Anda di halaman 1dari 18

IMMUNOASSAY

Diajukan guna melengkapi Tugas Ujian Mid Semester Mata Kuliah Instrumentasi
Dosen Pengampu : dr.Danis Pertiwi, M.Si Med, Sp.PK.

Disusun oleh:
Fathia Kesuma Dinanti
MBK.19.14.01.0151

PROGRAM STUDI
MAGISTER BIOMEDIK
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG
2019
I. Pengertian ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang


terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen
dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis,
patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah
antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah
oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan
panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan
berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya
fluoresensi.
Terdapat beberapa jenis teknik ELISA, yaitu (1) Indirect ELISA; (2) Direct ELISA; (3)
ELISA Sandwich; (4) ELISA Multiplex dan (5) ELISA Biotin Streptavidin. Dalam penggunaan
sehari-hari ELISA bisa digunakan unruk melabel suatu antigen atau mengetahui antibody yang
ada dalam tubuh. Apabila kita ingin mengetahui antigen apa yang ada di dalam tubuh, maka
yang diendapkan adalah antibodynya, begitu pula sebaliknya. Untuk mendeteksi kadar suatu
protein, maka dapat digunakan teknik ELISA sandwich assay dengan dengan mengedapkan
antibody pada well plate.
II. Prinsip dasar teknik ELISA

Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat dijabarkan sebagai
berikut :Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu permukaan
yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan
secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik
dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan antigen atau
antibodi yang diuji (cara ini digunakan pada teknik ELISA sandwich). Selanjutnya antibodi atau
antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan sampel =>
bila sampel berupa antigen, maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila sampel berupa
antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas permukaan tersebut, sehingga
dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang bersesuaian. Kemudian ke atas
permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada
saat substrat tersebut dicampurkan ke permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau
antigen spesifik yang berinteraksi dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya,
enzim yang tertaut dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang berupa pendaran flourescense.

III. Tahap tahap immunoassay


Ada tiga tahap penting dalam melaksanakan immunoassay (Persulessy: 1999) :
1. Reaksi immunology
Pada tahap pertama, cuplikan dianalisa ditambahkan bersama-sama antigen yang
diberi Label dengan suatu enzim, kedalam tabung reaksi yang berisikan antibodi yang
berikatan dengan partikel magnetik. Pestisida yang ada didalam cuplikan berlomba
dengan pestisida berlabel untuk berikatan dengan antibodi. Reaksi immunologi terjadi
selama 15 sampai 30 menit (Gambar 1).
Gambar 1. Reaksi Immunologi

2. Reaksi Pemisahan
Pada tahap kedua, suatu medan magnet yang dipakai untuk memisahkan
campuran reaksi. Semua partikel akan tertarik dan tertahan oleh dinding tabung
sementara kelebihan reagent didekantasi dan partikelnya dicuci dua kali (Gambar 2).

Gambar 2. Proses Pemisahan

3. Proses Pembentukan warna


Pada tahap ketiga, jumlah antigen berlabel enzim ditetapkan dengan
menambahkan hidrogen peroksida dan chromogen untuk menghasilkan produk
berwarna (Gambar 3). Setelah inkubasi singkat, produksi warna dihentikan dan
distabilkan dengan penambahan asam. Karena antigen berlabel berlomba dengan
antigen didalam cuplikan untuk berikatan dengan antibodi, maka pengembangan
warna sebanding dengan antigen yang berlabelkan enzim dan sebaliknya juga
sebanding dengan konsentrasi antigen di dalam cuplikan.
- Partikel magnit yang terikat
antibody

- Antigen konjugat dalam enzim

- Antigen

IV. Aplikasi Immuoassay untuk ELISA


Salah satu contoh aplikasi dari immunoassay adalah Uji Elisa. Sel ELISA
dikembangkan untuk mendeteksi antigen atau agen yang terdapat dalam sel. Sehingga
pada model ini tidak diperlukan pelapisan antigen pada mikroplate tetapi dengan cara
fiksasi sel yang diinokulasikan sampel yang dideteksi agennya, kemudian direaksikan
dengan antibodi poliklonal atau monoclonal dan akhirnya direaksikan dengan konjugat
fragmen immunoglobulin anti immunoglobulin yang digunakan untuk mendeteksi
antigen. Antibodi yang sering digunakan untuk mendeteksi agen dalam sel adalah
antibodi monoclonal, karena agen yang terdeteksi di dalam sel belum tentu merupakan
antigen yang lengkap, tetapi merupakan bagian tertentu yang dapat menstimulasi
antibodi. Hal inilah yang membuat metode ini cukup sensitive.
1. ELISA untuk Deteksi Virus
Aplikasi ELISA untuk mendeteksi infeksi virus dapat dilakukan dengan dua cara,
yang pertama adalah mendeteksi reaksi imun (interferon, sitokin, antibodi) dan yang
kedua adalah mendeteksi antigennya.
Model ELISA direct maupun indirect dan sandwich ELISA baik dengan sistem
peroksidase maupun alkali fospatase dapat digunakan.
a. Deteksi Antigen
b. Deteksi Antibodi
2. ELISA untuk Deteksi Antigen dan Antibodi pada Infeksi Bakteri
Bakteri mempunyai struktur yang cukup komplek, sehingga untuk mendeteksi
antigen dari infeksi bakteri dengan ELISA terkadang mendapat kesulitan karena
mempunyai struktur yang homogen seperti kuman golongan gram negatif. Berdasar
kompleksitas tersebut membuat terjadinya reaksi silang satu sama lain. Sebagai
contoh brucellosis dan tuberculosis. Untuk menghindari reaksi yang tidak
dikehendaki maka diperlukan material yang mempunyai spesifitas yang tinggi
dengan cara menyediakan antibodi monoklonal yang dihasilkan dari epitop yang
berbeda satu sama lain. Hal ini karena kebanyakan antigen dari antigen terdapat pada
permukaan sebagai contoh fimbria yang terletak pada permukaan yang berfungsi
untuk penempelan, enzyme ekstra sel untuk penetrasi dan invasi, kapsul untuk
perlindungan, eksotoksin, dan lain-lain.
Dalam mengembangkan ELISA pada diagnostik infeksi bakteri yang perlu
dipertimbangkan adalah menyediakan antigen spesifik. Untuk itu antigen harus
memenuhi syarat-syarat tertentu seperti antigen harus imunogenik dan menginduksi
respon antibodi pada inangnya, respon antibodi harus sedemikian rupa sehingga
infeksi dapat diketahui, dengan kata lain metode uji harus sensitif, antigen harus unik
agar mempunyai spesitifitas yang tinggi.
Secara umum ada beberapa macam antigen dari bakteri.
a. Bakteri utuh.
b. Bakteri utuh yang dirusak secara mekanis, fisik atau kimiawi seperti penggerusan,
pengocokan dengan manik-manik kaca, sonikasi, vorteks homogenizer,
pemanasan dengan suhu tinggi, pendidihan, autoklaf, surfaktan non-ion, anion
atau kation.
c. Ekstrak kasar bakteri yang dirusak dengan cara pemusingan seperti dengan
fraksinasi dengan garam dan kromatografi.
d. Senyawa kimia murni atau setengah murni.
Target antigen yang dapat digunakan untuk ELISA antara lain dinding sel Gram
positif, membran sel Gram negative, lipopolisakarida, glikolipid, peptidoglikan, asam
teikoat, flagella, fimbria (pili), polisakarida, toksin ekstrasel, ribosom, protein
membran luar.
a. Antigen Dinding Sel Bakteri
b. Antigen Membran Bakteri
c. Antigen Lipopolisakarida
d. Glikolipid
e. Flagella
f. Fimbria
g. Protein ekstraseluler (toksin)
h. Antigen non-polisakarida
i. Antigen polisakarida
Penggunaan ELISA untuk deteksi antibody dari bakteri dapat digunakan secara
luas selain untuk deteksi dini juga dapat untuk monitor hasil vaksinasi.
3. ELISA untuk infeksi parasit
Dalam pengembangan teknologi ELISA untuk parasit sedikit lebih rumit
dibandingkan dengan mikroorganisme lainnya, karena mempunyai sifat yang sangat
berbeda dan komplek satu sama lain. Setiap parasit mempunyai siklus hidup yang
beda sehingga model pengekspresian antigen juga berebeda, sehingga siklus dan
pathogenesis pada infeksi parasit sangat menentukan dalam pengembangan teknologi
ELISA. Hal yang harus dipersiapkan dalam mengembangkan ELISA pada
imunoparasitologi adalah perangkat antigen, antibodi sedang antiglobin yang dilabel
dengan enzim sudah banyak dikomersilkan dan mudah didapatkan.
a. Perangkat antigen
b. Perangkat antibodi
4. ELISA untuk diagnostik hormon
Aplikasi ELISA untuk diagnostik hormon adalah merupakan pengembangan
teknologi diagnostik Radio Immunoassay (RIA). Selain aman tingkat sensitivitasnya
7 kali lebih sensitive dibandingkan dengan RIA. Berkembangnya metode ini sangat
mendukung para ilmuwan reproduksi dalam mengendalikan antara lain siklus estrus
dengan menggunakan prostaglandin dan progesterone, pengukuran hormon
progesterone untuk diagnostik dini kehamilan (20-26 hari), penggunaan
kortikosteroid untuk merangsang kelahiran. Pada pengukuran hormon terutama
progesterone sampel yang dapat digunakan untuk ELISA adalah berasal dari darah
dan dari air susu. Hal ini sudah dapat menggambarkan fungsi luteal yang mempunyai
presisi tinggi. Di samping itu ELISA sering digunakan untuk mengukur Thyroid
Stimulating Hormon dan Human Chorionic Gonadotropin. Selain deteksi estrus,
ELISA sering digunakan untuk melacak kelainan pada ovarium apakah terjadi kista
ovarium atau kista folikular, sehingga dapat dilakukan tindakan sedini mungkin.
5. ELISA untuk aplikasi klinik
Kegunaan ELISA diklinik biasanya sering digunakan untuk memonitor respon
imun terutama untuk diagnostik dini. Sebagai contoh pendeteksian interferon pada
infeksi dini kadang tidak atau belum ditemukan antibodi seperti igM karena
interferon hanya diproduksi secara local bukan sistemik. Kelemahan diagnostic awal
pada interferon kurang bisa menggambarkan secara umum karena interferon hanya
dapat diproduksi pada sel tertentu saja, sedang immunoglobulin secara sistemik.
Model lain yang dikembangkan pada diagnostic klinik adalah sitokin atau pada
bahan komersil lebih banayk yang sudah terspesifikasi seperti interleukin (IL).
Interleukin sekarang memegang peranan penting pada infeksi dini maupun sebagai
barier terutama infeksi yang menyebabkan peradangan seperti interleukin 10 (IL-10).

V. Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)


Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain :
 Teknik pengerjaan relatif sederhana
 Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
 Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
 Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen
yang bersifat sangat spesifik)
 Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :


 Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis
antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen).
 Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga
pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal.
 Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol
negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan
blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan
antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal.
 Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan
harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan
memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
VI. Pengertian Radioimmunoassay
RIA Radioimmunoassay pertama kali dikembangkan oleh Rosalyn Yalow (1921-)dan
Solomon A. Berson (1918-1972) dari amerika serikat, pertama kali mereka bekerja untuk
mempelajari tentang hormon khusunya insulin yaitu hormon yang mengatur kadar gula dalam
darah. penelitian mereka membuktikan bahwa DM tipe II disebabkan oleh insulin yang tidak
efisien. sebelumnya,diperkirakan bahwa DM hanya terjadi karena kekurangan insulin. kemudian
mereka menemukan RIA pada tahun 1959. RIA bisa mendeteksi dan mngukur triliunan gram
substansi per ml darah. karena limit deteksi yang sangat baik ini makan RIA digunakan sebagai
peralatan laboratorium standar. digunakan untuk mendeteksi jumlah yang sangat kecil dalam
darah
Radioimmunoassay adalah teknik nuklir yang banyak digunakan untuk mengetahui
konsentrasi hormon. Pengujian ini menggunakan antibodi yang spesifik untuk hormon sebagai
protein terikat (technical reports series No 233,1984).

VII. Prinsip kerja RIA

Metode radioimmunoassay (RIA) mempunyai 2 jenis prinsip yaitu kompetitif dan non
kompetitif. Prinsip non kompetitif yang paling banyak di gunakan adalah sandwich. Prinsip dasar
dari sandwich adalah reaksi suatu antibodi dalam konsentrasi yang terbatas dengan berbagai
konsentrasi antigen. Bagian dari antigen yang bebas dan yang terikat yang timbul sebagai akibat
dari penggunaan antobodi dalam kadar yang terbatas ditentukan dengan menggunakan antigen
yang diberi label radio isotop. Ada dua jenis pendeteksian dengan RIA yakni competitive RIA
dan sandwich immunoradiometric assay (IRMA). Pada competitive RIA, sejumlah tertentu
antibodi diimobilisasi (ditempelkan) pada suatu fase padat misalnya dinding tabung plastik.
Sampel pasien yang mungkin mengandung biomolekul (misalnya patogen) ditambahkan bersama
dengan sejumlah tertentu biomolekul berlabel radioaktif yang akan berinteraksi dengan antibodi
yang timbul. Intensitas signal radiasi dari biomolekul berlabel radioaktif yang terikat pada
antibodi yang menempel pada dinding tabung akan berbanding terbalik dengan konsentrasi
biomolekul dalam sampel. Sandwich IRMA khusus dipergunakan untuk mengidentifikasi dan
mengukur suatu biomolekul yang berukuran besar. Langkah pertama adalah membuat antibodi
berlebihan yang terimobilisasi, langkah berikutnya adalah menambahkan biomolekul yang akan
ditentukan yang ditempelkan pada antibodi tersebut. Jika biomolekulnya sama seperti antibodi
yang terimobilisasi, mereka akan berikatan dengan antibodi dan membentuk lapisan pertama
sandwich. Antibodi kedua yang berlabel radioaktif kemudian ditambahkan. Antibodi ini akan
menempel pada epitope (daerah) yang berbeda dari biomolekul yang sama dari antibodi yang
terimobilisasi. Ini akan berikatan sebagai lapisan atas sandwich. Signal radiasi akan sebanding
dengan konsentrasi biomolekul dalam sampel.

Gambar 1. Prinsip dasar teknik competitive RIA dan sandwich IRMA.

Pada prinsip kompetitif bahan yang mengandung antigen yang berlabel dan antigen yang
terdapat di dalam sampel akan diberi label radio isotop sehingga terjadi kompetisi antara antigen
yang akan ditentukan kadarnya dan antigen yang diberi label dalam proses pengikatan antibodi
spesifik tersebut sampai terjadi keseimbangan. Sisa antigen yang diberi label dan tidak terikat
dengan antibody dipisahkan oleh proses pencucian. Setelah itu dilakukan penambahan
konyugate, sehingga terjadi pembentukan kompleks imun dengan konjugate. Jumlah antigen
berlabel yang terikat, antibodi pada fase padat, dan conjugate dapat ditentukan dengan suatu
radiation counter atau gamma counter. Pada pemeriksaan hormon, label radio isotop yang
digunakan adalah isotop 125 I untuk hormon LH dan progesteron estrogen dan HPL, 131I, untuk
testoteron , 3 H dan 57Co untuk FSH (7,10,11).

VIII. Keuntungan dan Kerugian RIA

Keuntungan metode RIA adalah :


a. Sensitivitas dan presisi yang tinggi
b. Mudah dikerjakan
c. Pekerjaannya lebih cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar.
Kerugian metode RIA adalah :
a. Reagen kurang stabil
b. Memerlukan proteksi terhadap bahan radioaktif (radioactive hazardous)
Metode radioimmunoassay (RIA) mempunyai kemampuan untuk menentukan zat-zat
fisiologis dalam tumbuh sampai kosentrasi yang sangat rendah sekali hampir sekitar nanogram
(ng = 10‾‾) dan bahkan mencapai konsetrasi pictogram (pg = 10 ) untuk setiap 1 ml. metode ini
sangat penting dalam peptide dan hormon steroid yang terdapat dalam plasma yang
kosentrasinya rendah. Metode RIA ini tergantung kepada kompetisi untuk mendapatkan tempat-
tempat kedudukan (ikatan) pada antibody yang spesifik dari suatu zat tertentu antara zat tertentu
di dalam serum dan zat yang sama ditandai dengan unsur radioaktif. Zat ini misalnya suatu
hormon seperti thyroxin ,FSH,LH dan lainya. Dasar kerja radioimmunoassay adalah pengikatan
antigen progesteron yang terkandung dalam serum dengan progesteron antibody spesifik yang di
lapiskan pada dinding tabung. Sisa anti bodi yang spesifik yang tidak diikat oleh antigen
progesteron sample akan mengikat 125I. makin banyak 125I yang terpecah berarti semakin
sedikit kadar progesteron di dalam saple (maryati, 1985).
IX. Pengertian Imunohistokimia (IHC)

Imunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen spesifik di dalam


sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan antara antibodi (Ab) dan antigen
(Ag) pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan
yang bervariasi tergantung dari tujuan pemeriksaan. Teknik imunohistokimia bermanfaat untuk
identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis,
therapi, dan prognosis kanker.
Teknik ini diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk diamati dibawah
mikroskop. Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang tidak kasap mata. Tempat
pengikatan antara antibodi dengan protein spesifik diidentifikasi dengan marker yang biasanya
dilekatkan pada antibodi dan bisa divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk
mengidentifikasi marker. Marker dapat berupa senyawa berwarna (Luminescence), zat
berfluoresensi (fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin), logam berat (colloidal,
microsphere, gold, silver) label radioaktif dan enzim ( Horse Radish Peroxidase (HRP) dan
alkaline phosphatase).Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya direaksikan dengan
substrat kromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk akhir berwarna dan tidak larut)
yang dapat diamati dengan mikroskop bright field (mikroskop bidang terang). Akan tetapi
seiring berkembangnya ilmu pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia
dapat langsung diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna)
dibawah mikroskop fluorescense.
X. Metode IHC

Dalam melakukan iminohistokimia, terdapat 4 metode yaitu:


Metode Direct
Prinsip dari metode imunohistokimia direct adalah menggunakan antibodi primer yang
sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung. Metode langsung
(direct method) merupakan metode pengecatan satu langkah karena hanya melibatkan 1 jenis
antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya antiserum terkonjugasi fluorescein
isothiocyanate (FITC) atau rodhamin.
Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan dimodifikasi
dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut. molekul indikator tersebut
dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enzim peroksidase, sehingga apabila
diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut.
Metode Indirect
Prinsip metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada
labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi
dengan IgG dari antibodi primer. Metode tidak langsung (indirect method) menggunakan dua
macam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel) dan antibodi sekunder (berlabel).
Antibodi primer bertugas mengenali antigen yang diidentifikasi pada jaringan (first layer),
sedangkan antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi
kedua merupakan anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan penambahan
substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi senyawa kimiawi yang
dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan senyawa tertentu.
Penggunaan kromogen fluorescent dye seperti FITC, rodhamin, dan Texas-red disebut
metode immunofluorescence, sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti peroksidase, alkali
fosfatase, atau glukosa oksidase disebut metode immunoenzyme. Pada metode ini antibodi
spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan
modifikasi pada antibodi ini. Namun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan dengan
antibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. Antibodi sekunder ini dimodifikasi
sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Setiap 1 antibodi primer dapat
dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah diberikan substrat akan
terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut.
Metode Peroxidase – anti – Peroxidase (PAP)
Adalah analisis imunohistokimia menggunakan tiga molekul peroksidase dan dua
antibodi yang membentuk seperti roti sandwich. Teknik ini memanfaatkan afinitas antibodi
terhadap antigen (enzim) untuk membentuk kompleks imun stabil sebagai perlawanan terhadap
proses kimia terkonjugasi Fitur unik dari prosedur ini adalah larutan enzim – antibodi dan
kompleks imun PAP. Enzim Horseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk
menyuntik spesies tertentu dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim.
Antiserum ini dipanen dan ditempatkan dalam larutan pada enzim sehingga membentuk
kompleks imun yang larut.
Metode Avidin-Biotin-Complex (ABC)
Adalah metode analisis imunohistokimia menggunakan afinitas terhadap molekul avidin-
biotin oleh tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan beberapa biotin dalam molekul avidin
tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen
target.
Mekanisme Imunokimia
Rangkaian pemeriksaan Imunohistokimia dimulai dengan pengambilan sampel lalu
pembuatan paraffin block. Setelah itu dilakukan pewarnaan imunohistokimia. Berikut
perinciannya :
Pembuatan paraffin block
1. Jaringan dicuci dengan PBS
2. Difiksasi dengan formalin 10%
3. Dilakukan dehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96%
dan absolute)
4. Clearing menggunakan xilol 2 kali, masing-masing 60 menit.
5. Infiltrasi menggunakan paraffin lunak selama 60 menit pada suhu 480C.
6. Block dalam paraffin keras pada cetakan dan diamkan selama sehari.
7. Tempelkan. Pada holder dilakukan pemotongan setebal 4-6 mm dengan rotary
microtome.
8. Mounting pada objek dengan gelatin 5%
Proses deparafinisasi
1. Slide direndam xilol 2 kali, masing-masing selama 5 menit.
2. Rehidrasi menggunakan alcohol bertingkat (30%, 50%, 70%, 80%, 96% dan
absolute) masing-masing 5 menit
3. Bilas dengan dH2O selama 5 menit
Proses imunohistokimia terhadap eNOS
1. Slide preparat dicuci dengan PBS pH 7,4
2. Aplikasikan 3% h2o2 (daco, Inc) selama 10 menit.
3. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
4. Blocking menggunakan serum 2% BSA (Sigma USA) selama 60 menit (1%)
5. Inkubasi dengan antibody primer mouse monoclonal vcam-1 human absorbed
semalam pada suhu 40C (1:100)
6. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
7. Tetesi dengan anti body sekunder berlabel biotin (Santa Crus) dan inkubasi selama
1 jam (1:200)
8. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
9. Tetesi dengan SA-HKP (Strep Avidin horse radis peroxidase) (Dako,Inc) selama
40 menit (1:500)
10. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
11. Aplikasikan cromogen untuk HRP yaitu DAB (Diamono Benzidine) (Daco,Inc)
12. Bilas dengan H2O
13. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit 3 kali
14. Counter straining dengan mayer Hematoxilen (lab Vision) selama 10 menit
15. Cuci dengan tap Water
16. Kering anginkan dan mounting menggunakan entelan serta cover Glass
Pembuatan media
Larutan PBS
1. Na H2 PO4 2 H2O 2,4 gram
2. Na2HPO4 1,2 gram
3. KH2PO4 0,7 gram
4. KCI 6,8 gram
Pembuatan
1. Dilarutkan ke 4 bahan tersebut dengan aquadest sampai 1 L
2. Diletakkan di atas magnetic stirrer agar homogen
3. Diukur pada pH 7,4 dan disterilisasi
4. Simpan disuhu dingin
5. Jika ingin diencerkan, ambil 100 cc, tambahkan 900 mL Aquades

Cara kerja Imunohistokimia


Hari pertama
1. Deparafinisasi
a. Teteskan Xylol 2×10 menit
b. Teteskan ethanol absolute 1×5 menit
c. Teteskan ethanol 90% 1×5 menit
d. Teteskan ethanol 80% 1×5 menit
e. Teteskan ethanol 70% 1×5 menit
f. Teteskan Sterile aquades 3×5 menit
2. Slide siap untuk dilakukan Imunohistokimia :
a. Dicuci PBS steril 3×5 menit
b. Dikeringkan dengan tissue
c. Ditambah H2O2 3% dalam methanol inkubasi 15 sampai dengan 20menit
d. Dicuci PBS steril3x5 menit
3. Blocking unspesifik protein :
a. Ditambah 0,255 triton-x100 dalam blocking buffer BSA selama 1 jam pada suhu
ruang
b. Dicuci dengan PBS steril 3×5 menit
4. Inkubasi antibodi primer :
a. Ditambah antibodi primer dalam blocking buffer BSA
b. Inkubasi semalam pada 4°C
c. Dicuci PBS steril 3×5 menit
Hari kedua
1. Inkubasi antibodi sekunder :
a. Ditambah antibodi sekunder kit, inkubasi 60 menit pada suhu kamar (walapun
menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya)
b. Dicuci PBS steril 3×5 menit
2. Inkubasi SAHRP :
a. Ditambah SAHRP kit, inkubasi 40 menit pada suhu kamar
b. Dicuci PBS steril 3×5 menit
c. Dicuci akuades steril 3×5 menit
3. Aplikasi kromagen DAB (dipilih DAB karena lebih awet) :
a. Ditambah (DAB :buffer DAB = 1:50), inkubasi 20 menit pada suhu kamar
b. Dicuci PBS steril 3×5 menit diaminobenzidine
4. Counterstain dengan mayer hematoxilen :
a. Ditambah (mayer : tap water =1:10), inkubasi 5-10 menit pada suhu kamar
b. Dicuci tap water steril 3×5 menit
c. Dikeringkan anginkan
5. Mounting dengan entellan kemudian diangin-anginkan
6. Amati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskop
XI. Aplikasi Imunohistokimia

Imunohistokimia dapat digunakan untuk mendeteksi berbagai penyakit, seperti kanker,


tumor dan dapat digunakan untuk identifikasi sel atau jaringan. Contoh penyakitnya yang dapat
dideteksi dengan Imunohistokimia adalah adenocarcinoma, carcinoma, sarcoma, Hodgkin’s
disease, tumor yolk sac, karsinoma hepatoselluler, gastrointestinal stromal tumors (GIST), renal
cell carcinoma, acute lymphoblastic leukemia, Identifikasi sel B dan sel T limfa. IHC juga dapat
digunakan pada jaringan kuda laut untuk menentukan adanya protein baik dimana dan kapan
protein akan berfungsi.
Metode imunohistokimia yang diterapkan pada kuda laut adalah dengan membagi
menjadi 4 section. Awalnya, dilakukan penguraian untuk melakukan labeling wholemount pada
sel embrio kuda laut, penguraian ini diprotocol secara umum. Kemudian, section kedua menutupi
section variasinya untuk labeling wholemount pada larva untuk menanggulangi kesulitan
antibodi dalam melakukan penetrasi di jaringan. Metode ini, didasarkan pada protocol yang
membentuk larva medaka., dikembangkan untuk penggunaan khusus dengan anti-asetat tubulin
antibody pada 2 sampai 6 larva tertua. Dan mungkin tidak diterapkan untuk antibodi primer, jadi
yang digunakan memang biasanya antibodi sekunder. labeling jaringan yang dilakukan pada
jaringan dewasa biasanya akan lebih menyulitkan metode labeling wholemount ini, sehingga
penetrasi antibodi yang tidak lengkap. Untuk mengatasi masalah ini perlu dilakukan pembagian
material sebelumnya yang akan dilakukan labeling. Ini disebut sebagai section ketiga. Section
terakhir menjadi akhir dari proses labeling pada jaringan yang sama dengan dua antibodi yang
berbeda, dan mengikat serta membagi label jaringan yang akan diuraikan.
XII. Keuntungan dan Kerugian IHC

Teknik imunohistokimia dapat digunakan untuk mempelajari distribusi enzim yang


spesifik pada struktur sel intak (normal/lengkap), mendeteksi komponen sel, biomakro molekul
seperti protein, karbohidrat. Imunohistokimia merupakan teknik deteksi yang sangat baik dan
memiliki keuntungan yang luar biasa untuk dapat menunjukkan secara tepat di dalam jaringan
mana protein tertentu yang diperiksa. Teknik ini telah digunakan dalam ilmu saraf, yang
memungkinkan peneliti untuk memeriksa ekspresi protein dalam struktur otak tertentu.
Kekurangan dari teknik ini adalah kurang spesifik terhadap protein tertentu tidak seperti
teknik imunoblotting yang dapat mendeteksi berat molekul protein dan sangat spesifik terhadap
protein tertentu. Teknik ini banyak digunakan dalam diagnostik patologi bedah terhadap kanker,
tumor, dan sebagainya.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, Ahyar.2005. Teknik Immunoassay Dalam Analisis Keamanan Pangan Dasar-


Dasar Reaksi Kimia dan Penerapannya. Jurnal Marina Chimica Acta. Vol. 6 No .
1 hal. 21-24.
Arini Krisna Oktavia. 2012. TES ELISA Melalui
http://pandalikespurple.blogspot.com/2012/04/test-elisa.html Diakses 11
November 2019.
Brahmana K. 1981. Immunologi, Serologi dan Tata Kerja Laboratorium. Medan.
Brooks, G.F., dkk., 2005, Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika; Jakarta.
Laboratory Analysis and Clinical Application. 1994. Boston Butterworth-Heineman.
Linde. R dan Goshin J.P. Reproduction. In James P.G. Lawrence V.B (eds),
immunoassay.
Persulessy, A.E. dan Pramudji.1999. Kemungkinan Pemanfaatan Teknik Immunoassay
Dalam Usaha Pemantauan Residu Pestisida Di Kawasan Pesisir Pantai. Jurnal
Marina Chimica Acta, Edisi Spesial Oktober 1999, hal 4 – 11.
Rantam, F.A., 2003, Metode Imunologi, Airlangga University Press; Surabaya.
Sofro, A.S.M, 1994, Imuno Kimia, Penerbit Andi Offset; Yogyakarta.
Suryo. 1996. Genetika. Departemen P dan K Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi.
Jakarta.