Topik : membran biologis

A chorioallantoic membrane model for the determination of anti-angiogenic effects of imatinib

Abstrak

Tumor angiogenesis sangat penting dalam pertumbuhan dan metastasis tumor padat,
dan pengembangan strategi pengobatan anti-angiogenik merupakan pilihan yang relevan
dalam onkologi. Model membran chorioallantoic (CAM) adalah alternatif yang cepat dan
sederhana untuk studi in vivo untuk evaluasi senyawa antiangiogenik, sehingga
memungkinkan untuk mengurangi eksperimen pada hewan dan, dengan menetapkan prosedur
yang kuat dan dapat direproduksi, untuk menilai secara lebih efisien dan obyektif anti-
angiogenik kemanjuran obat yang diberikan.

Dalam tulisan ini, kami membandingkan dua metode yang berbeda untuk
pembentukan tumor pada model CAM: (i) suspensi sel Murine Urothelial Carcinoma (MB49)
dicampur dengan Matrigel dan (ii) suspensi sel MB49 yang diserap dalam spons gelatin
Gelfoam. Berdasarkan penerapan kedua metode untuk pembentukan implan, kami
mengidentifikasi spons gelatin Gelfoam lebih unggul karena perlekatan yang lebih baik dari
tumor pada permukaan membran. Untuk kuantisasi yang tepat dari pertumbuhan xenograft
tumor dan angiogenesis, kami juga menetapkan dalam makalah ini penangkapan elektronik
dari xenografts dan analisis berbasis komputer dari gambar CAM mikroskopis untuk
menentukan jumlah pembuluh yang berpotongan dan untuk mengukur diameter pembuluh.

Selain efek langsungnya pada sel-sel tumor dengan menghambat domain tirosin
kinase dari gen abl, imatinib telah dilaporkan mengurangi sekresi faktor angiogenesis VEGF
yang dimediasi oleh Bcr-Abl dan karenanya mengganggu angiogenesis. Untuk menguji
model CAM kami untuk kemampuannya memantau efek anti-angiogenik, implan tumor
berbasis gelelf Gatinoam diperlakukan dengan aplikasi topikal imatinib pada berbagai
konsentrasi. Selain efek anti-tumor, kami mengamati penghambatan angiogenesis
sebagaimana ditentukan oleh jumlah atau total diameter pembuluh yang berpotongan. Kami
juga menunjukkan bahwa perhitungan 'indeks pembuluh darah' (diameter total pembuluh /
lingkar tumor) dalam model kami memungkinkan untuk menilai efek anti-angiogenik
imatinib secara independen dari penghambatan pertumbuhan tumor. Kami menyimpulkan
bahwa pengujian CAM dan analisis berbasis komputer kami mewakili teknik in vitro yang
berguna untuk penilaian cepat efek anti-angiogenik dari berbagai agen.
 1. Introduction

Sudah dipastikan bahwa tumor padat bergantung pada pembentukan pembuluh darah baru
sebagai prasyarat penting untuk suplai mereka dengan oksigen dan nutrisi. Dalam kondisi
normal, angiogenesis, yaitu pembentukan pembuluh darah baru dari yang sudah ada, sangat
terbatas pada orang dewasa, hanya terjadi selama siklus ovarium, penyembuhan luka, dan
beberapa proses fisiologis (patho) lainnya yang melibatkan pertumbuhan atau perbaikan
jaringan [1] . Namun, sebagian besar tumor padat > 2-3 mm3 tidak dapat bertahan hidup
tanpa suplai pembuluh darah, sehingga membangun perlunya angiogenesis untuk
perkembangan tumor dan, pada tahap selanjutnya, untuk metastasis [2]. Akibatnya, anti-
angiogenesis dianggap sebagai strategi yang menjanjikan dalam terapi kanker. Angiogenesis
bergantung pada proliferasi dan migrasi sel endotel, yang terkait dengan ekspresi faktor
pertumbuhan oleh sel tumor. Beberapa faktor pertumbuhan telah terbukti terlibat dalam
angiogenesis tumor, termasuk faktor pertumbuhan fibroblast dasar (bFGF; FGF2), faktor
pertumbuhan epitel vaskular (VEGF), faktor pertumbuhan turunan trombosit (PDGF), faktor
pertumbuhan beta (TGFb), angiopoietin -1, integrin, dan molekul adhesi sel endotel platelet
(PECAM-1) [3]. Inhibitor dari salah satu molekul tersebut dapat memberikan efek anti-
angiogenik yang relevan dalam terapi tumor. Penilaian mereka, bagaimanapun,
membutuhkan analisis yang tepat dari efek ini dalam model eksperimental yang sesuai.

Model membran chorioallantoic (CAM) adalah alternatif cepat dan sederhana untuk studi
in vivo untuk evaluasi senyawa anti-angiogenik. Dengan demikian memungkinkan untuk
mengurangi percobaan pada hewan dan untuk lebih efisien dan obyektif menilai tindakan
terapi (di sini anti-angiogenik) dari obat yang diberikan. CAM adalah membran
ekstraembrionik dari telur ayam, terdiri dari jaringan kapiler yang sangat padat dan
memediasi pertukaran gas dan nutrisi ke embrio. Karena imunokompetensi ayam tidak
sepenuhnya berkembang selama tahap embrionik, xenografts dapat dibuat tanpa penolakan
[4], sebelum memantau pembuluh baru yang muncul dari inang dan tumbuh menuju tumor
[5]. Khususnya, tumor dapat mentransfer sinyal pertumbuhan pada jarak hingga 5 mm, dan
jika mikrovessel gagal menembus tumor sampai hari ketiga penanaman tumor, tumor tersebut
tetap pucat. Kapal mikro yang diinduksi tumor berukuran kecil dan memiliki waktu paruh
pendek, dan jika stimulus dimatikan, mereka mundur dengan cepat [6]. Oleh karena itu, efek
anti-angiogenik dari inhibitor dapat secara akurat ditentukan dalam uji CAM dengan
penghitungan pembuluh mikro. Namun, penerapan senyawa uji yang relevan secara
onkologis ke dalam model CAM mungkin juga secara paralel mengerahkan penghambatan
sel tumor, yang mengarah ke efek anti-tumor makroskopis dalam xenografts. Sementara ini
memungkinkan analisis efek sitostatik serta penilaian kemanjuran aplikasi fotodinamik atau
radioterapi. Pengujian CAM, mungkin mengaburkan kuantisasi yang tepat dari efek anti-
angiogenik, sehingga membutuhkan analisis data kepadatan kapal yang lebih canggih.

Imatinib (Glivec, STI 571) adalah analog fenilaminoprimidin yang berikatan dengan situs
pengikatan ATP pada domain tirosin kinase dalam gen abl (Abelson murine leukemia). Pada
penyakit seperti leukemia myelogenous kronis, kromosom Philadelphia mengarah ke protein
fusi abl dengan gen bcr (breakpoint cluster region) yang menyebabkan tyrosine kinase aktif
secara konstitutif, dan imatinib memberikan manfaat terapeutik yang mendalam dengan
menghambat aktivitas tyrosine kinase [7] . Khususnya, juga dilaporkan bahwa imatinib
mengurangi sekresi VEGF, yang dimediasi oleh kompleks Bcr-Abl, dan dengan demikian
dapat dikaitkan dengan anti-angiogenesis [8]. Dalam konteks ini, juga telah ditunjukkan
bahwa imatinib memberikan efek anti-angiogenik sehubungan dengan jalur pensinyalan
PDGF / PDGFR, ketika ekspresi berlebih dari PDGFR selama penyakit vasculoproliferative
diamati [9]. Ini mendorong kami untuk menguji pengujian CAM kami mengenai efek anti
angiogenesis imatinib.

Dalam tulisan ini, kami (i) mengidentifikasi metode optimal untuk implantasi sel tumor
ke CAM, (ii) menetapkan analisis angiogenesis berbasis komputer, (iii) menunjukkan bahwa
model ini memungkinkan kuantifikasi cepat efek anti-angiogenik yang cepat dan tepat.
independen dari sifat anti-tumor, dan (iv) menganalisis imatinib sehubungan dengan potensi
anti-angiogeniknya.

2. Bahan dan metode

2.1 Bahan
Implan tumor disiapkan menggunakan garis sel karsinoma urothelial murine MB49
(ATCC, Manassas, VA) dengan matrigel (BD Matrigel ™ Basalmembranmatrix, BD
Biosains, Bedford, MA) atau dengan spons gelatin (Gelfoam, Pfizer, Pharmacia & Upjohn,
Kalamazoo, MI). Imatinib dibeli dari LC Laboratories (Woburn, MA). Telur VALO-SPF
yang dibuahi diperoleh dari Lohmann Tierzucht (Cuxhaven, Jerman). Sel dibudidayakan pada
suhu 37 ° C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 dalam media Dulcecco
Modified Dulbecco Media (IMDM) (PAA, Coelbe, Germany), yang mengandung 10% fetal
calf serum (FCS) (PAA) dan 1: 100 (v / v) penisilin / streptomisin (PAA).
2.2 Metode
 2.2.1 preparasi CAM
Setelah melahirkan, telur bebas patogen spesifik yang telah dibuahi dibersihkan
dengan larutan antiseptik dan diinkubasi pada suhu 37 C dan kelembaban relatif 60%. Pada
hari ke 5, dua lubang dengan diameter masing-masing 3 mm dibor ke kedua kutub telur. Dari
salah satu lubang ini, 6-7 ml albumin dihilangkan, dan lubang ditutup dengan plester untuk
menghindari pengeluaran albumin lebih lanjut. Pada tiang lebar, jendela dengan diameter 2,5
cm dibuka dan disegel dengan Parafilm, dan sampai hari ke 18, telur diinkubasi pada suhu 37
C dan kelembaban relatif 60%.
2.2.2 persiapan implan tumor gelfoam
Pada hari ke 8-10, potongan Gelfoam 2 mm3 dipotong dalam kondisi steril dan
dibasahi dengan suspensi sel 10 ll MB49 (3 106 sel / ml dalam medium bebas serum).
Dengan demikian, setiap spons mengandung sekitar 30.000 sel dan ditempatkan pada CAM
pada posisi di mana kepadatan pembuluh darah tinggi.
2.2.3 Persiapan implan tumor Matrigel
Implan tumor Matrigel disiapkan 1 hari sebelum implantasi. Matrigel yang
disimpan pada 20 C dipanaskan hingga 4 C dan dihomogenisasi dengan pengocokan. 5 106
sel dalam medium sel 20 ll dicampur dengan larutan 10 ll matrigel dan diinkubasi semalaman
dalam piring 24-sumur. Hari berikutnya, campuran sel matrigel dikeluarkan dari sumur dan
ditempatkan pada CAM pada posisi di mana kepadatan pembuluh darah tinggi.
2.2.4 Pengobatan topikal dari implan tumor dan analisis kepadatan pembuluh darah
Mulai dari hari implantasi tumor, analisis harian implan tumor dilakukan
menggunakan stereomicroscope (Olympus SZX12, Tokyo, Jepang, perbesaran hingga 120)
yang terhubung ke kamera digital Moticam 2000 (Motic China Group, Hong Kong, Cina ).
Setiap gambar (1,3 MP; 1280 1024) ditangkap menggunakan perangkat lunak Motic Images
Plus 2.0 ML. Untuk pengobatan topikal implan tumor, 10 ll larutan imatinib dalam
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (PBS) (PAA, Coelbe, Jerman) diterapkan, dengan
konsentrasi imatinib seperti yang ditunjukkan pada gambar. Implan tumor kontrol negatif
diobati dengan PBS saja. Untuk seluruh durasi percobaan, telur diinkubasi pada suhu 37,5 C
dan kelembaban relatif 60%.
2.2.5 Statistika
Semua percobaan CAM dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasilnya dinyatakan
sebagai mean ± standard error of mean (s.e.m.). Signifikansi statistik ditentukan oleh posttest
perbandingan ganda One-way ANOVA / Tukey.
3. Hasil dan diskusi
 3.1 CAM Assay
Eksperimen dilakukan seperti yang diuraikan pada Gambar. 1. Pada hari ke 8-10,
tergantung pada perkembangan embrio, implan ditempatkan pada CAM, dan pembentukan
tumor dapat dengan mudah diamati 3-5 hari kemudian. Ketika membandingkan eksperimen
CAM berdasarkan implan Matrigel vs Gelfoam, kami mengamati bahwa implan tumor
dengan Gelfoam melekat pada permukaan CAM lebih efisien dan membentuk tumor yang
lebih berbeda (Gbr. 2). Lebih lanjut, protokol preparasi lebih mudah dan lebih pendek dalam
kasus Gelfoam, dan jumlah sel yang lebih kecil cukup untuk implantasi (30.000 vs 5.10 sel).
Karena jumlah aktual sel yang diperlukan, bagaimanapun, juga akan tergantung pada garis sel
dan akan dipengaruhi oleh efek biologis daripada teknis, tidak ada jumlah sel minimal untuk
implantasi tumor yang berhasil dinilai di sini. Reproduksibilitas pembentukan tumor sangat
tinggi. Dengan garis sel MB49, hampir semua implan tumor melekat pada permukaan CAM.
Namun, meskipun metode in ovo memberikan tingkat kelangsungan hidup embrio yang lebih
tinggi dibandingkan dengan ex ovo [10], hanya 31% dari embrio ayam mencapai hari ke-18
inkubasi. Pertumbuhan tumor tergantung pada jarak implan ke pembuluh darah dan dengan
demikian lokalisasi implan pada CAM. Juga harus dicatat bahwa pertumbuhan membran
korioallantoik berlanjut selama beberapa hari setelah implantasi. Tergantung pada keahlian
teknis dan lokalisasi implan, ini dapat menyebabkan luncuran implan lebih dekat ke
cangkang, sehingga mengganggu penilaian mikroskopis. Hanya beberapa (3-5) hari setelah
implantasi sel MB49, pembentukan tumor terdeteksi, dan kami mengamati perkembangan
pembuluh alantoik dalam 'pola roda spoked' menuju implan tumor (Gambar 3c2 dan c3).
Dengan demikian, sel MB49 dan Gelfoam terbukti menjadi garis sel dan pembawa yang
cocok, masing-masing, dalam hal pembentukan tumor dan induksi vasoproliferasi pada
CAM.
Metode-metode yang sudah ada untuk mengukur respons angiogenik ditinjau oleh
Ribatti [10] dan sejauh ini sebagian besar bergantung pada penilaian semi-kuantitatif dari
kepadatan vaskuler berdasarkan skoring dari vaskularisasi, mis. pada skala dari 0 hingga 4.
Sebaliknya, dalam penelitian ini, kami menangkap gambar secara elektronik dan melapiskan
garis yang mewakili batas tumor pada gambar CAM mikroskopis. Ini memungkinkan
penentuan jumlah kapal yang berpotongan dan pengukuran diameter kapal dengan alat
program elektronik. Penggunaan perbesaran stereomikroskop hingga 120 dan kamera
pembesaran / resolusi tinggi untuk merekam juga memungkinkan deteksi pembuluh darah
kecil. Seperti yang diharapkan dan dijelaskan di tempat lain [10], jumlah total kapal yang
bersilangan juga tergantung pada lingkar tumor, yang karenanya perlu dipertimbangkan
dalam pendekatan kuantitatif kami (index index indeks pembuluh darah ’; lihat di bawah).
Satu set data khas adalah sebagai berikut: Pada hari implantasi tumor, keliling implan adalah
8 mm, dengan awalnya 11 pembuluh yang berpotongan. Setelah 3-5 hari, kelilingnya
meningkat menjadi 10 mm dan 19 pembuluh yang berpotongan dihitung. Selama periode
pengobatan (lihat di bawah), peningkatan lebih lanjut dalam lingkar implan (11 mm) dan
jumlah pembuluh (37) diamati pada kelompok perlakuan kontrol negatif, sementara
pengobatan inhibitor (imatinib) membatalkan efek ini. Hasilnya dianalisis sebagai jumlah
pembuluh darah yang berpotongan (tidak ditampilkan) atau sebagai diameter total pembuluh
darah (yaitu, jumlah pembuluh darah yang berpotongan x diameternya, dengan hasil khas
pada pengobatan mulai antara 1255,27 dan 2633,17 lm), dan dinormalisasi. untuk memulai
pengobatan (hari 13; Gbr. 4, kanan). Selain itu, untuk membedah anti-angiogenik yang lebih
baik dari efek penghambatan tumor, yang dapat mengaburkan penilaian yang benar dari
jumlah pembuluh yang bersinggungan dan dengan demikian tingkat angiogenesis, lingkar
tumor diukur untuk setiap xenograft pada setiap titik waktu, dan dari situ '' Indeks pembuluh
darah '' (yaitu, rasio '' diameter total pembuluh darah / keliling tumor '') dihitung.
3.2 Penilaian anti-angiogenesis pada pengobatan imatinib
Untuk menguji sistem kami, kami menilai efek anti-angiogenik imatinib. Lebih
khusus lagi, mulai pada hari ke 13, kami secara topikal menerapkan larutan imatinib pada
berbagai konsentrasi pada implan tumor, dan, dibandingkan dengan perawatan kontrol (PBS),
menilai pertumbuhan tumor dan vakuularisasi seperti dijelaskan di atas. Batas-batas implan
tumor ditandai pada setiap gambar, diameter totalnya dihitung, dan pembuluh darah yang
melintasi batas tumor yang ditandai dihitung dan diukur. Sedikit peningkatan dalam diameter
total pembuluh darah diamati pada kelompok kontrol PBS selama periode pengobatan dan
pemantauan 4 hari (hari 13-17; Gambar. 3, kanan dan 4, kanan), sementara imatinib
memberikan penghambatan angiogenesis yang bergantung pada dosis. Lebih khusus, mulai
dari hari pertama perawatan imatinib, penurunan yang terlihat dalam vasoproliferasi diamati
(Gbr. 3, panel kiri). Kuantisasi mengungkapkan bahwa aplikasi 10 ll larutan imatinib pada 10
lM atau 33 lM menghasilkan 20% atau 30% penurunan angiogenesis, masing-masing,
sementara pada semua konsentrasi yang lebih tinggi, pengurangan maksimum> 50% dalam
diameter total pembuluh darah terdeteksi. (Gbr. 4, kanan, gambar B). Secara paralel, seperti
yang diharapkan, perawatan imatinib juga mengerahkan aktivitas anti-tumor, sebagaimana
ditentukan oleh penurunan pertumbuhan tumor.
Dengan demikian, untuk menganalisis efek anti-angiogenik secara independen dari
pertumbuhan tumor, indeks pembuluh darah dihitung seperti yang dijelaskan di atas dari
jumlah pembuluh darah yang berpotongan per xenograft tumor dan lingkar implan (Gbr. 4,
kiri). Sekali lagi, analisis angiogenesis tergantung waktu mengungkapkan perbedaan yang
nyata antara kelompok perlakuan. Sementara pada kelompok kontrol PBS, peningkatan 1,4
kali lipat dalam indeks pembuluh darah diamati, menunjukkan angiogenesis utuh, imatinib
menunjukkan efek penghambatan tergantung dosis. Dibandingkan dengan analisis diameter
total pembuluh darah, konsentrasi imatinib yang lebih tinggi diperlukan untuk menurunkan
indeks pembuluh darah, dan ketergantungan dosis terlihat hingga jumlah imatinib terbesar
yang digunakan.
Secara bersama-sama, model CAM adalah uji yang terdefinisi dengan baik yang
memberikan wawasan tentang respons fisiologis dan histologis sistem pembuluh darah.
Dalam makalah ini, kami menunjukkan penerapan uji CAM berbasis Gelfoam pada penilaian
efek anti-angiogenik dan menunjukkan efek anti-angiogenik dari imatinib. Dengan
meningkatkan konsentrasi imatinib, penurunan proporsional dalam jumlah pembuluh alantoik
diamati. Ketergantungan-dosis ini juga menunjukkan bahwa model CAM, berdasarkan pada
sel MB49 dalam matriks Gelfoam dalam kombinasi dengan pemindaian yang dibantu
komputer dan analisis pembuluh, memberikan metode yang cepat dan mudah untuk secara
kuantitatif mengevaluasi aktivitas antiangiogenik dari agen uji dan bahwa konsentrasi
imatinib 3,310 2 mM sudah cukup untuk penindasan angiogenik yang efisien.