KUIS DIAGNOSTIK MOLEKULER

1. Pengertian RNA dan DNA

2. Perbedaan RNA dengan DNA

3. Fungsi RNA dan DNA

4. Pembentukan RNA

5. Ekstraksi RNA

6. Perbedaan cara ekstraksi DNA dan RNA

7. Apa yang perlu diperhatikan untuk ekstraksi RNA, megapa perlu

8. Cara membuat Cdna

9. Kenapa ekstraksi RNA lebih suit daripada ekstraksi DNA

10. Bagaimana cara mengetahui kualitas RNA dan DNA

11. Bagaimana rasio absorbansi RNA dan DNA

12. Bagaimana tahap – tahap ekstrasi RNA secara umum

Jawaban :

1. DNA : suatu asam nukleat yang menyimpan materi genetik di dalam inti sel, mitokondria,
hingga sitoplasma, dan terdiri dari gula pentosa deoksiribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen

RNA : makromolekul polinukleotida berupa rantai tunggal atau ganda yang tidak berpilin
seperti DNA, banyak terdapat di ribosom atau sitoplasma, sifatnya mudah terurai, dan tersusun
dari gula pentosa ribosa, gugus fosfat, dan basa nitrogen

2. Perbedaa DNA dan RNA

3. Fungsi RNA dan DNA :

 DNA : membawa informasi genetik, mengekspresikan informasi genetik, berperan dlm

pewarisan sifat
 RNA : berperan dalam proses sintesis protein di dlm sel, namun pada beberapa jenis
virus, RNA berperan seperti DNA untuk membawa informasi genetik.

4. Pembentukan RNA : disebut juga sebagai tahap Transkripsi untuk menghasilkan RNA
messanger atau RNA duta (RNAm/RNAd) yang terjadi didalam nukleus. Tahapan transkripsi
yaitu inisiasi – elongasi – terminasi.

1. RNA polymerase : memisahkan untai DNA menjadi dua dengan bergerak dari terminator
ke promoter.
2. Inisiasi : Penempelan faktor2 pengendali transkripsi di promotor, misalnya RNA
polimerase(bagian ujung kiri dari rantai DNA), merupakan penanda dimulainya
transkripsi/penyalinan.
3. Elongasi : RNA polimerase membaca DNA template dan melakukan pengikatan
nukleotida yg komplementer menghasilkan salinan DNA yang bernama mRNA
4. Terminasi : Setelah pemanjangan untaian RNA, RNA polymerase terlepas dari DNA yang
ditranskripsi

Prinsip transkripsi

1. Prekursor untuk sintesis RNA ada 4 macam: 5′-trifosfat ATP, GTP, CTP, dan UTP ( tidak
ada thymine pada RNA)
2. Reaksi polimerisasi atau pemanjangan RNA sama dengan replikasi DNA yaitu dengan
arah 5′ -> 3′
3. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template
4. Untai DNA yang berperan sebagai cetakan hanya salah satu untai
5. Hasil transkripsi berupa RNA untai tunggal

5. Ekstraksi RNA : medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat
untuk segera mendenaturasi RNase yang ada. Proses deproteinisasi harus dilakukan secara
lebih agresif karena RNA sering berikatan kuat dengan protein. Penambahan DNase dapat
digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian dipresipitasi dengan etanol. Reagen
yang sering digunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium thiocyanate yang
merupakan inhibitor kuat RNase dan merupakan denaturan protein. Integritas RNA dapat
dicek dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahapan :

1. Penghancuran dinding sel:

- Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi.
- Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari
protein yang masih ada

2. Penghilangan protein dan DNA dengan Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan
DNA sehingga RNA dapat diisolasi secara utuh
 3. Pemurnian RNA Purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut
dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan
mengendapkan.

6. Perbedaan Cara Ekstraksi DNA dan RNA

Ekstraksi DNA Ekstraksi RNA

Harus dilakukan dalam kondisi DNAse Harus dilakukan dalam kondisi RNAse Free
Free
Sampel yang akan diisolasi DNAnya harus Sampel yang akan diisolasi RNAnya harus
bebas dari kontaminasi dengan bebas dari kontaminasi dengan ribonucleases
Deoxyribonucleases (DNAse) (RNase).
Menghilangkan kontaminasi RNA dengan Menghilangkan kontaminasi DNA dengan
RNAse DNAse
Sesudah sentrifugasi DNA terlarut didalam Sesudah sentrifugasi RNA berada diatas
supernatan supernatant
pemisahan molekul berdasarkan pemisahan molekul berdasarkan perbedaan
perbedaan Berat Jenis (BJ) DNA (1.5 – 1.7 Berat Jenis (BJ) RNA (1.7 – 2 g/ml).
g/ml)
molekul RNA relatif pendek dan lebih molekul DNA relatif panjang dan lebih
sulit rusak mudah rusak

7. Hal yang perlu diperhatikan untuk ekstraksi RNA , mengapa ekstrasi RNA perlu ?

1. Ukuran partikel : Ukuran partikel mempengaruhi laju ekstraksi dalam beberapa hal.
Semakin kecil ukurannya, semakin besar luas permukaan antara padat dan cair;
sehingga laju perpindahannya menjadi semakin besar. Dengan kata lain, jarak untuk
berdifusi yang dialami oleh zat terlarut dalam padatan adalah kecil.
2. Zat pelarut : Larutan yang akan dipakai sebagai zat pelarut seharusnya merupakan
pelarut pilihan yang terbaik dan viskositasnya harus cukup rendah agar dapat dapat
bersikulasi dengan mudah. Biasanya, zat pelarut murni akan diapaki pada awalnya,
tetapi setelah proses ekstraksi berakhir, konsentrasi zat terlarut akan naik dan laju
ekstraksinya turun, pertama karena gradien konsentrasi akan berkurang dan kedua zat
terlarutnya menjadi lebih kental.
3. Temperatur : Dalam banyak hal, kelarutan zat terlarut (pada partikel yang diekstraksi)
di dalam pelarut akan naik bersamaan dengan kenaikan temperatur untuk memberikan
laju ekstraksi yang lebih tinggi.
4. Protein perusak RNA/ Adanya RNAse
5. Suhu

Mengapa perlu dilakukan ekstrasi RNA ? Ekstraksi RNA dilakukan untuk memisahkan RNA
dari komponen sel lainnya (seperti dna, protein, karbo, lemak, dll) sehingga didapatkan
RNA yang murni dan dapat dianalisis lebih lanjut dgn teknik molekuler lainnya.

8. Cara membuat CDNA

CDNA : complementary DNA (DNA komplementer) konversi RNA menjadi DNA,

diperlukan enzim yang dikenal dengan reverse transkriptase yang diketahui juga di miliki
oleh virus tersebut. Pakar biologi molekular juga berhasil memanfaatkan enzim tersebut,
reverse transcriptase, untuk mengkonversi mRNA menjadi complementary DNA (DNA
 komplementer) yang lebih dikenal dengan CDNA. Secara deskripsi, cDNA merupakan untai
ganda DNA yang dibuat dari mRNA baik berasal dari prokariot maupun eukariot.

Tujuan CDNA : Efesiensi praktik molekuler dengan cDNA dalam lebih baik dan aman
dibandingkan RNA (mRNA) secara langsung karena kestabilan dari RNA mudah sekali
terdegradasi oleh RNase. Sehingga untuk berkerja dengan RNA secara langsung menjadi
kurang efisien karena membutuhkan tingkat kehati-hatian yang cukup tinggi.

Cara Membuat :

1. Isolasi mRNA
2. melakukan proses konversi ke DNA dengan reagen yaitu dNTPs (dGTP,
dCTP, dATP and dTTP), primer, dan enzim reverse transcriptase.
3. Selanjutnya yang harus dilakukan adalah mencampurkan mRNA dengan
campuran reagen tersebut untuk membuat untai komplemen dari DNA
(sintesis untai pertama). Proses ini memakan waktu 10-60 menit
tergantung enzim reverse transkriptase yang digunakan.
4. Kemudian mRNA harus dihilangkan
5. untai kedua DNA dapat disentesis.

Fungsi Reagen :

1. dNTPs: merupakan larutan yang mengandung monomer penyusun DNA (Guanin,

Adenin, Sitosin dan Timin). Bahan ini sangat penting untuk kelanjutan sintesis cDNA
dari mRNA. Tanpa adanya dNTPs maka proses penyusunan komplemen dari mRNA
yang akan ditranskri balik dengan bantuan enzim reverse transkriptase tidak akan
berjalan karena tidak ada monomer yang bisa dipolimerisasi menjadi untai cDNA.
2. Enzim reverse transkriptase : merupakan enzim yang digunakan untuk mensintesis
mRNA menjadi untai DNA.
3. Primer : Terdapat tiga jenis primer yang dapat digunakan untuk mensintesis cDNA.
a. Jika mRNA memiliki poly-A pada ujung 3′, maka primer oligo-dT dapat digunakan
sebagai primer untuk semua mRNA secara simultan. Umumnya primer jenis ini
digunakan apabila mRNA yang digunakan berasal dari sel eukariot, sebab pada sel
eukariot sel akan menambahkan poly-A (melakukan adenilasi) pada ujung 3′
setelah proses splicing untuk menghilangkan intron.
b. Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari mRNA tertentu (mRNA target) maka
penggunaan primer spesifik dapat dilakukan. Primer jenis umumnya digunakan
pada mRNA dari sel prokariot karena mRNA dari sel prokariot tidak mengandung
poly-A (sel tidak melakukan poly adenilasi.
c. Jika cDNA yang akan dibuat berasal dari seluruh mRNA secara acak, maka random
primer dapat digunakan.

9. mengapa ekstraksi RNA lebih sulit disbanding DNA ?

 Molekul RNA relatif pendek dan lebih sulit rusak sehingga disrupsi sel dapat
dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun begitu, RNA sangat mudah didigesti oleh
RNase.
 RNA sering berikatan kuat dengan protein sehingga Proses deproteinisasi harus
dilakukan secara lebih agresif
  RNA sangat sensitif terhadap nuklease. Semua basa RNA memiliki grup 2-
hidroksil reaktif sehingga mudah terjadi reaksi kimia yang menghasilkan air dan
merusakkan rantai gulanya.
 kestabilan dari RNA mudah sekali terdegradasi oleh RNase. Sehingga untuk
berkerja dengan RNA secara langsung menjadi kurang efisien karena membutuhkan
tingkat kehati-hatian yang cukup tinggi

10. Bagaimana cara mengetahui kualitas RNA dan DNA :

Untuk memeriksa integritas DNA/ RNA dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel
agarose, Secara kasar gambaran yang diperoleh dari elektroforesis pada gel agarose
tersebut juga dapat digunakan untuk menaksir konsentrasi isolat DNA/RNA kita.

Cara yang lebih akurat untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA yang
diperoleh adalah dengan menggunakan spektrofotometer UV.

DNA untaian tunggal mempunyai koefisien absorbsi 0,027, DNA g/ml/cm pada
panjang gelombang 260 nm untaian ganda 0,02

RNA 0,025 Rasioabsorbsi 260/280 nm dapat digunakan

untuk mengetahui adanya kontaminasi protein ataufenol (protein memiliki absorbs

maksimum pada 280 nm).

Sampel DNA yang murni memiliki rasio 260/280 nm sebesar 1,8-1,9, sedangkan
sampel RNA yang murni 1,9-2,0.

Jika rasio tersebut di bawah 1,8 berarti ada ketidakmurnian yang signifikan yang masih
tertinggal di dalam sampel.

11. Rasio absorbansi DNA & RNA

Rasio absorbansi pada 260 dan 280 nm (A 260/280 ) digunakan untuk menilai
kemurnian asam nukleat.

Untuk DNA murni, A 260/280 secara luas dianggap 1,8 tetapi 60% protein dan 40%
DNA sedangkan Rasio untuk RNA A 260/280 murni adalah 2,0.
12. Tahapan ekstraksi RNA secara umum