Laporan Praktikum Bioteknologi Isolasi D
Laporan Praktikum Bioteknologi Isolasi D
I.1 LatarBelakang
I.2 Tujuan
a. Isolasi jaringan
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi
jaringan yang ingin digunakan.
b. Pelisisan dinding dan membran sel
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan
membran sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan
lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan
larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel
harus dilisiskan, karena substansi gen yang
diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan
pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang
tidak mengandung DNA agar sel yang
mengandung inti sel dapat diisolasi atau
dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya
yang tidak berfungsi.
c. Pengekstraksian dalam larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang
dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam
larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat
ekstrak.
d. Purifikasi
Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil
ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut
kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama
10 menit pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan
untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat
dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse
berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA
sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.
e. Presipitasi
Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein histon, sehingga untai-
untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan
berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap
presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan
larutan presipitasi protein dan kemudian divortex
yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan.
Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium
asetat yang jika berikatan dengan protein
mengakibatkan terbentuknya senyawa baru
dengan kelarutan lebih rendah, sehingga
menyebabkan protein mengendap. Larutan
tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5
menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip
utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara
memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi \yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas (Fauziah, 2010).
Bahan
Daun jagung dan kedelai : bahan untuk praktikum
(PVP) polivinil pirolidon : mencegah terjadinya
browning dan kontaminasi fenol
Aquades : sebagai pelarut
Chisam : menghilangkan etanol dan
flafanoid (Chloroform 96 ml dan isoamil alkohol 4
ml)
Buffer ekstraksi : melindungi DNA ketika terjadi
reaksi kimia
Nitrogen cair : untuk merusak dinding sel
mercaptoethanol: mencegah terjadinya browning
dan kontaminasi polisakarida
Dokumentasi Keterangan
Daun jagung dan kedelai
yang akan ditumbuk
bersamaan dengan
nitrogen cair
Nitrogen cair
dimasukkan ke dalam
mortar dan siap
ditumbuk besama
dengan daun jagung dan
kedelai
Hasil tumbukan dari
mortar daun jagung dan
kedelai dipindahkan ke
dalam tube
Prose penghomogenkan
bahan dengan vortex
sampai rata
Pengingkubasian dalam
oven pada suhu 65°C
selama 30’
Mengambil supernatan
dan dipindahakan ke
tube yang baru
4.2 Pembahasan
Pada praktikum yang telah dilakukan, pada
beberapa isolasi bahan yang dipakai dengan daun
tanaman kedelai dan daun tanaman jagung.
Dari isolasi DNA daun tanaman kedelai
menunjukkan bahwa terdapat bintik-bintik putih seperti
jentik yang menyebar dilarutan ternyata hasil benang-
benang DNA terlihat tipis-tipis dan sedikit tidak
menggumpal (terpisah dari benang yang lain) mungkin
hal tersebut dapat disebabkan daun terlalu muda
sehingga terlihat tipis dan masih sedikit DNAnya
sedangkan daun tanaman jagung menunjukkan bahwa
Pada larutan tersebut terdapat bintik memanjang
berwarna putih kebiru-biruan ternyata hasil benang-
benang DNA terlihat jelas menggumpal agak tebal
dibandingkan dengan daun tanaman kedelai.
Karena hal ini pemilihan daun harus tepat dan
sehat (ujung daun tidak menguning) jika daun terlalu
muda DNA masih terlihat sedikit dan jika daun terlalu tua
maka DNA sudah rusak. Selain itu juga bisa dipengaruhi
oleh dalam pemrosesan langkah kerja kemungkinan
yang bisa terjadi yaitu bisa disebabkan permberian
perlakuan atau pemberian larutan yang berlebihan
maupun kurang yang dapat memicu tidak timbulnya
DNA atau dapat tiimbul namun sedikit dan terputus-
putus benang-benangnya.
Metode isolasi DNA dengan menggunakan
metode Lengkong et al. (1998) dalam Masniawati (2000)
berdasarkan penelitian Pratama (2009) memperlihatkan
hasil ekstraksi DNA yang kurang optimal baik kualitas
maupun kuantitas DNA yang dihasilkan sehingga
mempengaruhi intensitas pita DNA hasil amplifikasi yang
tidak jelas.
Pada prinsipnya optimasi prosedur ini bertujuan
melindungi DNA genom dari degradasi akibat senyawa
sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan atau
kerusakan akibat penanganan fisik (Milligan 1992).
Berdasarkan metode dari Doyle dan Doyle (1987)
dalam Ardiana (2009) yang dimodifikasi. Sebanyak 200
mg sampel tanpa tulang daun ditambah PVP 0,02 g
digerus dengan nitrogen cair hingga halus (tepung).
Penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dalam proses isolasi DNA dapat
mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan
oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat (Wilkins &
Smart 1996).
Buffer CTAB dengan kandungan garam yang
tinggi dapat memisahkan polisakarida dari dinding sel,
sedangkan PVP dapat mengurangi browning akibat
kandungan fenol pada daun muda (Porebski et al.
1997;Surzycki 2000).
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan
memperoleh hasil dari isolasi daun tanaman jagung dan
daun tanaman kedelai nampak terlihat DNAnya.
Sedemikian rupa bahwa DNA yang terlihat lebih jelas
dan menggumpal tebal terdapat pada tanaman jagung
sedangkan pada tanaman kedelai terlihat tipis dan tidak
menggumpal. Hal tersebut dapat dipengaruhi oleh
pemilihan daun kurang tepat sehingga dapat
menyebabkan perbedaan dan selain itu juga dapat
dipengaruhi oleh perlakuan pemberian cairan terhadap
bahan yang diuji.