Pertanyaan Kelompok 3

Vektor/Wahana Dan Jenis-Jenis Kloning

1. Apa yang dimaksud dengan vektor kloning?

Jawab:
Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang
akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan
terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut. Vektor yang dapat
digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E.coli adalah plasmid, bakteriofag,
kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor YACs dan YEps dapat digunakan pada
khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40, dan retrovirus merupakan vektor-vektor yang
dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.

2. Apa sajakah syarat-syarat agar plasmid dapat digunakan sebagai vektor kloning?
Jawab:
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat
berikut ini:
1. Mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang
sehingga dapat dengan mudah melintasinya,
2. Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk
tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
3. Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu
marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan
4. Mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam
sel inang.

3. Ada berapa macam bakteriofag yang biasanya digunakan sebagai vektor kloning, dan
jelaskan?
Jawab:
a. Bakteriofag l
Bakteriofag atau fag l merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E.
coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat
memanfaatkannya sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal
perkembangan rekayasa genetika. DNA l yang diisolasi dari partikel fag ini
 mempunyai konformasi linier untai ganda dengan panjang 48,5 kb. Namun,
masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal sepanjang 12 pb yang
komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA l untuk berubah
konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat bergabungnya
kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos. Seluruh urutan basa
DNA l telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu tempat pengenalan
restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh karena itu, DNA
l tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan tetapi, saat
ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA l yang memenuhi syarat
sebagai vektor kloning.

b. Bakteriofag M13
Ada jenis bakteriofag lainnya yang dapat menginfeksi E. coli. Berbeda dengan l
yang mempunyai struktur ikosahedral berekor, fag jenis kedua ini mempunyai
struktur berupa filamen. Contoh yang paling penting adalah M13, yang
mempunyai genom berupa untai tunggal DNA sirkuler sepanjang 6.408 basa.
Infeksinya pada sel inang berlangsung melalui pili, suatu penonjolan pada
permukaan sitoplasma.
Ketika berada di dalam sel inang genom M13 berubah menjadi untai ganda
sirkuler yang dengan cepat akan bereplikasi menghasilkan sekitar 100 salinan.
Salinan-salinan ini membentuk untai tunggal sirkuler baru yang kemudian
bergerak ke permukaan sel inang. Dengan cara seperti ini DNA M13 akan
terselubungi oleh membran dan keluar dari sel inang menjadi partikel fag yang
infektif tanpa menyebabkan lisis. Oleh karena fag M13 terselubungi dengan cara
pembentukan kuncup pada membran sel inang, maka tidak ada batas ukuran DNA
asing yang dapat disisipkan kepadanya.

4. Jelaskan jenis-jenis kloning?

Jawab:
1. Kloning DNA rekombinan
Kloning ini merupakan pemindahan sebagian rantai DNA yang diinginkan dari
suatu organisme pada satu element replikasi genetik, contohnya penyisipan DNA
dalam plasmid bakteri untuk mengklon satu gen. Kloning ini meliputi
 serangkaian proses isolasi fragmen DNA spesifik dari genom suatu organisme,
dimulai dari penentuan sekuen DNA serta pembentukan molekul DNA
rekombinan, dan ekspresi gen target dalam sel inang. Penentuan sekuen DNA
yang melalui sekuensing memiliki tujuan untuk memastikan fragmen DNA yang
kita isolasi adalah gen target sesuai dengan kehendak kita. Gen target yang kita
peroleh selanjutnya kita klon dalam sebuah vektor (plasmid, phage atau cosmid)
melalui teknologi DNA rekombinan yang selanjutnya akan membentuk molekul
DNA rekombinan. DNA rekombinan yang dihasilkan kemudian ditransformasi ke
dalam sel inang (biasanya sel bakteri, misalnya strain E. coli) untuk diproduksi
lebih banyak. Gen-Gen target yang ada di dalam sel inang jika diekspresikan akan
mengahasilkan produk gen yang kita inginkan.

2. Kloning Reproduktif
Kloning ini merupakan teknologi yang digunakan untuk menghasilkan hewan
yang sama, contohnya Dolly dengan suatu proses yang disebut SCNT (Somatic
Cell Nuclear Transfer). Pada tipe reproduktif, DNA yang berasal dari sel telur
manusia atau hewan dihilangkan dan diganti dengan DNA yang berasal dari sel
somatik (kulit, rambut, dan lain-lain) hewan atau menusia dewasa yang lain.
Dengan suatu loncatan listrik, inti sel hewan atau manusia yang telah diinjeksikan
pada sel somatik tersebut selanjutnya akan berkembang dan membelah.
Selanjutnya, embrio hasil teknik ini dimasukkan (diimplantasikan) dalam rahim
hewan atau manusia yang memungkinkan embrio berkembang menjadi hewan
ataupun menjadi manusia baru. Meskipun teknik kloning ini berpotesi
menghasilkan individu hewan atau manusia yang identik dengan hewan atau
manusia pendonor DNA, teknik kloning ini juga berpotensi besar dalam
menghasilkan kelainan genetik yang berat pada individu hasil kloning.

3. Kloning Terapeutik
Kloning ini merupakan suatu kloning untuk memproduksi embrio manusia
sebagai bahan penelitian. Tujuan utama dari proses ini bukan untuk menciptakan
manusia baru, tetapi untuk mendapatkan sel batang yang dapat digunakan untuk
mempelajari perkembangan manusia dan penyembuhan penyakit.