun distilasi fraksional biasanya digunakan untuk memisahkan komponen-
komponen dari campuran pada skala besar sedangkan GC dapat digunakan pada skala lebih kecil
Kromatografi Gas Gas pembawa (carrier gas) berfungsi sebagai fase gerak. Gas pembawa
adalah gas inert yang memiliki kemurnian tinggi (direkomendasikan grade Ultra High
Purity atau UHP). Gas pembawa ini yang akan membawa uap sampel masuk ke dalam
masuk ke detektor untuk dideteksi secara individual. Gas pembawa yang biasa digunakan
adalah Helium, Nitrogen atau Hidrogen (silakan mengacu ke kurva Van Deemter). Untuk
analisis sampel gas, maka gas pembawa yang digunakan harus berbeda dengan gas target
analisis. Gas pembawa biasanya disimpan dalam tabung gas bertekanan tinggi atau dari
gas generator.
2. Injeksi sampel
mencampur uap sampel dengan gas pembawa. Dalam kromatografi gas, semua sampel
dari fase asal harus diubah menjadi fase gas/uap. Misalnya sampel padatan dapat
Untuk sampel larutan bisa langsung diinjeksikan menggunakan micro syringe biasa,
sementara untuk sampel gas bisa menggunakan jarum suntik gas. Untuk otomatisasi, bisa
juga menggunakan auto injector/auto sampler. Injektor dilengkapi dengan blok pemanas
(heater block) yang memungkinkan pengaturan suhu injektor untuk menguapkan sampel.
Biasanya yang menjadi patokan awal adalah kira-kira 50°C di atas titik didih tertinggi
dalam campuran, dengan asumsi semua zat target akan menguap tapi tidak sampai
(untuk sampel seperti ban, kayu, dll), Headspace (untuk sampel film atau kemasan
plastik, cat, dll) atau Programmable Temperature Vaporizer / penguap suhu yang dapat
diprogram (untuk sampel biodiesel yang memiliki range titik didih lebar).
3. Kolom
Kolom berfungsi sebagai fase diam dan merupakan jantung dari kromatografi. Dalam
perbedaan afinitas masing-masing komponen terhadap fase diam dan fase gerak. Masing-
masing komponen akan mengalami 3 kondisi yaitu: ikut dengan gas pembawa,
terdistribusi secara dinamis di antara gas pembawa dan kolom, serta tertahan/larut dalam
kolom. Mekanisme ini terjadi berulang-ulang mulai dari sampel masuk ke dalam kolom
hingga masuk ke detektor secara individual. Proses pemisahan dalam kolom dipengaruhi
oleh banyak faktor seperti sifat kimia-fisika dari sampel maupun material kolom,dimensi
kolom (panjang,diameter dan tebal lapisan kolom, kapiler/kemas), laju alir gas pembawa,
suhu oven kolom, dll. Secara umum, semakin mirip polaritas komponen sampel dengan
fase diam,maka semakin kuat interaksi antara keduanya sehingga komponen akan
tertahan lebih lama dalam kolom (waktu retensi makin lama). Semakin panjang kolom,
semakin panjang jarak lintasan yang harus dilalui oleh komponen sampel sehingga waktu
retensi makin lama. Laju aliran gas pembawa mempengaruhi kecepatan migrasi
komponen sampel dalam kolom (semakin cepat laju alir akan mengakibatkan waktu
retensi makin cepat pula). Begitu pula dengan variabel suhu oven kolom,makin tinggi
suhu oven kolom,makin lemah interaksi antara komponen sampel dengan fase
a. Sumber Ion
Setelah melewati rangkaian gas kromatografi, sampel gas yang akan diuji dilanjutkan
melalui rangkaian spekstroskopi massa. Molekul-molekul yang melewati sumber ion ini
diserang oleh elektron, dan dipecah menjadi ionion positifnya. Tahap ini sangatlah
Selama ion melui rangkaian spekstroskopi massa, ion-ion ini melalui rangkaian
memisahkan komponen-komponen massa untuk kemudian dipilih yang mana yang boleh
melanjutkan yang mana yang tidak (prinsip penyaringan). Filter ini terus menyaring ion-
ion yang berasal dari sumber ion untuk kemudian diteruskan ke detektor.
c. Detektor
Kromatografi Gas Detektor pada kromatografi gas berfungsi untuk memberikan respon
detektor dan akan dideteksi responnya sesuai prinsip masing-masing detektor, arusnya
diperkuat, kemudian dikonversi menjadi satuan tegangan listrik (uV atau mV). Masuknya
plotingnya akan membentuk kurva distribusi Gauss seperti yang bisa kita lihat sebagai
dengan mekanisme detektor lain. Ada beberapa jenis detektor dalam khromatografi gas,
a. Flame Ionization Detector (FID), adalah detektor general untuk mengukur komponen-
FID, kemudian akan dibakar dalam nyala (campuran gas H2 dan udara), komponen
akan terionisasi, ion-ion yang dihasilkan akan dikumpulkan oleh ion collector, arus
yang dihasilkan akan diperkuat, kemudian akan dikonversi menjadi satuan tegangan.
Semakin tinggi konsentrasi komponen, makin banyak pula ion yang dihasilkan
b. Thermal Conductivity Detector (TCD) adalah detektor paling general sebab hampir
semua komponen memiliki daya hantar panas. TCD bekerja dengan prinsip mengukur
“Jembatan Wheatstone” di mana ada dua sel yaitu sel referensi dan sel sampel. Sel
referensi hanya dilalui oleh gas pembawa, sementara sel sampel dilalui oleh gas
pembawa dan komponen sampel. Perbedaan suhu kedua sel akan mengakibatkan
perbedaan respon listrik antara keduanya dan ini akan dihitung sebagai respon
Nikel, dan jumlah elektron yang hilang dari proses itu dianggap linear dengan
senyawaan sulfur, posfor dan atau timah organik. Prinsipnya adalah pembakaran
filter tertentu (filter S, P atau Sn) kemudian akan dideteksi oleh Photomultiflier.
f. Mass Spectrometer (MS) adalah detektor khusus yang dapat digunakan baik untuk
sampel dipecah menjadi bentuk ion fragmennya (baik secara elektronik maupun
kimiawi) lalu ion fragmen tersebut dilewatkan ke Mass Analyzer untuk memisahkan
untuk mendeteksi jumlah ion yang dihasilkan.Spektrum fragmen yang dihasilkan oleh
organik untuk pemisahan dan analisis. GC dapat digunakan untuk menguji kemurnian
dari bahan tertentu, atau memisahkan berbagai komponen dari campuran. Dalam
Dalam kromatografi gas, fase yang bergerak (atau "mobile phase") adalah sebuah
operator gas, yang biasanya gas murni seperti helium atau yang tidak reactive seperti gas
polimer yang mendukung gas murni, di dalam bagian dari sistem pipa-pipa kaca atau
logam yang disebut kolom. Instrumen yang digunakan untuk melakukan kromatografi
Umumnya spektrum massa diperoleh dengan mengubah senyawa suatu sample menjadi
ion-ion yang bergerak cepat yang dipisahkan berdasarkan perbandingan massa terhadap
muatan.
Spektroskopi massa mampu menghasilkan berkas ion dari suatu zat uji, memilah ion
tersebut menjadi spektum yang sesuai dengan perbandingan massa terhadap muatan dan
merekam kelimpahan relatif tiap jenis ion yang ada. Umumnya hanya ion positif yang
dipelajari karena ion negative yang dihasilkan dari sumber tumbukan umumnya sedikit.
3. Kombinasi GCMS
Saat GC dikombinasikan dengan MS, akan didapatkan sebuah metode analisis yang
larutan tersebut. Selanjutnya, peneliti dapat menghitung analisa kuantitatif dari masing-
dua dimensi.
Pada metode analisis GCMS (Gas Cromatografy Mass Spektroscopy) adalah dengan
membaca spektra yang terdapat pada kedua metode yang digabung tersebut.
waktu retensi yang sudah diketahui dari literatur, bisa diketahui senyawa apa saja yang
instrumen spektroskopi massa. Hal ini dapat dilakukan karena salah satu kegunaan dari
kromatografi gas adalah untuk memisahkan senyawa-senyawa dari suatu sampel. Setelah
itu, didapat hasil dari spektra spektroskopi massa pada grafik yang berbeda.
GC tampil menonjol dalam pekerjaan laboratorium pada topik-topik yang sedang banyak
pemantauan kadar pestisida dan tanah, air tanah dan sampel-sampel semacamnya.
analit dalam suatu pelarut organik yang sesuai dengan pengkromatografian ekstrak
tersebut.
dalam sampel daging dengan cara yang sama, dan ekstrak spesimen urin juga sama
Aluminium besi dan tembaga dalam aliase telah ditetapkan dengan melarutkan
GLC sangat berperan penting dalam upaya memonitor dan mengendalikan distribusi
menjalankan suatu program yang ekstensif untuk memonitor kadar pestisida dalam
tanah di berbagai tempat di negeri itu, tujuannya ialah menegakkan suatu garis
pijakan yang menunjukkan dengan eksak situasi pada masa kini sehingga
kecenderungan dalam masa depan dapat ditafsirkan dengan bermakna program yang
serupa sedang dilakukan untuk hasil bumi, air, ikan, kehidupan bebas.
GLC dapat juga digunakan untuk identifikasi dan pengelompokan pemonitoran gas-
gas pernapasan selama anestesia, penelusuran senyawa organik dan organisme hidup
pada planet lain. Dan masih banyak lagi aplikasi dari GLC yang tidak dapat kami
1. Efisien, resolusi tinggi sehingga dapat digunakan untuk menganalisa partikel berukuran
3. Pemisahan fisik terjadi didalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan
4. Banyak sekali macam detektor yang dapat dipakai pada kromatografi gas (saat ini
dikenal 13 macam detektor) dan respons detektor adalah proporsional dengan jumlah tiap
contohnya GC/FT-IR/MS.
Seperti dalam udara, terdapat berbagai macam senyawa yang saling bercampur dan
2. Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar.
Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan pada tingkat gram mungkin
dilakukan, tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika ada
metode lain.
3. Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam
METODE PENELITIAN
3.1 Bahan
Asetonitril kualitas kromatografi, metanol dan kloroform diperoleh dari Sigma (St. Louis,
MO, USA). Itu air yang digunakan sebelumnya dimurnikan dalam sistem Milli-Q (Millipore,
Bedford, MA, USA). Sodium karbonat, natrium klorida, hidrogen kalium fosfat dan amonium
asetat adalah dibeli dari Panreac (Barcelona, Spanyol). Derivatisasi pereaksi adalah asetat
anhidrida (AA, Fluka, Buchs, Swiss,> 99% kemurnian). Bisphenol A (BPA, 2,2- (4,4-) yang
tersedia secara komersial dihidroxydiphenyl) propana, kemurnian 99%), bisphenol F (BPF, 2,2-
cyclohexane, kemurnian 99%) dan biphenol (BP, 2,2-biphenol, kemurnian 98%) disediakan oleh
Sigma. Persediaan larutan 1000 mg L-1 disiapkan dalam metanol dan disimpan dalam kegelapan
di −10 ◦C. Solusi campuran standar yang bekerja disiapkan setiap hari dengan mengencerkan
dengan air. Untuk hidrolisis enzimatik, enzim -glucuronidase dari Helix pomatia-Type H-1
digunakan. Enzim dilarutkan menggunakan amonium asetat buffer (pH 5). Sampel urin sintetis
adalah disiapkan seperti yang dilaporkan sebelumnya [38]. Level kreatinin, indikatif
pengenceran urin, dihitung menggunakan uji komersial sesuai Metode Jaffe oleh Roche / /
Bahan referensi bersertifikat yang terdiri dari "Kontaminan organik dalam perokok (beku)"
(Bahan referensi standar, SRM 3672) dipasok oleh National Institute of Standards dan Teknologi
(NIST, Gaithersburg, USA) memiliki total BPA bersertifikat isi 3,05 ± 0,16 g kg − 1.
3.2 Alat
dilengkapi dengan sumber ion inert. Gas pembawa helium dalam kolom dipertahankan pada
aliran konstan 1 mL min-1. Injeksi (2 L) dilakukan menggunakan pulsed splitless dengan nilai
tekanan 15,5 psi diterapkan selama 0,2 mnt. Kolom kapiler HP-5MS (5% difenil – 95%
Program suhu GC adalah: mulai suhu 90 ◦C selama 0,5 menit, naik menjadi 255 ◦C pada 30 ◦C
min – 1 dan tahan selama 3,5 menit, naik menjadi 290 ◦C pada 35 ◦C min − 1 dan tahan selama 3
menit, mengelusi analit dengan waktu retensi di antaranya 6.1 dan 12.8 mnt, masing-masing
untuk BP dan BPZ. Total waktu menjalankan adalah 13 mnt. Suhu sumber ion, garis transfer dan
quadrupole masing-masing adalah 230, 300 dan 150 ◦C. Spektrometer massa dioperasikan
menggunakan mode electron impact (EI) (70 eV). Tabel 1 merangkum kondisi eksperimental
GC-MS. Senyawa dikuantifikasi dalam mode pemantauan ion yang dipilih (SIM) untuk
meningkatkan batas deteksi menggunakan satu target dan dua ion kualifikasi. Tabel 2
menunjukkan waktu retensi dan ion dipilih untuk semua senyawa. Identifikasi dikonfirmasi oleh
waktu retensi target dan rasio kualifikasi terhadap target untuk setiap senyawa. Aplikasi Analisis
mendekati maksimum.
3.3 sampel urine
Sampel urin dari pasien diabetes non-diabetes dan tipe-2 digunakan untuk penelitian ini.
Sebanyak 40 sampel urin manusia yang dikumpulkan dalam kekosongan pagi pertama diperoleh
dari sukarelawan: 20 pasien non-diabetes (berusia 30-89 tahun, 10 wanita dan 10 pria) dan 20
pasien diabetes (usia 30-91 tahun, 10 wanita dan 10 pria). Sampel urin dikumpulkan dalam
tabung polypropylene 10 mL (BD Tabung Plastik Vacutainer, Becton, Dickinson and Company,
Franklin Lakes, NJ) dan kemudian disimpan di −20 ◦C sampai analisis. Semua sukarelawan
menandatangani dan memberi persetujuan untuk berpartisipasi dalam penelitian ini. Kreatinin
ditentukan dengan menggunakan uji komersial sesuai Metode Jaffe oleh Roche / Hitachi Cobas
sebagai standar pengganti) (50 ng mL − 1), 0,73 g hidrogen dipotassium fosfat dan 220 L asetat
anhidrida (AA) untuk derivatisasi in-situ, dan ditempatkan dalam gelas 15 mL botol kecil. Solusi
sampel diguncang keras selama beberapa detik. Setelah derivatisasi, DLLME dilakukan dengan
menyuntikkan a campuran yang mengandung 1 mL aseton sebagai pelarut pendispersi dan 100 L
kloroform sebagai pelarut ekstraktan, ke dalam sampel urin berair diajukan ke derivatisasi.
Campuran itu dikocok perlahan secara manual selama beberapa detik. Setelah sentrifugasi pada
600g selama 5 menit, pelarut ekstraksi diendapkan di bagian bawah tabung kerucut (volume
menggunakan kosong liner dengan 4 mm I.D. Fraksi ini mengandung BPA yang tersedia secara
bebas. Untuk menentukan BPA total, bebas dan terkonjugasi, langkah hidrolisis enzimatik
glucuronidase larutan enzim dilarutkan dalam buffer amonium asetat (pH 5).
Setelah diinkubasi pada suhu 37 ◦C semalam, larutan ini terdilusi menjadi 10 mL air yang
mengandung BPZ (50 ng mL − 1), 0,73 g hidrogen dipotassium fosfat dan 220 L AA. Akhirnya,
prosedur DLLME adalah dilakukan seperti yang dijelaskan di atas. Untuk studi pemulihan,
sampel diperkaya dengan menambahkan berbeda volume larutan standar yang mengandung
diperkaya dihomogenisasi selama 5 menit dan dibiarkan selama 1 jam pada suhu kamar, sebelum
melakukan analisis yang dijelaskan atas. Prosedur fortifikasi diterapkan pada tiga sampel urin
pasien diabetes dan non-diabetes. Tiga alikuot dari setiap sampel pada setiap tingkat konsentrasi
Pemisahan terbaik di waktu terendah dicapai dengan menggunakan HP-5MS (5% difenil – 95%
kolom kapiler dimethylpolysiloxane), dengan program suhu yang diringkas dalam Tabel 1, yang
memberikan pemisahan yang baik dalam 13,5 menit total waktu berjalan. Suhu tinggi di port
injeksi GC memastikan penguapan analit lengkap di inlet, menghindari retensi pada dinding liner
kaca, tetapi dapat menyebabkan degradasi termal dari beberapa senyawa. Ketika variabel ini
diuji pada 280, 300 dan 320 ◦C, sensitivitas maksimum dicapai untuk semua analit pada 320 ◦C,
yang dipilih .
Untuk meningkatkan efisiensi transfer sampel, pulsed splitless injeksi diuji. Dalam mode
injeksi ini, saluran masuk gas pembawa Tekanan meningkat tepat sebelum awal setiap lari, oleh
meningkatkan aliran gas ke dalam kolom, dan kembali ke nilai normal setelah waktu yang
ditentukan. Nilai tekanan 9,9, 12,7, 15,5, 17,8 dan 20,1 psi, diterapkan selama 0,5 menit, diuji.
Sensitivitas maksimum untuk sebagian besar BP diperoleh pada 15,5 psi). Kemudian, durasi
denyut nadi bervariasi pada 0,1, 0,2, 0,35 dan 0,5 menit, sinyal maksimum diperoleh selama 0,2
memungkinkan faktor pengayaan yang lebih tinggi. Reaksi asetilasi dilakukan dengan
menggunakan AA pada media dasar. Sampel pH dapat dimodifikasi dengan penambahan larutan
buffer atau dengan menambahkan garam penetral, yang bereaksi dengan asam asetat yang
dihasilkan. Penggunaan garam netralisasi menunjukkan hasil terbaik, dan garam fosfat dibasic
dan tribasic diuji untuk tujuan ini. Dibasic phosphate memberikan respons yang lebih tinggi
untuk kebanyakan BP. Volume pereaksi derivatisasi dan jumlah Garam penetral yang
(CCD), dikembangkan di kisaran 50-350 L AA dan 0,3-0,9 g K2HPO4 (yang sesuai dengan 0,75
dan 2,25 setara dengan basis). Tanggapan yang didapat (Gbr. 1) menunjukkan bahwa nilai
optimal untuk senyawa adalah 220 L AA dan 0,73 gK2HPO4 (1,9 setara dengan basis.
Pelarut ekstraktan yang optimal dipilih menggunakan yang diperkaya sampel urin sintetis (20 ng
mL − 1 BPs). Pelarut yang berbeda lebih padat dari air - karbon tetraklorida, kloroform, 1,2-
ultrasonik untuk USAEME atau 1 mL aseton sebagai pelarut disperser untuk teknik DLLME.
Ketika 1,2- dikloroetana dan diklorometana digunakan, tidak ada sedimen drop muncul.
pada Gambar. 2.
Gambar.3 Variabel yang dipilih untuk desain Taguchi
Volume ekstraktan, volume fase berair dan rasio urin / air adalah tiga variabel
eksperimental terkait erat yang mempengaruhi efisiensi ekstraksi mikro. Nilai optimalnya
dipelajari menggunakan metode Taguchi, menerapkan orthogonal desain array (OAD) untuk tiga
faktor (masing-masing faktor pada tiga tingkat), seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3. Suhu,
waktu ekstraksi dan pengadukan tidak dianggap sebagai variabel karena keseimbangannya cepat
tercapai. Kecepatan sentrifugasi ditetapkan pada 600g selama 5 menit. Itu tiga variabel yang
dipilih memiliki efek signifikan pada ekstraksi efisiensi, seperti yang ditunjukkan oleh analisis
statistik varians (ANOVA). Efisiensi ekstraksi maksimal untuk 100 L kloroform, tetapi menurun
untuk volume yang lebih tinggi karena efek pengenceran; oleh karena itu, volume 100 L dipilih.
Meningkatkan fase berair volume hingga 10 mL menyebabkan peningkatan area puncak, dan
volume ini Oleh karena itu dipilih. Sinyal maksimum diperoleh dengan menggunakan 1/1 rasio
urin / air.
Desain Taguchi serupa lainnya dilakukan untuk mengoptimalkan jumlah siklus, waktu
siklus dan amplitudo (tiga faktor, tiga tingkat), seperti juga ditunjukkan pada Tabel 3. Kecepatan
sentrifugasi diperbaiki pada 600g selama 5 menit. Tiga variabel yang dipilih memiliki efek
signifikan pada efisiensi ekstraksi, seperti yang ditunjukkan oleh ANOVA. Sensitivitas
maksimum diperoleh saat menerapkan siklus selama 20 detik, setiap siklus 0,8 detik, dan
Untuk DLLME, pelarut disperser harus dapat bercampur dengan keduanya ekstraktan dan
fase urin berair. Pelarut optimal adalah dipilih dengan menyuntikkan 1 mL masing-masing
secara cepat (metanol, aseton dan asetonitril) mengandung 100 L CHCl3 ke dalam 10 mL yang
diperkaya sampel urin sintetis (20 ng mL − 1 BPs). Efisiensi ekstraksi paling tinggi
menggunakan aseton, yang dipilih. Volume optimal pelarut disperser adalah 1 mL, karena tidak
Eksperimen ini kemudian dilakukan dengan menggunakan sampel urin nyata. Dalam hal
ini, hasil terbaik diperoleh saat menggunakan DLLME daripada USAEME, teknik yang
ultrasonografi. Akibatnya, DLLME terpilih sebagai yang optimal teknik ekstraksi mikro.
Metode ini divalidasi untuk batas linearitas, deteksi dan kuantifikasi, selektivitas,
pemulihan, akurasi dan ketahanan, sesuai dengan pedoman internasional . Grafik kalibrasi adalah
diperoleh menggunakan standar pengganti dan DLLME dikombinasikan dengan GC-MS, dengan
analisis regresi linear kuadrat-terkecil, menggunakan enam level dalam percobaan rangkap.
Ketika BPA-d16 diuji sebagai pengganti standar, itu terbukti sangat tidak stabil ketika
menggunakan pelarut yang diperlukan untuk DLLME, terurai menjadi BPA. BPZ juga diuji
memeriksa apakah semua sampel bebas dari senyawa ini. Muncul menjadi yang paling cocok
untuk tujuan ini karena itu menunjukkan lar kromatografi dan perilaku ekstraksi DLLME ke
seluruh BP yang diteliti. Sampel urin diencerkan 5 kali lipat efek matriks. Ketika BPZ, sebagai
yang diperoleh dengan penambahan standar pada urin sampel tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan pada tingkat kepercayaan 95%, seperti yang dikonfirmasi oleh tes ANOVA,
karena nilai "P" diperoleh lebih tinggi dari 0,05 untuk semua senyawa. Akibatnya,
kebutuhan untuk menggunakan metode penambahan standar yang membosankan untuk tujuan
kuantifikasi, sehingga metode kalibrasi yang paling sederhana dengan standar air berlaku. Selain
itu, penggunaan pengganti membatasi segala ketidakpastian terkait dengan ekstraksi DLLME
Ketika linieritas metode dinilai dalam Kisaran 0,5-40 ng mL − 1, nilai koefisien regresi
lebih tinggi dari 0,99 menunjukkan linearitas yang baik untuk rentang yang dipelajari. Itu batas
deteksi (LOD, untuk rasio signal-to-noise 3) dirangkum dalam Tabel 4 untuk matriks urin.
Pengulangan antar hari dan antar hari dan reproduktifitas, masing-masing, dari metode dihitung
dengan menggunakan standar deviasi relatif (RSD) dari serangkaian sepuluh analisis berturut-
turut dari sampel yang dibubuhi dengan semua senyawa di level 20 ng mL − 1. Faktor pengayaan
(EF) dihitung sebagai rasio antara konsentrasi analit dalam organik menetap fase setelah
ekstraksi dan konsentrasi awal dalam air larutan. Nilai EF juga termasuk dalam Tabel 4. Tabel 5
menunjukkan keunggulan utama dari metode yang diusulkan dibandingkan dengan yang lain
Sebuah kromatogram yang diperoleh DLLME dan GC-MS di bawah SIM mode untuk
sampel urin berduri pada level 10 ng mL − Kromatogram yang diperoleh untuk sampel yang
tidak terkontaminasi menunjukkan tidak adanya puncak yang mengganggu pada retensi. waktu
dan ion kualifikasi dan rasio kualifikasi terhadap target dari puncak dalam sampel, solusi standar
dan sampel yang diperkaya. Gambar. 3 juga menunjukkan spektrum massa, yang
mengkonfirmasi identitas.
Urin adalah sampel biologis yang cocok untuk campuran biomonitoring BPs. Seperti
ditunjukkan sebelumnya, konjugasi molekul BPA dengan glukuronida atau sulfat dianggap
sebagai mekanisme untuk detoksifikasi . Bentuk konjugasi BPA diperkirakan oleh perbedaan
antara konsentrasi BPA gratis (dianalisis tanpa dekonjugasi enzimatik urin) dan BPA total
glukuronidase dari Helix pomatia-Type H-1 dipilih karena itu memiliki aktivitas -glucuronidase
dan sulfatase. Itu dilarutkan menggunakan buffer amonium asetat (pH 5). Enzim berbeda
konsentrasi diuji dengan menambahkan volume dalam 0,5-2 mL kisaran 1500 U mL − 1 larutan
untuk 2 mL sampel urin. Karena sinyal tetap konstan di seluruh rentang yang dipelajari, 500 U
direkomendasikan sebelumnya. Berbeda Waktu hidrolisis juga diuji antara 1 dan 12 jam, dan
Sebuah studi efek matriks baru dilakukan termasuk langkah hidrolisis enzimatik, di
hadapan BPZ sebagai standar pengganti pada 50 ng mL − 1 level. Nilai kemiringan dari
mengkonfirmasikan bahwa tidak ada perbedaan signifikan pada kepercayaan 95% tingkat antara
kemiringan grafik kalibrasi standar berair dan yang diperoleh dengan penambahan standar pada
urin sampel dan sampel urin terhidrolisis. Oleh karena itu kalibrasi dengan standar berair
dianggap sesuai.
Profil elusi dan spektrum massa yang diperoleh untuk sampel urin yang diperkaya
pada 10 g L-1 bisphenol, menggunakan prosedur DLLME dan GC-MS dalam
mode SIM.
4.7 Analilis Sampel Urin
Untuk memeriksa akurasi, tes pemulihan dilakukan dengan memperkuat tiga sampel urin
pada dua level konsentrasi 5 dan 20 ng mL − 1, yang berhubungan dengan konsentrasi rendah
dan nilai menengah rentang linearitas. Pemulihan bervariasi dari 96 hingga 109% (n = 27) di
level terendah dan dari 92 hingga 117% (n = 27) untuk level tertinggi (Tabel 6). Nilai RSD untuk
Metode yang diusulkan diterapkan untuk penentuan PT kandungan BPs dari beberapa
sampel urin dari diabetes (D) dan pasien non-diabetes (NoD). Sampel diprioritaskan oleh
DLLME dan diserahkan untuk dianalisis. Profil elusi diperoleh menunjukkan tidak adanya
senyawa yang mengganggu eluting di waktu retensi BP yang berbeda. Perbandingan retensi kali
untuk senyawa dalam campuran standar dan yang diperkaya sampel dan, khususnya, spektrum
MS, memungkinkan identifikasi BP. Tabel 7 menunjukkan hasil yang diperoleh. Seperti yang
bisa dilihat, BPA adalah satu-satunya senyawa yang terdeteksi dalam sampel urin yang dianalisis
dan ada perbedaan substansial antara konten BPAdari sampel yang berbeda. Bisphenol lainnya,
seperti BPF, BPZ dan BP, tidak terdeteksi dalam sampel urin dalam bentuk bebas atau
terkonjugasi. Total konten BPA diukur dengan melakukan hidrolisis enzimatik sampel urin
menggunakan campuran enzim.. Seperti dapat dilihat, glukuronida BPA sering terjadi bentuk
dominan bahan kimia ini diukur, sedangkan yang bebas formulir terdeteksi ke tingkat yang lebih
rendah.
Nilai yang terkait dengan BPA gratis, BPA terkonjugasi, dan total BPA disesuaikan
dengan total konten kreatinin dalam urin. Tingkat konsentrasi dalam bentuk bebas (disesuaikan
kreatinin) berkisar dari batas deteksi hingga 15,9 ng g − 1, sementara kreatinin menyesuaikan
BPA total terdeteksi pada 0,46-24,5 ng g − 1 level. Nilai yang dilaporkan adalah dalam sesuai
Konten BPA gratis untuk pasien diabetes menunjukkan rata-rata nilai ± standar deviasi
2,7 ± 3,9 ng g − 1 (C. Saya rata-rata 1,8), sedangkan total BPA untuk pasien diabetes adalah 8,1
± 7,5 ng g-1 (C.I. rata-rata 3,5). Sebaliknya, untuk pasien non-diabetes, BPA gratis konten
adalah 1,5 ± 2,0 ng g − 1 (C dari rata-rata 0,96), sedangkan BPA total untuk pasien non-diabetes
adalah 5,8 ± 6,4 ng g-1 (C. I dari rata-rata 3.0). Sebuah perbandingan kandungan BPA untuk
kedua kelompok pasien terungkap bahwa nilai rata-rata yang sedikit lebih tinggi diperoleh untuk
BPA gratis dan total BPA untuk pasien diabetes (2,7 dan 8,1, masing-masing), daripada untuk
pasien non-diabetes (1,5 dan 5,8, masing-masing). Namun demikian, a perbandingan statistik
dari isi BPA untuk kedua non-diabetes dan pasien diabetes yang menggunakan uji Mann-
Whitney mengungkapkan hal itu tidak ada perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok
karena nilai Pv adalah 0,379, 0,617 dan 0,441, untuk kreatinin bebas, tingkat BPA terkonjugasi
dan total, masing-masing. Tidak adanya perbedaan yang signifikan ini diduga karena variabilitas
yang tinggi BPAcontent dalam sampel yang berbeda, yang menyebabkan standar tinggi nilai
penyimpan.
Metode ini divalidasi menggunakan bahan referensi bersertifikat yang terdiri dari
"kontaminan organik dalam perokok (beku)" (SRM 3672), dengan konten BPA bersertifikat dari
3,05 ± 0,16 g kg − 1, dilengkapi dengan hidrolisis enzimatik langkah dalam perawatan. SRM
dianalisis tanpa dan dengan langkah hidrolisis enzimatik. Ketika tidak ada hidrolisis yang
dilakukan, tidak BPA terdeteksi. Namun, dengan adanya hidrolisis enzimatik, kandungan BPA
yang ditemukan adalah 3,12 ± 0,22 ng mL − 1 (n = 3). Sebuah perbandingan keduanya, hasil
yang diperoleh untuk urin SRM diajukan ke hidrolisis enzimatik dan nilai bersertifikat,
menggunakan one-sample t-test mengungkapkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan
5.1 Kesimpulan
Asosiasi konsentrasi urin BPA dan diabetes bisa diperiksa dengan metode sensitif
kromatografi dengan GC-MS. Eksposur ke BP lain juga bisa diperiksa untuk penilaian risiko.
Metode ini kuat dan andal, menggunakan teknik persiapan sampel hijau, dan memungkinkan
konsumsi rendah pelarut organik dan kuantifikasi yang tepat di konsentrasi rendah terhadap
standar air. Sebagian besar BPA di sampel urin terkonjugasi dalam bentuk glukuronidasi. Hasil
diperoleh menunjukkan bahwa, meskipun nilai rata-rata sedikit lebih tinggi diperoleh untuk BPA
gratis dan total untuk pasien diabetes daripada untuk pasien non-diabetes, tidak ada perbedaan
yang signifikan antara kadar BPA urin berhubungan dengan diabetes karena tingginyadispersi