Penghambatan = 100 - [(level TNF- dalam uji - level TNF- pada kontrol negatif) / (level TNF- pada

kontrol positif - TNF- level dalam kontrol negatif)] x 100 Penghambatan persentase ekspresi TNF
dalam murine neutofil dan leukosit pleura dihitung menggunakan rumus:% Penghambatan = 100 -
(Tes / Kontrol) x 100

Persiapan sampel OA4-50 disiapkan sebagai suspensi homogen dalam 0,1% gusi akasia. Rolipram
digunakan sebagai senyawa referensi untuk perbandingan dan validasi model uji yang diterapkan.

Percobaan in vitro: estimasi TNF dalam neutrofil Neutrofil dipisahkan dari seluruh darah yang diambil
dari pleksus retro-orbital tikus albino Swiss normal; menambahkan 2,5 μl penghambat transpor
protein, disentrifugasi dan histopak ditambahkan, diinkubasi selama 10 menit dan kemudian
disentrifugasi, ditambahkan larutan pengelompokan pengaktifan sel teraktivasi fluoresensi (FACS).
Setelah pencucian berikutnya dengan PBS, akuisisi dilakukan pada flow cytometry. LPS ditambahkan
ke neutrofil murine yang terisolasi. Sampel obat pada dosis yang berbeda ditambahkan dan diinkubasi
selama 3 jam pada suhu 37 ° C dengan konsentrasi CO2 5%. Setelah inkubasi, solusi permeabilisasi
(10X) ditambahkan. Sampel dicuci dengan PBS dan dipintal pada 900 rpm. Antibodi anti-TNF-
monoklonal ditambahkan dan dianalisis dengan flow cytometer (BD LSR).

Eksperimen in vivo: Estimasi TNF pada leukosit pleura. Studi in vivo dilakukan dengan menggunakan
model Pleurisy untuk menilai efek ekstrak OA4-50 pada parameter inflamasi TNF-. Tikus Wistar yang
memiliki kisaran berat 120 - 180 g dipekerjakan untuk penelitian ini. Obat diberikan secara oral
menggunakan kanula pemberian obat logam pada konsentrasi 5, 10, 20 mg / kg, 1 jam sebelum injeksi
0,5 ml karagenan ke dalam rongga pleura tikus. Setelah 4 jam karaginan, tantangan cairan pleura (50
μl) diambil dalam tabung heparinisasi dan Golgi berhenti ditambahkan. Kemudian dirawat dengan
solusi pengolesan FACS untuk menghilangkan sel darah merah jika ada. Setelah 3 kali mencuci dengan
PBS, ditambahkan 500 μl larutan permeabilisasi dan inkubasi dilakukan selama 15 menit. Kemudian
sampel diinkubasi selama 30 menit setelah penambahan antibodi anti-TNF-monoklonal dan dianalisis
pada flow cytometer (BD-LSR) menggunakan perangkat lunak Cellquest Pro.

Analisis data Data dianalisis menggunakan Excel dan GraphPad Prism 5. Analisis statistik dilakukan
menggunakan One-way ANOVA yang dilengkapi dengan uji Dunnet. P <0,05 dianggap sebagai indikasi
signifikansi. Penghambatan persentase pelepasan TNF- dalam PBMC manusia dihitung menggunakan
rumus:% Penghambatan = 100 - [(level TNF- dalam uji - level TNF- pada kontrol negatif) / (level TNF-
pada kontrol positif - TNF- level dalam kontrol negatif)] x 100 Penghambatan persentase ekspresi TNF
dalam murine neutofil dan leukosit pleura dihitung menggunakan rumus:% Penghambatan = 100 -
(Tes / Kontrol) x 100

penghambat transpor protein, disentrifugasi dan histopak ditambahkan, diinkubasi selama 10 menit
dan kemudian disentrifugasi, ditambahkan larutan pengelompokan pengaktifan sel teraktivasi
fluoresensi (FACS). Setelah pencucian berikutnya dengan PBS, akuisisi dilakukan pada flow cytometry.
LPS ditambahkan ke neutrofil murine yang terisolasi. Sampel obat pada dosis yang berbeda
ditambahkan dan diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 ° C dengan konsentrasi CO2 5%. Setelah
inkubasi, solusi permeabilisasi (10X) ditambahkan. Sampel dicuci dengan PBS dan dipintal pada 900
rpm. Antibodi anti-TNF-monoklonal ditambahkan dan dianalisis dengan flow cytometer (BD LSR).

imunimunan
Eksperimen in vivo: Estimasi TNF pada leukosit pleura. Studi in vivo dilakukan dengan menggunakan
model Pleurisy untuk menilai efek ekstrak OA4-50 pada parameter inflamasi TNF-. Tikus Wistar yang
memiliki kisaran berat 120 - 180 g dipekerjakan untuk penelitian ini. Obat diberikan secara oral
menggunakan kanula pemberian obat logam pada konsentrasi 5, 10, 20 mg / kg, 1 jam sebelum injeksi
0,5 ml karagenan ke dalam rongga pleura tikus. Setelah 4 jam karaginan, tantangan cairan pleura (50
μl) diambil dalam tabung heparinisasi dan Golgi berhenti ditambahkan. Kemudian dirawat dengan
solusi pengolesan FACS untuk menghilangkan sel darah merah jika ada. Setelah 3 kali mencuci dengan
PBS, ditambahkan 500 μl larutan permeabilisasi dan inkubasi dilakukan selama 15 menit. Kemudian
sampel diinkubasi selama 30 menit setelah penambahan antibodi anti-TNF-monoklonal dan dianalisis
pada flow cytometer (BD-LSR) menggunakan perangkat lunak Cellquest Pro.
Analisis data Data dianalisis menggunakan Excel dan GraphPad Prism 5. Analisis statistik dilakukan
menggunakan One-way ANOVA yang dilengkapi dengan uji Dunnet. P <0,05 dianggap sebagai indikasi
signifikansi. Penghambatan persentase pelepasan TNF- dalam PBMC manusia dihitung menggunakan
rumus:%