NIH Akses Publik

penulis Naskah
Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.
Diterbitkan dalam bentuk diedit akhir sebagai:
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Juli 2013; 31 (7): 397-405. doi: 10,1016 / j.tibtech.2013.04.004.

metode berbasis Cas ZFN, talen dan CRISPR / untuk rekayasa genom

Thomas Gaj 1,2,3, Charles A. Gersbach 4,5, dan Carlos F. Barbas III 1,2,3 1 The Skaggs Institut Kimia Biologi, The
Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA
2 Departemen Biologi Molekuler, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA

3 Departemen Kimia, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA

4 Departemen Biomedical Engineering, Duke University, Durham, NC, USA

5 Institutes untuk Genome Sciences dan Kebijakan, Duke University, Durham, NC, USA

Abstrak
NIH-PA Author Manuscript

nucleases seng-jari (ZFNs) dan transkripsi aktivator seperti efektor nucleases (Talens) terdiri dari kelas alat yang
kuat yang mendefinisikan ulang batas-batas penelitian biologi. Ini nucleases chimeric terdiri dari diprogram,
modul urutan spesifik DNA-mengikat terkait dengan domain DNA belahan dada non-spesifik. ZFNs dan Talens
memungkinkan berbagai modifikasi genetik dengan menginduksi DNA untai ganda istirahat yang merangsang
rawan kesalahan nonhomolog end bergabung atau perbaikan homologi-diarahkan pada lokasi genom tertentu.
Di sini, kami meninjau prestasi yang dimungkinkan oleh teknologi nuklease spesifik lokasi dan mendiskusikan
aplikasi reagen ini untuk analisis genetik dan manipulasi. Selain itu, kami menyoroti potensi terapi ZFNs dan
Talens dan mendiskusikan prospek masa depan untuk lapangan,

Kata kunci

seng-jari; KISAH; CRISPR; nuklease; rekayasa genom

pendekatan klasik dan kontemporer untuk menetapkan fungsi gen

NIH-PA Author Manuscript

Dengan pengembangan metode baru dan terjangkau bagi seluruh sekuensing genom, dan desain dan
implementasi skala besar proyek genom penjelasan, para ilmuwan yang siap untuk memberikan pada janji-janji
Revolusi Genomic untuk mengubah ilmu dasar dan obat-obatan pribadi. kekayaan yang dihasilkan dari peneliti
informasi hadiah dengan tantangan utama yang baru mengkonversi sejumlah besar data ini menjadi pengetahuan
fungsional dan relevan secara klinis. Pusat untuk masalah ini adalah kebutuhan untuk metode yang efisien dan
dapat diandalkan yang memungkinkan peneliti untuk menentukan bagaimana genotipe pengaruh fenotipe. Target
inaktivasi gen melalui rekombinasi homolog adalah metode yang kuat yang mampu memberikan informasi yang
meyakinkan untuk mengevaluasi fungsi gen [1]. Namun, penggunaan teknik ini telah terhambat oleh beberapa
faktor,

© 2013 Elsevier Ltd All rights reserved.

Sesuai author: Barbas, CF ( carlos@scripps.edu ).
Penerbit Disclaimer: Ini adalah file PDF dari sebuah naskah diedit yang telah diterima untuk publikasi. Sebagai layanan kepada pelanggan kami kami menyediakan
versi awal ini naskah. Naskah akan menjalani copyediting, typesetting, dan review bukti yang dihasilkan sebelum diterbitkan dalam bentuk citable akhir. Harap dicatat
bahwa selama kesalahan proses produksi dapat ditemukan yang dapat mempengaruhi isi, dan semua penolakan hukum yang berlaku untuk Pertain jurnal.
 Gaj et al. Halaman 2

konstruksi rekayasa dengan benar dimasukkan ke target situs kromosom, kebutuhan untuk memakan waktu dan
seleksi tenaga kerja tidak sensitif / strategi skrining, dan potensi efek mutagenik yang merugikan. Target gen
knockdown oleh interferensi RNA (RNAi) telah memberikan peneliti dengan cepat, murah dan tinggi-throughput
NIH-PA Author Manuscript

alternatif untuk rekombinasi homolog [2]. Namun, knockdown oleh RNAi tidak lengkap, bervariasi antara percobaan
dan laboratorium, memiliki efek off-target yang tak terduga, dan hanya menyediakan penghambatan sementara fungsi
gen. Pembatasan ini menghambat kemampuan peneliti untuk langsung link di fenotip untuk genotipe dan membatasi
aplikasi praktis dari teknologi RNAi.

Dalam dekade terakhir, pendekatan baru telah muncul yang memungkinkan peneliti untuk secara langsung memanipulasi hampir gen

apapun dalam beragam jenis sel dan organisme. teknologi inti ini - sering disebut sebagai “genome editing” - didasarkan pada penggunaan

nucleases rekayasa terdiri dari domain DNA-mengikat urutan spesifik menyatu untuk non-spesifik DNA belahan dada modul [3, 4]. Ini

nucleases chimeric memungkinkan modifikasi efisien dan tepat genetik dengan menginduksi (DSBs) untai ganda istirahat DNA target yang

merangsang mekanisme perbaikan DNA sel, termasuk rawan kesalahan non-homolog end bergabung (NHEJ) dan perbaikan homologi

diarahkan (HDR) [5 ]. Fleksibilitas dari pendekatan ini difasilitasi oleh programabilitas dari domain DNA-mengikat yang berasal dari

zincfinger dan transkripsi aktivator-seperti protein efektor. Kombinasi kesederhanaan dan fleksibilitas telah melambungkan nucleases

zinc-finger (ZFNs) dan transkripsi aktivator seperti nucleases efektor (Talens) ke garis depan rekayasa genetika. Di sini, kami meninjau

kemajuan terbaru dalam teknologi nuklease spesifik dan mendiskusikan aplikasi reagen ini untuk ditargetkan rekayasa genom dan analisis

dalam sel eukariotik dan organisme model yang. Kami juga membahas potensi terapi teknologi tersebut dan memeriksa prospek masa

depan, termasuk pengembangan dan penerapan CRISPR / berbasis Cas endonuklease DNA RNA-dipandu. kami meninjau kemajuan

terbaru dalam teknologi nuklease spesifik dan mendiskusikan aplikasi reagen ini untuk ditargetkan rekayasa genom dan analisis dalam sel
NIH-PA Author Manuscript

eukariotik dan organisme model yang. Kami juga membahas potensi terapi teknologi tersebut dan memeriksa prospek masa depan,

termasuk pengembangan dan penerapan CRISPR / berbasis Cas endonuklease DNA RNA-dipandu. kami meninjau kemajuan terbaru

dalam teknologi nuklease spesifik dan mendiskusikan aplikasi reagen ini untuk ditargetkan rekayasa genom dan analisis dalam sel

eukariotik dan organisme model yang. Kami juga membahas potensi terapi teknologi tersebut dan memeriksa prospek masa depan,

termasuk pengembangan dan penerapan CRISPR / berbasis Cas endonuklease DNA RNA-dipandu.

Kustom DNA-binding domain

Fleksibilitas ZFNs dan Talens muncul dari kemampuan untuk menyesuaikan domain DNA-mengikat untuk mengenali
hampir urutan apapun. modul DNA-mengikat ini dapat dikombinasikan dengan berbagai domain efektor berdampak
struktur genom dan fungsi (Kotak 1), termasuk nucleases, aktivator transkripsi dan represor, recombinases,
transposases, methyltransferases histone DNA dan acetyltransferases histon. Dengan demikian, kemampuan untuk
berhasil melaksanakan perubahan genetik tergantung pada spesifisitas DNA-mengikat dan afinitas dirancang seng-jari
dan protein TALE. Di bawah ini, kami menyoroti beberapa yang paling pendekatan sukses untuk perakitan ini modular
domain DNA-mengikat.

Cys 2- Nya 2 protein seng-jari

NIH-PA Author Manuscript

The Cys 2- Nya 2 domain seng-jari adalah salah satu jenis yang paling umum dari DNA-mengikat motif ditemukan pada
eukariota dan mewakili domain protein kedua yang paling sering dikodekan dalam genom manusia. Sebuah seng-jari
individu terdiri dari sekitar 30 asam amino dalam dilestarikan ββα konfigurasi [6] (Gambar 1a). Beberapa asam amino
pada permukaan α-
helix biasanya menghubungi tiga pasangan basa (bps) dalam alur utama DNA, dengan berbagai tingkat
selektivitas. Struktur modular protein seng-jari telah membuat mereka kerangka yang menarik untuk desain
kustom protein DNA-mengikat. Kunci aplikasi protein seng-jari pengakuan DNA tertentu adalah
pengembangan dari array tidak alami yang mengandung lebih dari tiga domain seng-jari. muka ini difasilitasi
oleh penemuan berbasis struktur urutan linker sangat kekal yang memungkinkan pembangunan protein
seng-jari sintetis yang diakui DNA urutan 9 sampai 18 bps panjang [7]. Karena 18 bps urutan DNA dapat
memberi kekhususan dalam 68 miliar bp DNA, metode ini memungkinkan untuk urutan tertentu yang akan
ditargetkan dalam genom manusia untuk pertama kalinya [8, 9]. Meskipun awalnya kontroversial [10],

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 3

Strategi untuk membangun protein seng-jari yang mengenali urutan DNA yang berdekatan yang spesifik dalam
genom kompleks [6-9, 11-15].
NIH-PA Author Manuscript

Berikut ini bukti-of-prinsip kerja, beberapa metode untuk membangun protein seng-jari dengan spesifisitas DNA-mengikat unik

dikembangkan. The “modular perakitan” pendekatan melibatkan penggunaan perpustakaan pra-dipilih dari modul seng-jari yang dihasilkan

oleh pemilihan perpustakaan kombinatorial besar atau dengan desain yang rasional [6, 16]. Karena domain seng-jari telah dikembangkan

yang mengakui hampir semua dari 64 kemungkinan kembar tiga nukleotida, pra-dipilih modul seng-jari dapat dihubungkan bersama-sama

secara erat untuk urutan DNA target yang mengandung serangkaian kembar tiga DNA tersebut [6, 8, 13 -15, 17]. Atau, pendekatan

berbasis seleksi, seperti OPEN (Oligomerized Renang Engineering) dapat digunakan untuk memilih untuk array seng-jari baru dari acak

perpustakaan yang mempertimbangkan tergantung pada konteks interaksi antara tetangga jari [18]. Pendekatan juga telah dikembangkan

yang menggabungkan metode yang dijelaskan di atas, memanfaatkan modul seng-jari pra-dipilih untuk konteks-ketergantungan untuk

merakit array lagi oleh perakitan modular [19, 20]. Selama bertahun-tahun, teknologi protein seng-jari adalah satu-satunya pendekatan yang

tersedia untuk membuat custom sitespecific protein DNA-mengikat dan enzim. Direkayasa seng-jari juga tersedia secara komersial;

Sangamo Biosciences (Richmond, CA) telah mengembangkan platform kepatutan (CompoZr) untuk konstruksi seng-jari dalam kemitraan

dengan Sigma-Aldrich (St Louis, MO), yang memungkinkan peneliti untuk konstruksi memotong seng-jari dan validasi sama sekali dan

ribuan protein sudah tersedia. Secara umum, teknologi protein seng-jari memungkinkan menargetkan hampir setiap urutan. modul

memanfaatkan seng-jari pra-dipilih untuk konteks-ketergantungan untuk merakit array lagi oleh perakitan modular [19, 20]. Selama

bertahun-tahun, teknologi protein seng-jari adalah satu-satunya pendekatan yang tersedia untuk membuat custom sitespecific protein
DNA-mengikat dan enzim. Direkayasa seng-jari juga tersedia secara komersial; Sangamo Biosciences (Richmond, CA) telah

mengembangkan platform kepatutan (CompoZr) untuk konstruksi seng-jari dalam kemitraan dengan Sigma-Aldrich (St Louis, MO), yang

memungkinkan peneliti untuk konstruksi memotong seng-jari dan validasi sama sekali dan ribuan protein sudah tersedia. Secara umum,
NIH-PA Author Manuscript

teknologi protein seng-jari memungkinkan menargetkan hampir setiap urutan. modul memanfaatkan seng-jari pra-dipilih untuk konteks-ketergantungan untuk merakit array lag

Transkripsi aktivator seperti efektor

Penemuan baru-baru ini dari modular kode pengakuan DNA sederhana dengan transkripsi activatorlike efektor
(KISAH) protein [21, 22] telah menyebabkan ekspansi eksplosif platform alternatif untuk rekayasa diprogram protein
DNA-mengikat. Cerita yang terjadi secara alami protein dari tanaman genus bakteri patogen Xanthomonas, dan
mengandung DNA-binding domain terdiri dari serangkaian 33-35 amino domain berulang asam bahwa setiap
mengakui bp tunggal (Gambar 1b). KISAH spesifisitas ditentukan oleh dua asam amino hypervariable yang dikenal
sebagai repeat-variabel diresidues (RVDS) [23, 24]. Seperti zincfingers, mengulangi KISAH modular dihubungkan
bersama untuk mengenali urutan DNA berdekatan. Namun berbeda dengan protein zinc finger, tidak ada
re-engineering dari hubungan antara pengulangan yang diperlukan untuk membangun array panjang cerita dengan
kemampuan untuk alamat secara teoritis situs tunggal dalam genom. Berikut hampir dua dekade merintis kerja
berdasarkan protein seng-jari, banyak domain efektor telah dibuat tersedia untuk sekering untuk mengulangi KISAH
untuk modifikasi genetik yang ditargetkan, termasuk nucleases [25-27], aktivator transkripsi [27, 28] dan spesifik
lokasi recombinases [29]. Sementara pengakuan dasar tunggal KISAH-DNA mengikat mengulangi fleksibilitas desain
affords lebih besar dari protein tripletconfined seng-jari, kloning berulang array TALE hadiah tantangan teknis
meningkat karena urutan berulang identik luas. Untuk mengatasi masalah ini, beberapa metode telah dikembangkan
yang memungkinkan perakitan cepat dari array TALE kustom. Strategi ini termasuk “Golden Gate” kloning molekuler
NIH-PA Author Manuscript

[30], tinggi-throughput fase padat perakitan [31, 32] dan teknik kloning ligasi-independen [33]. Beberapa skala besar,
studi yang sistematis memanfaatkan berbagai metode perakitan telah menunjukkan bahwa mengulangi KISAH dapat
dikombinasikan untuk mengenali hampir semua user-defined urutan [31, 33]. Keterbatasan hanya menargetkan untuk
array TALE yang ada konsensus dalam literatur adalah bahwa TALE situs pengikatan harus (harus) mulai dengan
dasar T. Memang, kemudahan yang TALE mengulangi dapat dirakit jelas dalam sebuah studi baru-baru ini
melaporkan pembangunan perpustakaan Talens menargetkan 18.740 protein-coding gen manusia [34], sebuah
prestasi teknologi yang tidak hanya akan memfasilitasi berbagai penelitian baru, tapi akan juga mendorong lain,
upaya sama ambisius.

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 4

Penelitian Bio (Paris, Perancis), Transposagen Biopharmaceuticals (Lexington, KY) dan Life Technologies (Grand
Island, NY).
NIH-PA Author Manuscript

Genom editing dengan nucleases spesifik lokasi

Secara historis, ditargetkan inaktivasi gen, penggantian atau penambahan telah dicapai oleh rekombinasi
homolog; Namun, rendahnya efisiensi rekombinasi homolog dalam sel mamalia dan organisme model yang
secara dramatis membatasi utilitas dari pendekatan ini. Menyusul penemuan bahwa induksi dari DSB
meningkatkan frekuensi HDR oleh beberapa kali lipat, nucleases ditargetkan telah muncul sebagai metode
pilihan untuk meningkatkan efisiensi perubahan genetik HDR-dimediasi. Dengan co-menyampaikan nuklease
sitespecific dengan donor plasmid bantalan lokus spesifik homologi lengan [35], satu atau beberapa transgen
dapat efisien diintegrasikan ke dalam lokus endogen (Gambar 2a). urutan donor linier dengan <50 pasangan
basa homologi [36], serta untai tunggal oligonukleotida DNA [37], juga dapat digunakan untuk menginduksi
mutasi, penghapusan atau sisipan di situs target. Secara signifikan, nuklease-dimediasi ditargetkan menormalkan
integrasi untuk efek posisional yang biasanya mencampuradukkan berbagai jenis analisis genetik dan
memungkinkan studi hubungan struktur-fungsi di lingkungan kromosom kompleks dan asli. Selain peran mereka
dalam memfasilitasi HDR, nucleases spesifik lokasi juga memungkinkan generasi yang cepat dari jalur sel dan
organisme dengan nol fenotipe; NHEJ-dimediasi perbaikan dari lead DSB nucleaseinduced pengenalan insersi
kecil atau delesi di lokasi yang ditargetkan, sehingga sistem gugur fungsi gen melalui mutasi frame-pergeseran
[38] (Gambar 2b). nucleases Sitespecific juga dapat menginduksi penghapusan segmen kromosom yang besar
[39, 40]. Metode ini telah terbukti untuk mendukung skala besar kromosom inversi [41] dan translokasi [42].
NIH-PA Author Manuscript

Akhirnya, dengan melakukan sinkronisasi pembelahan nuklease-dimediasi DNA donor dengan target kromosom,
transgen besar (hingga 14 kb) telah diperkenalkan ke berbagai endogen lokus melalui NHEJ-dimediasi ligasi [43,
44]. Bersama-sama, pendekatan ini mendukung studi fungsi gen dan pemodelan negara penyakit dengan gen
mengubah ke meniru kedua dikenal dan belum genotipe uncharacterized. Banyak dari pendekatan ini telah
diperpanjang untuk jenis sel progenitor, termasuk embrio stem (ES) sel [45] dan induced pluripotent stem (iPS)
sel [46, 47], mendorong pengembangan lebih lanjut mereka untuk pemodelan berbagai kondisi genetik [48 , 49]
(Tabel 1). Perpanjangan teknologi ini untuk mempelajari peran non-coding DNA dalam regulasi dan ekspresi gen
coding juga dapat dibayangkan [50, 51],

Meningkatkan kinerja nucleases spesifik lokasi

Agar nucleases disesuaikan untuk membawa relevansi untuk analisis genetik dan aplikasi klinis, mereka harus menunjukkan
NIH-PA Author Manuscript

spesifisitas yang ketat terhadap target DNA dimaksudkan mereka. genom kompleks, bagaimanapun, sering mengandung
beberapa salinan dari urutan yang identik atau sangat homolog dengan target DNA yang dimaksudkan, yang mengarah ke
off-sasaran aktivitas dan toksisitas selular. Untuk mengatasi masalah ini, struktur [53, 54] dan berbasis seleksi [55, 56]
pendekatan telah digunakan untuk menghasilkan peningkatan ZFN dan talen heterodimers dengan dioptimalkan spesifisitas
belahan dada dan toksisitas berkurang. Laboratorium kami telah menggunakan evolusi diarahkan untuk menghasilkan varian
hyperactivated dari Fok Aku pembelahan domain, Sharkey, bahwa pameran a> 15fold peningkatan aktivitas pembelahan
dibandingkan dengan ZFNs tradisional [56] dan secara langsung kompatibel dengan berbagai arsitektur ZFN [55]. Selain itu, ada
banyak bukti yang menunjukkan bahwa 4 sampai 6 domain seng-jari untuk setiap setengah enzim ZFN secara signifikan
meningkatkan aktivitas dan spesifisitas [13, 56-58]. metode tambahan untuk meningkatkan aktivitas ZFN termasuk penggunaan
kondisi budaya hipotermia transient untuk meningkatkan tingkat ekspresi nuklease [59], co-pengiriman nucleases spesifik lokasi
dengan DNA akhir-pengolahan enzim [60], dan penggunaan neon vektor pengganti reporter bahwa memungkinkan untuk
pengayaan ZFN dan

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 5

sel Talen-dimodifikasi [61]. Kekhasan editing genom ZFN-dimediasi telah lebih disempurnakan oleh perkembangan seng-jari
nickases (ZFNickases) [62-64], yang mengambil keuntungan dari temuan bahwa induksi sobek DNA merangsang HDR [65]
tanpa mengaktifkan kesalahan-yang rawan NHEJ perbaikan jalur. Akibatnya, pendekatan ini mengarah ke lebih sedikit
NIH-PA Author Manuscript

peristiwa mutagenesis off-sasaran daripada metode konvensional DSB-diinduksi untuk mengedit genom; Namun, frekuensi
HDR oleh ZFNickases tetap lebih rendah daripada yang dicapai dengan ZFNs konvensional. Akhirnya, DNA konvensional
dan metode berbasis mRNA untuk memberikan ZFNs ke dalam sel dibatasi untuk jenis sel tertentu dan berkaitan dengan
efek samping yang tidak diinginkan, termasuk mutagenesis insersional, toksisitas dan efisiensi rendah (Kotak 2). Untuk
mengatasi keterbatasan ini, kami baru-baru ini mengembangkan sebuah alternatif sederhana berdasarkan pengiriman
langsung dari protein ZFN dimurnikan ke dalam sel. Pendekatan ini tidak membawa risiko mutagenesis insersional dan
mengarah ke relatif lebih sedikit efek dari target daripada sistem gen-pengiriman ZFN yang mengandalkan ekspresi dari
asam nukleat [66]. jenis platform pengiriman sehingga dapat mewakili strategi optimal untuk studi yang memerlukan presisi
rekayasa genom dalam sel.

nucleases spesifik lokasi dalam model organisme

nucleases spesifik lokasi telah memungkinkan pengenalan modifikasi yang ditargetkan di sejumlah organisme model
umum untuk penelitian biologi, termasuk ikan zebra [67-69], tikus dan tikus [70, 71], Drosophila [ 72, 73], C. elegans [ 74],
dan banyak spesies lainnya untuk berbagai aplikasi, termasuk kupu-kupu raja [75], katak [76], dan ternak [77, 78]. ZFNs
NIH-PA Author Manuscript

dan Talens juga telah memungkinkan peneliti untuk membandingkan fungsi gen di seluruh spesies terkait, seperti C.
elegans dan C. briggsae [ 79], shedding cahaya pada persamaan dan perbedaan antara organisme terkait erat dan
membuat analisis antara pasangan gen orthologous mungkin. Dengan embrio-sel tunggal mikro-suntik dengan talen
mRNA dan oligonukleotida singlestranded DNA [80] atau plasmid donor dengan diperpanjang (> 800 bp) homologyarms
[81], Talens telah dicapai integrasi dalam ikan zebra yang ditargetkan, yang memungkinkan generasi loxP rekayasa
kromosom dan kemungkinan untuk aktivasi gen kondisional dalam organisme model ini. Selain model hewan yang
berharga, baik ZFNs dan Talens telah digunakan untuk memperkenalkan perubahan yang ditargetkan pada tanaman,
termasuk Arabidopsis [ 82] dan beberapa spesies tanaman [83, 84], yang memungkinkan penggabungan sifat-sifat yang
berharga, seperti penyakit [85] dan herbisida-resistance [83, 84]. Keragaman organisme dimodifikasi oleh nucleases
spesifik lokasi ini pasti akan terus tumbuh, memperluas repertoar sistem model untuk penelitian dasar dan pengetahuan
tentang seluk-beluk dan peluang biologi genom.

aplikasi terapi nucleases spesifik lokasi

Penggunaan nucleases spesifik untuk tujuan terapeutik merupakan pergeseran paradigma dalam terapi gen. Tidak
NIH-PA Author Manuscript

seperti metode konvensional, yang baik sementara alamat gejala penyakit atau acak mengintegrasikan faktor
terapeutik dalam genom, ZFNs dan Talens mampu mengoreksi penyebab yang mendasari penyakit, oleh karena itu
secara permanen menghilangkan gejala dengan modifikasi genom yang tepat. Sampai saat ini, ZFN-diinduksi HDR
telah digunakan untuk langsung memperbaiki mutasi penyebab penyakit yang berhubungan dengan X-linked
defisiensi imun gabungan yang parah (SCID) [86], hemofilia B [87], penyakit sickle-cell [88, 89], dan α 1- antitrypsin
[90]. Selain itu, ZFNs telah digunakan untuk genetis perbaikan Parkinson mutasi penyakit-terkait dalam gen SPMB
pada pasien yang diturunkan sel iPS manusia [91]. Target KO gen melalui ZFN-diinduksi perbaikan NHEJ-dimediasi
juga telah terbukti strategi berpotensi kuat untuk memerangi HIV / AIDS. ZFNs telah digunakan untuk berunding
HIV-1 tahan dengan menonaktifkan co-reseptor HIV CC kemokin reseptor tipe 5 (CCR5) pada sel primer T [92] dan
stem hematopoietik / sel progenitor [93]. Pendekatan ini sedang dalam uji klinis (NCT01252641, NCT00842634 dan
NCT01044654). Baru-baru ini, ZFN-dimediasi integrasi ditargetkan faktor pembatasan HIV anti ke CCR5

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 6

lokus telah menyebabkan pembentukan sel-sel T yang menunjukkan perlindungan dekat-lengkap dari kedua
R5 dan strain X4-tropik dari HIV [94]. Selain itu, ZFNs telah digunakan untuk meningkatkan kinerja
immunotherapies berbasis sel T dengan menonaktifkan ekspresi gen reseptor sel T endogen [95, 96],
NIH-PA Author Manuscript

sehingga memungkinkan generasi sel T tumor spesifik dengan profil efikasi ditingkatkan. Akhirnya,
nucleases spesifik mampu kemungkinan unik aman memasukkan transgen terapi ke spesifik “safe harbor”
lokasi di genom manusia [97, 98]. Sedangkan utilitas keseluruhan nucleases spesifik lokasi saat ini terbatas
pada sel-sel somatik, terus kemajuan dalam penelitian sel induk, termasuk produksi dan manipulasi sel iPS,
akhirnya akan terbuka arah baru yang tak terhitung jumlahnya untuk terapi gen,

Genom editing menggunakan programmable RNA-dipandu endonuklease DNA

Berbeda dari nucleases spesifik dijelaskan di atas, CRISPR (Clustered Regulatory interspaced pendek palindromic
Mengulang) / CRISPR terkait (Cas) sistem baru-baru ini muncul sebagai alternatif yang berpotensi lancar dan efisien
untuk ZFNs dan Talens untuk mendorong perubahan genetik yang ditargetkan. Pada bakteri, sistem CRISPR
memberikan kekebalan mengakuisisi terhadap invasi DNA asing melalui RNA-dipandu pembelahan DNA [99]. Dalam
Tipe II sistem CRISPR / Cas, segmen pendek DNA asing, disebut “spacer” diintegrasikan dalam CRISPR genom lokus
dan ditranskripsi dan diolah menjadi pendek CRISPR RNA (crRNAs). crRNAs ini anil untuk trans-mengaktifkan crRNAs
(tracrRNAs) dan langsung pembelahan urutan spesifik dan membungkam DNA patogen oleh protein Cas. Karya
terbaru telah menunjukkan bahwa sasaran pengakuan oleh protein Cas9 membutuhkan “benih” urutan dalam crRNA
NIH-PA Author Manuscript

dan dinukleotida mengandung protospacer berdekatan motif (PAM) urut hulu lestari dari crRNA- wilayah [100]
mengikat. The CRISPR / sistem Cas sehingga dapat kembali ditargetkan untuk membelah hampir semua urutan DNA
oleh re-merancang crRNA. Secara signifikan, CRISPR / sistem Cas telah terbukti secara langsung portabel untuk sel
manusia dengan co-pengiriman plasmid mengungkapkan endonuklease Cas9 dan komponen crRNA diperlukan
[101-104]. Ini diprogram RNA-dipandu endonuklease DNA telah menunjukkan kemampuan multiplexing gangguan gen
[103] dan integrasi ditargetkan pada sel-sel iPS [104]. Cas9 endonuklease juga telah diubah menjadi nickases [103],
memungkinkan tingkat tambahan kontrol atas mekanisme perbaikan DNA. Selain sel manusia, CRISPR /
Cas-dimediasi editing genom telah berhasil dibuktikan dalam ikan zebra [105] dan sel-sel bakteri [106]; Namun,
penelitian yang lebih lengkap diperlukan untuk benar-benar mengevaluasi utilitas dari sistem ini, termasuk potensi
off-sasaran efek. Secara khusus, masih belum jelas apakah sistem CRISPR / Cas memberi pengakuan selektivitas
yang diperlukan yang diperlukan untuk memastikan satu tempat kekhususan dalam genom kompleks.

Arah masa depan

NIH-PA Author Manuscript

ZFNs, Talens dan RNA-dipandu endonuklease DNA adalah alat transformatif yang memiliki potensi untuk merevolusi
penelitian dan dampak pribadi obat biologis. Memang, teknologi ini muncul telah secara dramatis memperluas
kemampuan untuk memanipulasi dan organisme model pembelajaran, dan mendukung janji mengoreksi penyebab
genetik di balik banyak penyakit. Namun, untuk mencapai potensi penuh dari teknologi ini, banyak pertanyaan penting
dan tantangan yang harus diatasi (Kotak 3). Kepala di antara ini adalah kekhususan relatif setiap platform nuklease. Di
masa depan, penggunaan high-throughput metode yang memungkinkan profiling komprehensif situs belahan dada
off-sasaran [107] harus memberikan wawasan ketatnya pengenalan target yang melekat dalam setiap sistem.
Pertanyaan juga tetap mengenai metode yang optimal untuk memberikan nucleases ini ke dalam sel dan organisme.
Secara khusus, sementara vektor adenoviral dapat menampung dan memberikan full-length talen gen ke dalam sel
manusia, lentiviral plasmid vektor menyimpan urutan talen rentan terhadap penyusunan ulang setelah transduksi [108].
Selain itu, ukuran besar Talens dapat membatasi

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 7

pengiriman mereka dengan vektor ukuran-terbatas seperti rekombinan virus adeno-associated (AAV), yang telah terbukti untuk
mengakomodasi gen ZFN [109]. Temuan ini menunjukkan bahwa pengembangan sistem pengiriman talen baru akan menjadi
area kritis penelitian masa depan. Dan sementara sistem CRISPR / Cas menunjukkan janji besar dan fleksibilitas untuk
NIH-PA Author Manuscript

rekayasa genetika, urutan persyaratan dalam urutan PAM dapat membatasi beberapa aplikasi. evolusi diarahkan protein Cas9
harus menawarkan jalan menuju PAM-kemerdekaan, dan mungkin juga menyediakan sarana untuk menghasilkan Cas9
endonuklease bahkan lebih efisien. studi tambahan juga akan diminta untuk mengevaluasi kekhususan dan toksisitas
endonuklease DNA RNA yang dipandu in vitro dan in vivo. Akhirnya, terus berkembangnya metode bersyarat yang
mengandalkan recombinases disesuaikan [110-112] dan faktor transkripsi [6, 17, 113-116] untuk mempengaruhi struktur
genom dan fungsi akan melengkapi teknologi yang sudah ada dan nuklease masa depan. Bersama-sama, teknologi ini
menjanjikan untuk memperluas kemampuan kita untuk mengeksplorasi dan mengubah genom apapun dan merupakan
paradigma baru dan menjanjikan untuk memahami dan mengobati penyakit.

Ucapan Terima Kasih

Para penulis didukung oleh National Institutes of Health (Pioneer Penghargaan DP1CA174426 (CB) dan DP2OD008586 (CG) dan National
Science Foundation (CBET-1.151.035). TG didukung oleh National Institute Umum Ilmu Kedokteran persekutuan (T32GM080209). Kami meminta
maaf kepada mereka peneliti yang kontribusinya penting mungkin telah dihilangkan karena keterbatasan ruang.
NIH-PA Author Manuscript

GLOSARIUM

ZFNs nucleases seng-jari adalah fusi dari non-spesifik domain DNA belahan dada dari Fok Aku
endonuklease restriksi dengan protein seng-jari. ZFN dimer menginduksi ditargetkan DNA
untai ganda istirahat (DSBs) yang merangsang jalur respon kerusakan DNA. Kekhususan
mengikat domain seng-jari dirancang mengarahkan ZFN ke situs genom tertentu.

Talens Transkripsi aktivator seperti efektor (KISAH) nucleases adalah fusi dari
Fok Aku domain belahan dada dan domain DNA-mengikat yang berasal dari protein TALE. Tales berisi
beberapa domain 33-35 ulangi amino acid bahwa setiap mengakui pasangan basa tunggal. Seperti
ZFNs, Talens menginduksi DSBs yang mengaktifkan jalur respon kerusakan DNA dan memungkinkan
perubahan kustom yang ditargetkan.

CRISPR / Cas Clustered Regulatory interspaced pendek palindromic Mengulang atau CRISPR adalah lokus yang
(CRISPR berisi beberapa mengulangi langsung pendek, dan menyediakan diperoleh kekebalan terhadap
terkait) sistem bakteri dan archaea. sistem CRISPR mengandalkan crRNA dan tracrRNA untuk membungkam urutan
NIH-PA Author Manuscript

spesifik menyerang DNA asing. Tiga jenis sistem CRISPR / Cas ada: Pada tipe sistem II, Cas9
berfungsi sebagai endonuklease DNA RNA-dipandu yang memotong DNA pada crRNA-tracrRNA
sasaran pengakuan.

DSB Produk dari ZFN, talen dan CRISPR tindakan / Cas9, untai ganda istirahat adalah bentuk
kerusakan DNA yang terjadi ketika kedua untai DNA yang dibelah

NHEJ Non-homolog end bergabung adalah DSB perbaikan jalur yang ligates atau bergabung dua ujung
rusak bersama-sama. NHEJ tidak menggunakan template homolog untuk perbaikan dan dengan
demikian biasanya mengarah ke pengenalan insersi kecil dan penghapusan di lokasi istirahat,
sering mendorong frameshifts yang KO fungsi gen.

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 8

HDR perbaikan homologi-diarahkan adalah jalur template yang tergantung untuk perbaikan DSB. Dengan
menyediakan template donor homolog yang mengandung bersama dengan nuklease spesifik lokasi,
NIH-PA Author Manuscript

HDR setia menyisipkan molekul donor pada lokus yang ditargetkan. Pendekatan ini memungkinkan
penyisipan transgen tunggal atau ganda, serta substitusi nukleotida tunggal.

RNAi Interferensi RNA adalah proses dimana molekul RNA menghambat atau ekspresi gen
knockdown. Lebih luas, RNAi merupakan mekanisme alami yang terjadi sebagai respons
terhadap pengenalan berbagai jenis molekul RNA ke dalam sel.

ZFNickases nickases seng-jari yang ZFNs yang mengandung menonaktifkan mutasi pada salah satu dari dua Fok Aku
belahan dada domain. ZFNickases membuat hanya satu untai DNA istirahat dan menginduksi HDR
tanpa mengaktifkan mutagenik NHEJ jalur.

PAM Proto-spacer motif yang berdekatan adalah motif nukleotida pendek yang terjadi pada crRNA dan
secara khusus diakui dan dibutuhkan oleh Cas9 untuk pembelahan DNA.

crRNA CRISPR RNA dasar pasangan dengan tracrRNA untuk membentuk struktur dua-RNA yang panduan Cas9
endonuklease ke situs DNA komplementer untuk belahan dada.
NIH-PA Author Manuscript

tracrRNA trans-mengaktifkan RNA chimeric yang non-coding RNA yang mempromosikan pengolahan crRNA dan
diperlukan untuk mengaktifkan pembelahan RNA-dipandu oleh Cas9.

REFERENSI
1. Capecchi MR. Penargetan gen pada tikus: analisis fungsional dari genom mamalia untuk abad kedua puluh satu.
Nat. Rev. Genet. 2005; 6: 507-512. [PubMed: 15931173]
2. McManus MT, Sharp PA. Gen membungkam pada mamalia oleh RNA campur kecil. Nat. Rev. Genet. 2002; 3: 737-747.
[PubMed: 12360232]

3. Urnov FD, et al. Genom mengedit dengan rekayasa nucleases zinc finger. Nat. Rev. Genet. 2010; 11: 636-646. [PubMed:
20717154]

4. rekayasa Carroll D. Genome dengan nucleases seng-jari. Genetika. 2011; 188: 773-782. [PubMed: 21828278]

5. Wyman C, Kanaar R. DNA untai ganda istirahat perbaikan: semuanya baik-baik yang berakhir dengan baik. Annu. Rev. Genet. 2006; 40: 363-383.

[PubMed: 16895466]

6. Beerli RR, Barbas CF-3. Teknik polydactyl faktor seng-jari transkripsi. Nat. Biotechnol. 2002; 20: 135-141.
[PubMed: 11821858]
NIH-PA Author Manuscript

7. Liu Q, et al. Desain dari polydactyl protein seng-jari untuk mengatasi unik dalam genom kompleks. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1997; 94: 5525-5530. [PubMed: 9159105]
8. Beerli RR, et al. Menuju mengendalikan ekspresi gen di akan: regulasi khusus dari ErbB-2 / HER-2 promotor dengan
menggunakan protein jari polydactyl seng dibangun dari blok bangunan modular. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95:
14.628-14.633. [PubMed: 9843940]

9. Beerli RR, et al. regulasi positif dan negatif dari gen endogen oleh faktor transkripsi dirancang. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 2000; 97: 1495-1500. [PubMed: 10660690]
10. Kim JS, Pabo CO Mendapatkan pegangan pada DNA. Desain protein jari poli-seng dengan konstanta disosiasi
femtomolar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95: 2812-2817. [PubMed: 9501172]

11. Segal DJ, et al. Struktur Aart, yang dirancang enam jari jari seng peptida, terikat untuk DNA. J. Mol. Biol. 2006; 363:
405-421. [PubMed: 16963084]

12. Neuteboom LW, et al. Pengaruh faktor zinc finger transkripsi yang berbeda pada target genom. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 2006; 339: 263-270. [PubMed: 16297870]

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 9

13. Bhakta MS, et al. nucleases seng-jari yang sangat aktif dengan menambah perakitan modular. Genome Res. 2013; 23:
530-538. [PubMed: 23222846]

14. Kim S, et al. array seng-jari preassembled untuk pembangunan cepat ZFNs. Nat. Metode. 2011; 8: 7. [PubMed: 21191366]
NIH-PA Author Manuscript

15. Gonzalez B, et al. sistem modular untuk pembangunan perpustakaan seng-jari dan protein. Nat. Protoc. 2010; 5:
791-810. [PubMed: 20360772]
16. Segal DJ, et al. Menuju mengendalikan ekspresi gen di akan: pemilihan dan desain dari domain zinc finger mengakui
masing-masing dari 5'-GNN-3' DNA target urutan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999; 96: 2758-2763. [PubMed: 10077584]

17. Beerli RR, et al. regulasi positif dan negatif dari gen endogen oleh faktor transkripsi dirancang. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 2000; 97: 1495-1500. [PubMed: 10660690]
18. Maeder ML, et al. Cepat “open-source” rekayasa nucleases seng-jari disesuaikan untuk modifikasi gen yang sangat
efisien. Mol. Sel. 2008; 31: 294-301. [PubMed: 18657511]
19. Sander JD, et al. Seleksi bebas seng-jari-nuklease rekayasa oleh perakitan tergantung pada konteks (Coda). Nat. Metode.
2011; 8: 67-69. [PubMed: 21151135]

20. Gupta A, et al. Dioptimalkan arsip dua jari untuk penargetan gen ZFN-dimediasi. Nat. Metode. 2012; 9: 588-590.
[PubMed: 22543349]
21. Boch J, et al. Melanggar kode DNA mengikat spesifisitas TAL-tipe III efektor. Ilmu. 2009; 326: 1509-1512.
[PubMed: 19933107]
22. Moscou MJ, Bogdanove AJ. Sebuah cipher sederhana mengatur pengakuan DNA oleh efektor TAL. Ilmu. 2009; 326: 1501.
[PubMed: 19933106]
NIH-PA Author Manuscript

23. Mak AN, et al. Struktur kristal TAL efektor PthXo1 terikat dengan target DNA-nya. Ilmu. 2012; 335: 716-719.
[PubMed: 22223736]
24. Deng D, et al. dasar struktural untuk pengakuan urutan spesifik dari DNA oleh efektor TAL. Ilmu. 2012; 335:
720-723. [PubMed: 22223738]
25. Christian M, et al. DNA menargetkan untai ganda istirahat dengan TAL nucleases efektor. Genetika. 2010; 186: 757-761.
[PubMed: 20660643]

26. Mussolino C, et al. KISAH nuklease perancah Novel memungkinkan aktivitas editing genom yang tinggi dalam kombinasi dengan
toksisitas rendah. Asam Nukleat Res. 2011; 39: 9283-9293. [PubMed: 21813459]

27. Miller JC, et al. KISAH nuklease arsitektur untuk mengedit genom efisien. Nat. Biotechnol. 2011; 29: 143-148. [PubMed:
21179091]
28. Zhang F, et al. konstruksi yang efisien dari efektor TAL urutan spesifik untuk modulasi transkripsi mamalia.
Nat. Biotechnol. 2011; 29: 149-153. [PubMed: 21248753]
29. Mercer AC, et al. Chimeric TALE recombinases dengan diprogram urutan DNA spesifisitas. Asam Nukleat Res. 2012;
40: 11.163-11.172. [PubMed: 23019222]
30. Cermak T, et al. desain yang efisien dan perakitan kustom talen dan konstruksi berbasis efektor TAL lainnya untuk penargetan
DNA. Asam Nukleat Res. 2011; 39: E82. [PubMed: 21493687]

31. Reyon D, et al. FLASH perakitan Talens untuk high-throughput genom editing. Nat. Biotechnol. 2012; 30:
460-465. [PubMed: 22484455]
NIH-PA Author Manuscript

32. Briggs AW, et al. Berulang capped perakitan: sintesis yang cepat dan terukur dari DNA berulang-modul seperti TAL efektor
dari monomer individu. Asam Nukleat Res. 2012; 40: e117. [PubMed: 22740649]

33. Schmid-Burgk JL, et al. Sebuah teknik kloning ligasi-independen untuk tinggi-throughput perakitan transkripsi aktivator
seperti gen efektor. Nat. Biotechnol. 2013; 31: 76-81. [PubMed: 23242165]
34. Kim Y, et al. Sebuah perpustakaan TAL nucleases efektor mencakup genom manusia. Nat Biotechnol. 2013; 31: 251-258.
[PubMed: 23417094]

35. Moehle EA, et al. Selain gen yang ditargetkan ke lokasi yang ditentukan dalam genom manusia menggunakan dirancang seng
nucleases jari. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007; 104: 3055-3060. [PubMed: 17360608]

36. Orlando SJ, et al. Zinc-jari nuklease-driven integrasi yang ditargetkan dalam genom mamalia menggunakan donor dengan
terbatas kromosom homologi. Asam Nukleat Res. 2010; 38: E152. [PubMed: 20530528]

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 10

37. Chen F, et al. genom-frekuensi tinggi mengedit menggunakan ssDNA oligonukleotida dengan nucleases seng-jari. Nat.
Metode. 2011; 8: 753-755. [PubMed: 21765410]

38. Santiago Y, et al. Target gen KO dalam sel mamalia dengan menggunakan rekayasa nucleases seng-jari. Proc. Natl.
NIH-PA Author Manuscript

Acad. Sci. USA 2008; 105: 5809-5814. [PubMed: 18359850]

39. Lee HJ, et al. Target penghapusan kromosom pada sel manusia menggunakan nucleases seng jari. Genome Res. 2010; 20: 81-89.
[PubMed: 19952142]

40. Sollu C, et al. Otonom seng-jari pasangan nuklease untuk ditargetkan penghapusan kromosom. Asam Nukleat Res. 2010; 38:
8269-8276. [PubMed: 20716517]

41. Lee HJ, et al. Target duplikasi kromosom dan inversi dalam genom manusia menggunakan nucleases seng jari. Genome
Res. 2012; 22: 539-548. [PubMed: 22183967]
42. Brunet E, et al. translokasi kromosom yang diinduksi pada lokus tertentu dalam sel induk manusia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2009; 106: 10.620-10.625. [PubMed: 19549848]

43. Cristea S, et al. In vivo pembelahan donor transgen mempromosikan nuklease-dimediasi integrasi yang ditargetkan.
Biotechnol. Bioeng. 2013; 110: 871-880. [PubMed: 23042119]

44. Maresca M, et al. Wajib Ligasi-Gated Rekombinasi (ObLiGaRe): Custom-dirancang integrasi ditargetkan
nuklease-dimediasi melalui akhir nonhomolog bergabung. Genome Res. 2013; 23: 539-546. [PubMed: 23152450]

45. Lombardo A, et al. editing gen dalam sel induk manusia menggunakan nucleases jari seng dan integrasedefective pengiriman
vektor lentiviral. Nat. Biotechnol. 2007; 25: 1298-1306. [PubMed: 17965707]

46. ​Hockemeyer D, et al. penargetan efisien gen diekspresikan dan diam di ESCs manusia dan iPSCs menggunakan nucleases
seng-jari. Nat. Biotechnol. 2009; 27: 851-857. [PubMed: 19680244]
NIH-PA Author Manuscript

47. Hockemeyer D, et al. Rekayasa genetika sel pluripotent manusia menggunakan nucleases TALE. Nat. Biotechnol. 2011; 29:
731-734. [PubMed: 21738127]

48. Ding Q, et al. Sebuah Talen Genome-Editing Sistem Pembangkit Manusia Stem Model Sel-Based Disease. Cell Stem Cell.
2013; 12: 238-251. [PubMed: 23246482]
49. Zou J, et al. Penargetan gen dari gen penyakit terkait pada manusia yang disebabkan induk berpotensi majemuk dan sel-sel induk
embrionik. Cell Stem Cell. 2009; 5: 97-110. [PubMed: 19540188]

50. Sanyal A, et al. Interaksi lanskap jarak jauh dari promotor gen. Alam. 2012; 489: 109-
113. [PubMed: 22.955.621]

51. Gutschner T, et al. Noncoding RNA gen melalui integrasi genom dari elemen destabilisasi RNA menggunakan
nucleases seng jari. Genome Res. 2011; 21: 1944-1954. [PubMed: 21844124]

52. Dunham saya, et al. Sebuah ensiklopedia terpadu dari unsur-unsur DNA dalam genom manusia. Alam. 2012; 489: 57-74.
[PubMed: 22955616]

53. Miller JC, et al. Ditingkatkan seng-jari arsitektur nuklease untuk mengedit genom yang sangat spesifik. Nat. Biotechnol. 2007;
25: 778-785. [PubMed: 17603475]

54. Szczepek M, et al. redesign berdasarkan struktur-antarmuka dimerisasi mengurangi toksisitas nucleases seng-jari.
Nat. Biotechnol. 2007; 25: 786-793. [PubMed: 17603476]
55. Doyon Y, et al. Meningkatkan aktivitas seng-jari-nuklease dengan meningkatkan arsitektur heterodimeric obligat. Nat.
NIH-PA Author Manuscript

Metode. 2011; 8: 74-79. [PubMed: 21131970]

56. Guo J, et al. evolusi diarahkan dari FokI belahan dada domain ditingkatkan dan sangat efisien untuk nucleases zinc finger. J.
Mol. Biol. 2010; 400: 96-107. [PubMed: 20447404]

57. Sood R, et al. Metode efisien untuk Target Mutagenesis di ikan zebra Menggunakan Zinc-Finger nucleases: Data dari Target
dari Sembilan Gen Menggunakan CompoZr atau Coda ZFNs. PLoS ONE. 2013; 8: e57239. [PubMed: 23451191]

58. Perez-Pinera P, et al. Penargetan gen ke ROSA26 lokus disutradarai oleh rekayasa nucleases zinc finger. Asam
Nukleat Res. 2012; 40: 3741-3752. [PubMed: 22169954]

59. Doyon Y, et al. Transient kejutan dingin Meningkatkan seng-jari nuklease-dimediasi gangguan gen. Nat. Metode. 2010; 7:
459-460. [PubMed: 20436476]

60. Certo MT, et al. Coupling endonuklease dengan enzim akhir-pengolahan DNA untuk mendorong gangguan gen. Nat.
Metode. 2012; 9: 973-975. [PubMed: 22941364]

61. Kim H, et al. wartawan pengganti untuk pengayaan sel dengan mutasi nuklease-diinduksi. Nat. Metode. 2011; 8:
941-943. [PubMed: 21983922]

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 11

62. Kim E, et al. Presisi genom teknik dengan enzim DNA-nicking diprogram. Genome Res. 2012; 22: 1327-1333.
[PubMed: 22522391]
63. Wang J, et al. Selain gen yang ditargetkan ke situs yang telah ditentukan dalam genom manusia menggunakan ZFNbased nicking
NIH-PA Author Manuscript

enzim. Genome Res. 2012; 22: 1316-1326. [PubMed: 22434427]

64. Ramirez CL, et al. Direkayasa nickases zinc finger menginduksi perbaikan homologi-diarahkan dengan mengurangi efek mutagenik.
Asam Nukleat Res. 2012; 40: 5560-5568. [PubMed: 22373919]

65. McConnell Smith A, et al. Generasi enzim nicking bahwa konversi gen merangsang spesifik lokasi dari I-anıı
LAGLIDADG homing endonuklease tersebut. Proc. Natl. Acad. Sci. A. AS 2009; 106: 5099-5104. [PubMed:
19276110]
66. Gaj T, et al. Target gen KO oleh pengiriman langsung dari protein nuklease seng-jari. Nat. Metode. 2012; 9:
805-807. [PubMed: 22751204]
67. Doyon Y, et al. Diwariskan ditargetkan gangguan gen ikan zebra menggunakan dirancang nucleases seng-jari. Nat.
Biotechnol. 2008; 26: 702-708. [PubMed: 18500334]

68. Sander JD, et al. gangguan gen yang ditargetkan pada sel somatik ikan zebra menggunakan Talens direkayasa. Nat. Biotechnol.
2011; 29: 697-698. [PubMed: 21822241]

69. Meng X, et al. Target inaktivasi gen dalam ikan zebra menggunakan rekayasa nucleases seng-jari. Nat Biotechnol. 2008; 26:
695-701. [PubMed: 18500337]

70. Tesson L, et al. tikus KO dihasilkan oleh embrio injeksi dari Talens. Nat. Biotechnol. 2011; 29: 695-696.
[PubMed: 21822240]
71. Geurts AM, et al. tikus Knockout melalui embrio injeksi dari nucleases seng-jari. Ilmu. 2009; 325: 433.
[PubMed: 19628861]
NIH-PA Author Manuscript

72. Bibikova M, et al. Meningkatkan penargetan gen dengan dirancang nucleases zinc finger. Ilmu. 2003; 300: 764. [PubMed:
12730594]

73. Bibikova M, et al. Target pembelahan kromosom dan mutagenesis di Drosophila menggunakan nucleases zincfinger.
Genetika. 2002; 161: 1169-1175. [PubMed: 12136019]

74. Morton J, et al. Induksi dan perbaikan seng-jari nuklease bertarget istirahat untai ganda dalam sel somatik
Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006; 103: 16.370-16.375. [PubMed: 17060623]

75. Merlin C, et al. Efisien mutagenesis ditargetkan dalam kupu-kupu raja menggunakan nucleases seng-jari. Genome Res. 2013; 23:
159-168. [PubMed: 23009861]

76. Muda JJ, et al. Efisien ditargetkan gangguan gen dalam soma dan kuman garis katak Xenopus tropicalis menggunakan
rekayasa nucleases seng-jari. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011; 108: 7052-
7057. [PubMed: 21.471.457]

77. Carlson DF, et al. Efisien gen Talen-dimediasi KO pada ternak. Proc. Natl. Acad. Sci. U.
SA 2012; 109: 17.382-17.387. [PubMed: 23027955]
78. Hauschild J, et al. generasi efisien KO bersifat bialel pada babi menggunakan nucleases seng-jari. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 2011; 108: 12.013-12.017. [PubMed: 21730124]
79. Kayu AJ, et al. Target genom mengedit seluruh spesies menggunakan ZFNs dan Talens. Ilmu. 2011; 333: 307. [PubMed:
21700836]
NIH-PA Author Manuscript

80. Bedell VM, et al. In vivo genom editing menggunakan efisiensi tinggi sistem talen. Alam. 2012; 491: 114-118. [PubMed:
23000899]
81. Zu Y, et al. Talen-dimediasi modifikasi genom yang tepat oleh rekombinasi homolog di ikan zebra. Metode Nat.
2013; 10: 329-331. [PubMed: 23435258]
82. Zhang F, et al. frekuensi tinggi yang ditargetkan mutagenesis di Arabidopsis thaliana menggunakan nucleases seng jari. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 2010; 107: 12.028-12.033. [PubMed: 20508152]

83. Shukla VK, et al. modifikasi genom tepat dalam spesies tanaman Zea mays menggunakan nucleases seng-jari. Alam.
2009; 459: 437-441. [PubMed: 19404259]

84. Townsend JA, et al. modifikasi-tingginya frekuensi gen tanaman menggunakan rekayasa nucleases seng-jari. Alam.
2009; 459: 442-445. [PubMed: 19404258]

85. Li T, et al. editing gen berbasis talen efisiensi tinggi menghasilkan padi tahan penyakit. Nat. Biotechnol. 2012; 30:
390-392. [PubMed: 22565958]
86. Urnov FD, et al. Koreksi gen manusia endogen yang sangat efisien menggunakan dirancang nucleases seng-jari. Alam.
2005; 435: 646-651. [PubMed: 15806097]

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 12

87. Li H, et al. In vivo genom editing mengembalikan hemostasis pada model tikus hemofilia. Alam. 2011; 475: 217-221.
[PubMed: 21706032]
88. Zou J, et al. koreksi gen spesifik lokasi dari mutasi titik dalam sel iPS manusia berasal dari pasien dewasa dengan
NIH-PA Author Manuscript

penyakit sel sabit. Darah. 2011; 118: 4599-4608. [PubMed: 21881051]

89. Sebastiano V, et al. In situ koreksi genetik dari sabit mutasi anemia sel pada sel pluripotent stem disebabkan manusia
menggunakan rekayasa seng nucleases jari. Stem Cells. 2011; 29: 1717-1726. [PubMed: 21898685]

90. Yusa K, et al. Target koreksi gen kekurangan alpha1-antitrypsin di sel ips. Alam. 2011; 478: 391-394.
[PubMed: 21993621]
91. Soldner F, et al. Generasi sel pluripotent stem isogenic berbeda secara eksklusif di dua onset dini mutasi titik
Parkinson. Sel. 2011; 146: 318-331. [PubMed: 21757228]
92. Perez EE, et al. Pembentukan HIV-1 tahan dalam sel CD4 + T oleh genom mengedit menggunakan nucleases zincfinger. Nat.
Biotechnol. 2008; 26: 808-816. [PubMed: 18587387]

93. Holt N, et al. Manusia sel induk / progenitor hematopoietik dimodifikasi oleh nucleases seng-jari ditargetkan untuk CCR5
kontrol HIV-1 in vivo. Nat. Biotechnol. 2010; 28: 839-847. [PubMed: 20601939]

94. Voit RA, et al. Generasi dari Line-sel T Tahan HIV dengan Target “Penumpukan” Faktor Pembatasan. Mol Ther. 2013;
21: 786-795. [PubMed: 23358186]
95. Torikai H, et al. Sebuah yayasan untuk imunoterapi berbasis T-sel yang universal: sel T direkayasa untuk mengekspresikan
CD19-spesifik chimeric-antigen-reseptor dan menghilangkan ekspresi TCR endogen. Darah. 2012; 119: 5697-5705. [PubMed:
22535661]
NIH-PA Author Manuscript

96. Provasi E, et al. spesifisitas sel editing T terhadap leukemia oleh nucleases jari seng dan transfer gen lentiviral. Nat. Med.
2012; 18: 807-815. [PubMed: 22466705]
97. DeKelver RC, et al. genomik fungsional, proteomik, dan analisis DNA regulasi dalam pengaturan isogenic menggunakan zinc finger
nuklease-didorong transgenesis ke pelabuhan lokus yang aman dalam genom manusia. Genome Res. 2010; 20: 1133-1142.
[PubMed: 20508142]

98. Lombardo A, et al. Spesifik lokasi integrasi dan menjahit desain kaset untuk transfer gen berkelanjutan. Nat. Metode.
2011; 8: 861-869. [PubMed: 21857672]
99. Wiedenheft B, et al. RNA-dipandu sistem pembungkaman genetik pada bakteri dan archaea. Alam. 2012; 482: 331-338. [PubMed:
22337052]

100. Jinek M, et al. Sebuah programmable dual-RNA-dipandu DNA endonuklease dalam kekebalan bakteri adaptif. Ilmu.
2012; 337: 816-821. [PubMed: 22745249]

101. Jinek M, et al. RNA-diprogram genom mengedit di sel manusia. eHidup. 2013; 2: e00471. [PubMed: 23386978]

102. Cho SW, et al. Target rekayasa genom pada sel manusia dengan endonuklease Cas9 RNA-dipandu. Nat
Biotechnol. 2013; 31: 230-232. [PubMed: 23360966]
103. Cong L, et al. Multiplex rekayasa genom menggunakan CRISPR / sistem Cas. Ilmu. 2013; 339: 819-823.
[PubMed: 23287718]

104. Mali P, et al. RNA-dipandu rekayasa genom manusia melalui Cas9. Ilmu. 2013; 339: 823-826. [PubMed: 23287722]
NIH-PA Author Manuscript

105. Hwang WY, et al. genom efisien editing dalam ikan zebra menggunakan sistem CRISPR-Cas. Nat Biotechnol. 2013; 31:
227-229. [PubMed: 23360964]

106. Jiang W, et al. RNA-dipandu mengedit genom bakteri menggunakan sistem CRISPR-Cas. Nat Biotechnol. 2013; 31:
233-239. [PubMed: 23360965]

107. Gabriel R, et al. Analisis genome-wide berisi seng-jari nuklease spesifisitas. Nat. Biotechnol. 2011; 29:
816-823. [PubMed: 21822255]
108. Holkers M, et al. integritas diferensial dari TALE nuklease gen berikut transfer gen vektor adenoviral dan lentiviral ke
dalam sel manusia. Asam Nukleat Res. 2013; 41: e63. [PubMed: 23275534]

109. Ellis BL, et al. Zinc-jari nuklease-dimediasi koreksi gen menggunakan satu vektor AAV transduksi dan peningkatan oleh
obat-obatan Food and Drug Administration-disetujui. Gen Ther. 2013; 20: 35-42. [PubMed: 22257934]

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 13

110. Gaj T, et al. Sebuah pendekatan yang komprehensif untuk kustomisasi seng-jari rekombinase memungkinkan penargetan genom
pada sel manusia. Asam Nukleat Res. 2013; 41: 3937-3946. [PubMed: 23393187]
NIH-PA Author Manuscript

111. Gersbach CA, et al. integrasi plasmid ditargetkan ke dalam genom manusia oleh zincfinger rekombinase direkayasa.
Asam Nukleat Res. 2011; 39: 7868-7878. [PubMed: 21653554]
112. Gaj T, et al. Struktur-dipandu pemrograman ulang dari serin rekombinase urutan DNA spesifisitas. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 2011; 108: 498-503. [PubMed: 21187418]
113. Beerli RR, et al. Kimia diatur seng faktor jari transkripsi. J. Biol. Chem. 2000; 275: 32.617-32.627.
[PubMed: 10924515]
114. Polstein LR, Gersbach CA. kontrol spatiotemporal Light-diinduksi aktivasi gen oleh disesuaikan seng faktor
jari transkripsi. Selai. Chem. Soc. 2012; 134: 16.480-16.483. [PubMed: 22963237]

115. Perez-Pinera P, et al. Sinergis dan merdu aktivasi gen manusia dengan kombinasi dari faktor-faktor transkripsi sintetis.
Metode Nat. 2013; 10: 239-242. [PubMed: 23377379]
116. Maeder ML, et al. Kuat, regulasi sinergis ekspresi gen manusia menggunakan TALE aktivator. Metode Nat.
2013; 10: 243-245. [PubMed: 23396285]
117. Yant SR, et al. integrasi transposon situs-diarahkan pada sel manusia. Asam Nukleat Res. 2007; 35: E50. [PubMed:
17344320]

118. Gersbach CA, et al. evolusi diarahkan kekhususan rekombinase oleh gen perpecahan reassembly. Asam Nukleat Res.
2010; 38: 4198-4206. [PubMed: 20194120]

119. Owens JB, et al. Chimeric piggyBac transposases untuk penargetan genom pada sel manusia. Asam Nukleat Res. 2012; 40:
NIH-PA Author Manuscript

6978-6991. [PubMed: 22492708]

120. Handel EM, et al. Serbaguna dan mengedit genom efisien dalam sel manusia dengan menggabungkan nucleases seng-jari dengan vektor
virus adeno-terkait. Bersenandung. Gen Ther. 2012; 23: 321-329. [PubMed: 21980922]
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 14

Box 1

Di luar nucleases: Recombinases, transposases, dan faktor transkripsi

NIH-PA Author Manuscript

Spesifik lokasi nucleases saat ini yang paling baik ditandai, banyak digunakan dan diterapkan secara luas alat
untuk menginduksi modifikasi kustom dalam sel dan organisme model yang. Namun, beberapa keterbatasan
nucleases ditargetkan mengemudi pengembangan jenis alternatif enzim diprogram untuk rekayasa genom.
Misalnya, efek offtarget diciptakan oleh nucleases spesifik lokasi dapat menjadi racun bagi sel-sel, dan sulit
untuk secara komprehensif memprediksi dan memantau. Selain itu, karena nucleases ditargetkan
mengandalkan non-homolog end bergabung (NHEJ) dan homologi-diarahkan perbaikan (HDR) untuk
menginduksi perubahan genetik, teknologi ini mungkin dibatasi oleh ketersediaan mekanisme perbaikan yang
diinginkan DNA dalam jenis sel tertentu. Untuk mengatasi masalah ini, protein seng-jari dan cerita telah
menyatu ke domain enzimatik, termasuk situs-spesifik recombinases [29, 110-112] dan transposases [117],
bahwa integrasi DNA mengkatalisis, eksisi, dan inversi. Karena enzim ini melakukan pembelahan DNA dan
re-ligasi mandiri, DNA berpotensi beracun untai ganda istirahat tidak harus menumpuk dalam genom. efek
Selain itu, untuk aplikasi yang membutuhkan penambahan gen yang ditargetkan, rekombinase dan aktivitas
transposase ditandai dengan penyisipan DNA donor ke dalam genom, sehingga memungkinkan off-target yang
akan dipantau langsung. Selain itu, mekanisme rekombinasi dan transposisi independen dari jalur perbaikan
DNA sel. Akibatnya, pendekatan ini harus fungsional di hampir semua jenis sel dan tahap siklus sel. Efisiensi
proses ini juga dapat ditingkatkan dengan evolusi diarahkan [118]. Namun, agar recombinases dan
transposases untuk mencapai tingkat utilitas umum yang diberikan oleh nucleases spesifik lokasi, perbaikan
NIH-PA Author Manuscript

yang signifikan dalam kinerja dan fleksibilitas mereka dibutuhkan. Secara khusus, rekombinase domain katalitik
mempertahankan urutan spesifisitas dari enzim orangtua, dan memerlukan signifikan re-engineering terhadap
target DNA userdefined [110, 112]. Sementara fusi transposase menunjukkan aktivitas tinggi pada target
genom mereka dimaksudkan, protein-protein chimeric juga menderita aktivitas offtarget signifikan [119].
Akhirnya, sintetis seng-jari dan faktor transkripsi TALE menawarkan sebuah pendekatan alternatif untuk
menginduksi modifikasi yang ditargetkan dengan menyediakan kontrol ketat atas ekspresi gen [6, 8, 17, 27, 28,
115, 116]. Secara kolektif,
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 15

kotak 2

Metode untuk memberikan nucleases spesifik ke dalam sel

NIH-PA Author Manuscript

Meskipun nucleases spesifik menyediakan sarana untuk memperkenalkan perubahan kustom beragam di lokasi genom
tertentu, teknologi ini masih dibatasi oleh metode untuk memberikan enzim ini menjadi jenis sel yang relevan. Biasanya,
gen nuklease-dikodekan disampaikan ke dalam sel oleh DNA plasmid, vektor virus, atau in vitro ditranskripsi mRNA.
Metode pengiriman dapat disesuaikan untuk beberapa derajat ke arah aplikasi atau sel jenis bunga; Namun, kekurangan
dari sistem pengiriman gen kontemporer virus dan non-virus membatasi kemungkinan aplikasi nucleases spesifik lokasi.
Secara khusus, transfeksi dari plasmid DNA atau mRNA oleh elektroporasi atau reagen berbasis lipid kationik dapat
menjadi racun dan dibatasi untuk jenis sel tertentu. vektor virus juga keterbatasan ini, karena mereka adalah kompleks,
menghasilkan sulit-untuk-, berpotensi imunogenik, dan melibatkan hambatan regulasi tambahan. Meskipun
kesulitan-kesulitan ini, uji klinis berdasarkan ZFN pengiriman gen adenoviral-dimediasi ke limfosit T sedang berlangsung
[92] Namun, usaha masa depan akan sangat bermanfaat metode penyampaian ditingkatkan. Integrase-kekurangan
vektor lentiviral (IDLVs) adalah alternatif yang menarik untuk memberikan ZFNs menjadi jenis sel transfeksi-tahan [45];
Namun, metode ini tidak muncul untuk menjadi kompatibel dengan urutan talen yang sangat berulang-ulang [108].
Meskipun kemudahan jelas dengan yang Talens bisa direkayasa, enzim ini mungkin terbukti lebih sulit untuk
menyampaikan ke dalam sel dari ZFNs. Adeno-terkait virus (AAV) adalah vektor yang menjanjikan untuk pengiriman ZFN
yang telah digunakan untuk meningkatkan efisiensi ZFN-dimediasi HDR [109, 120] dan drive ZFN-dimediasi koreksi gen in
vivo [ 87]. kemasan efisien AAV terjadi hanya untuk kaset ekspresi kurang dari 4,2-kb panjang. Sementara ini cukup untuk
mengakomodasi kedua monomer ZFN dan membangun donor rekayasa, hanya monomer talen tunggal dengan urutan
NIH-PA Author Manuscript

promotor minimal dapat dimasukkan ke dalam vektor ini. Sebagai alternatif untuk sistem gen-pengiriman ZFN, kelompok
kami baru-baru ini melaporkan bahwa dimurnikan ZFN protein mampu melintasi membran sel dan menginduksi
gangguan gen endogen [66]. Pendekatan ini memiliki beberapa keunggulan dibandingkan metode penyampaian
berdasarkan gen-. Pertama, pendekatan ini mengurangi off-target yang aktivitas dengan membatasi waktu bahwa sel-sel
yang terkena ZFNs dan sehingga meminimalkan peluang untuk off-sasaran kegiatan. Kedua, metode ini circumvents
sel-jenis ketergantungan dan toksisitas sistem pengiriman gen virus dan non-virus. Ketiga, pendekatan ini mengatasi
beberapa keselamatan dan hambatan regulasi untuk mengembangkan terapi berbasis ZFN dengan membiarkan sistem
gugur gen manusia tanpa mengekspos sel untuk setiap materi genetik. Masih belum diketahui apakah dimurnikan protein
talen juga dapat diperkenalkan ke dalam sel dengan cara yang sama.
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 16

kotak 3

pertanyaan yang luar biasa

NIH-PA Author Manuscript

• Seberapa efektif ZFNs dan Talens sebagai agen terapi?

• Apa metode terbaik untuk memberikan nucleases spesifik lokasi ke dalam sel, dan bagaimana dapat
Talens diserahkan ke sel oleh lentivirus?

• Dapatkah Cas9 endonuklease akan dikooptasi sebagai domain DNA-mengikat dan menyatu ke domain
enzimatik?

• Bagaimana spesifik dan aman adalah sistem CRISPR / Cas9, dan bagaimana efisiensi genom
Cas9-dimediasi editing dibandingkan dengan pendekatan berbasis talen ZFN dan?

• Apa RNA perancah yang optimal untuk aplikasi CRISPR / Cas9 dalam sel
mamalia?
NIH-PA Author Manuscript
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 17

HIGHLIGHT

➢ ZFNs, Talens dan CRISPR / berbasis Cas RNA-dipandu endonuklease DNA

NIH-PA Author Manuscript

yang diprogram nucleases spesifik lokasi.

➢ nucleases spesifik lokasi menginduksi DNA untai ganda istirahat yang merangsang non
end homolog bergabung dan perbaikan di ditargetkan lokus genomik.

➢ Kami membahas potensi terapi teknologi nuklease spesifik lokasi

dan membahas prospek masa depan untuk lapangan.
NIH-PA Author Manuscript
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 18
NIH-PA Author Manuscript

Gambar 1. Struktur seng-jari dan transkripsi aktivator seperti efektor (a) (Top) Dirancang protein seng-jari di
kompleks dengan DNA target (abu-abu) (PDB ID: 2I13). Setiap seng-jari terdiri dari sekitar 30 asam amino dalam ββα
pengaturan ( sisipan).
NIH-PA Author Manuscript

residu permukaan (-1, 2, 3 dan 6) yang DNA kontak ditampilkan sebagai tongkat. Setiap seng-jari kontak domain 3-4
pasang basa (bps) dalam alur utama DNA. Rantai samping dari Cys dilestarikan dan residu Nya digambarkan sebagai
tongkat di kompleks dengan Zn 2+ ion (ungu).
(B) Kartun dari nuklease zinc-finger (ZFN) dimer terikat DNA. situs Target ZFN terdiri dari situs yang mengikat dua
seng-jari dipisahkan dengan urutan spacer 5 sampai 7-bp diakui oleh
Fok Aku belahan dada domain. protein seng-jari dapat dirancang untuk mengenali unik “kiri” dan “kanan” setengah-situs. ( c) (Top) KISAH
protein di kompleks dengan DNA target (abu-abu) (PDB ID: 3UGM). Individu TALE mengulangi mengandung 33-35 asam amino
yang mengenali bp tunggal melalui dua residu hypervariable (diresidues repeat-variabel; RVDS) (ditampilkan sebagai tongkat) ( sisipan).
(D)
Kartun dari nuklease TALE (talen) dimer terikat DNA. situs Target Talen terdiri dari dua situs TALE mengikat
dipisahkan dengan urutan spacer dari berbagai panjang (12-20-bp). Tales dapat dirancang untuk mengenali unik
“kiri” dan “kanan” setengah-situs. komposisi RVD ditunjukkan.
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 19
NIH-PA Author Manuscript

Gambar 2. Sekilas mungkin genom mengedit hasil menggunakan nucleases spesifik lokasi
Nuklease-induced DNA untai ganda istirahat (DSBs) dapat diperbaiki dengan perbaikan homologi-diarahkan (HDR) atau
rawan kesalahan non-homolog end bergabung (NHEJ). ( Sebuah) Di hadapan plasmid donor dengan tangan homologi
NIH-PA Author Manuscript

diperpanjang, HDR dapat menyebabkan pengenalan transgen tunggal atau ganda untuk memperbaiki atau mengganti gen
yang sudah ada. ( b) Dengan tidak adanya plasmid donor, NHEJ-dimediasi perbaikan menghasilkan penyisipan atau
penghapusan kecil mutasi pada target bahwa gangguan penyebab gen. Di hadapan oligonukleotida untai ganda atau in vivo linierisasi
plasmid donor, DNA fragmen hingga 14 kb telah dimasukkan melalui ligasi NHEJ-dimediasi. induksi simultan dari dua DSBs
dapat menyebabkan penghapusan, inversi dan translokasi dari segmen intervensi.
NIH-PA Author Manuscript

Tren Biotechnol. Penulis naskah; tersedia di PMC 2014 Juli 1.

 Gaj et al. halaman 20

Tabel 1

daftar singkat dari contoh ZFN, talen dan CRISPR / Cas-dimediasi genom mengedit di sel manusia dan organisme model yang.
NIH-PA Author Manuscript

Jenis
Organisme Gen (s) Nuklease (s) Ref (s)
modifikasi

gangguan gen Manusia CCR5 ZFN [66, 92, 93]

talen [26, 53]

CRISPR / Cas [102]

Manusia TCR (T-cell receptor) ZFN [95, 96]

gol ( Golden), ntl ( No

Zebrafish ZFN [67, 69]
tail), kra

GGTA1 ( α 1, 3-
Pig ZFN [78]
galactosyltransferase)

LDLR ( LDL receptor) TALEN [77]

Bovine ACAN12, p65 TALEN [77]

Human EMX1, PVALB CRISPR/Cas [103]

Rat IgM, Rab38 ZFN [71]

NIH-PA Author Manuscript

Arabidopsis ADH1, TT4 ZFN [82]

C. elegans ben-1, rex-1, sdc-2 ZFN/TALEN [79]

Hamster DHFR ZFN [38]

Drosophila yellow ZFN [73]

Rice OsSWEET14 TALEN [85]

Gene addition Human OCT4, PITX3 ZFN/TALEN [46, 47]

Human CCR5 ZFN [98]

F9 ( Coagulation Factor
Human ZFN [87]
IX)

Mouse Rosa26 ZFN [58]

Human AAVS1 ZFN [46, 97, 98]

TALEN [47]

CRISPR/Cas [104]

Human VEGF-A ZFN [18]

th ( tyrosine
Zebrafish hydroxylase), fam46c TALEN [81]
NIH-PA Author Manuscript

smad5

Maize IPK1 ZFN [83]

Gene correction Human IL2RG ZFN [45, 86]

A1AT ( α 1- antitrypsin) ZFN [90]

HBB ( β- globin) ZFN [88, 89]

SNCA ( α- synuclein) ZFN [91]

SuRA, SurRB
Tobacco ZFN [84]
(acetolactate synthase)

Drosophila yellow ZFN [72]

Trends Biotechnol. Author manuscript; available in PMC 2014 July 01.