1

IMMUNOHISTOKIMIA
Antibodi Kanker Payudara (Anti-ErbB)

Disusun oleh :
Kelas E Kelompok 5

Dianah Rezqi Salsabila (G1C219090)

Dina Mardhiyah Agustina (G1C219171)
Eva Nur Janah (G1C219081)
Nurhidayah (G1C219094)
Nur Azizah (G1C219138)
M. Rezananda Almubayyin (G1C319078)
Suci Indah Astuti (G1C219084)

PROGRAM STUDI D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG
2019-2020

i
A. Pemeriksaan Imunohistokimia
1. Protokol Staining Protocol untuk parafin
a. Bagian parafin dan beku
Reagen dapat diterapkan secara manual melalui pipet, atau protokol ini
dapat diadaptasi untuk sistem otomatis dan semi-otomatis jika tersedia.
Lakukan inkubasi di ruang lembab untuk mencegah pengeringan jaringan,
yang akan menyebabkan kerusakan latar belakang yang non-spesifik. Siapkan
kotak plastik tertutup dan kertas tisu basah di bagian bawah untuk ruang yang
memadai. Jauhkan slide dari kertas dan baringkan agar reagen tidak mengalir.
Potong pipet serologis plastik menjadi panjang agar sesuai dengan ruang
inkubasi kemudian rekatkan secara berpasangan ke bagian bawah, dengan
masing-masing dan berjarak sekitar 4 cm. Ini memberikan permukaan yang
rata dan terangkat untuk slide, jauh dari kertas tisu basah. Pengenceran
antibodi primer dan sekunder didaftar di lembar data atau ditentukan dengan
menguji berbagai cairan. Sesuaikan pengenceran dengan tepat dari hasil yang
diperoleh. Untuk metode enzimatik, horseradish peroxidase (HRP) atau
alkaline phosphatase (AP) adalah enzim yang paling sering digunakan. Ada
sejumlah kromosom yang digunakan dengan enzim ini.
1) Metode
Melakukan pengambilan antigen sebelum memulai dengan
immunostaining jika perlu.
a) Jika menggunakan konjugat HRP untuk deteksi, pemblokiran
peroksidase endogen dapat dilakukan tetapi kami sarankan menunggu
sampai setelah inkubasi antibodi primer. H2O2 menekan aktivitas
peroksidase dari dalam untuk mengurangi pewarnaan latar belakang.
Periksa keberadaan peroksidase endogen dengan menginkubasi slide
jaringan setelah hidrasi ulang dalam larutan DAB. Jika area-area pada
bagian tampak coklat di bawah mikroskop, langkah pemblokiran akan
membantu mengurangi pewarnaan. Beberapa epitop dimodifikasi oleh

2
 3

peroksida, sehingga mengurangi ikatan antibodi-antigen. Inkubasi

bagian dengan peroksida setelah inkubasi primer untuk menghindari
masalah ini. Peroksida dapat diencerkan dalam TBS atau air. Metanol
bermanfaat untuk apusan darah atau jaringan kaya peroksidase lainnya;
peroksida yang dilarutkan dalam metanol cenderung mengurangi
kerusakan jaringan yang disebabkan oleh reaksi dalam larutan berair.
Untuk jaringan lain, encerkan dalam TBS atau air. Mengurangi ikatan
beberapa pasangan antibodi-antigen, khususnya protein permukaan sel,
telah diamati setelah inkubasi metanol / peroksida. Jika menggunakan
AP atau deteksi fluoresens, hilangkan pendinginan peroksidase karena
hanya berlaku untuk konjugat HRP.
b) Cuci slide 2 x 5 menit di TBS plus 0,025% Triton X-100 dengan
agitasi lembut. 0,025% Triton X-100 dalam TBS mengurangi
tegangan permukaan, memungkinkan pereaksi untuk menutupi seluruh
jaringan dengan mudah. Diyakini juga melarutkan reseptor Fc dan
mengurangi ikatan non-spesifik. Kami merekomendasikan TBS
melalui PBS untuk mendapatkan latar belakang yang lebih bersih.
c) Blokir dalam serum normal 10% dengan BSA 1% dalam TBS selama
2 jam pada suhu kamar. Antibodi sekunder dapat bereaksi silang
dengan imunoglobulin endogen dalam jaringan. Kurangi ini dengan
memperkuat jaringan dengan serum normal dari spesies yang
ditingkatkan. Penggunaan serum normal sebelum fungsi primer juga
menghilangkan ikatan reseptor Fc dari antibodi primer dan sekunder.
BSA dimasukkan untuk mengurangi ikatan non-spesifik yang
disebabkan oleh interaksi hidrofobik.
d) Tiriskan slide selama beberapa detik (jangan bilas) dan bersihkan di
sekitar bagian dengan kertas tisu.
e) Terapkan antibodi primer yang diencerkan dalam TBS dengan 1%
BSA. Encerkan antibodi primer sesuai rekomendasi pabrik atau ke
 4

pengenceran yang dioptimalkan sebelumnya. Sebagian besar antibodi

akan digunakan dalam IHC-P pada konsentrasi 0,5-10 μg / mL.
Antibodi primer harus dibangkitkan pada spesies yang berbeda dari
jaringan yang ternoda. Misalnya, jika Anda memiliki jaringan tikus
dan antibodi primer Anda dibesarkan dalam tikus, antibodi sekunder
IgG anti-tikus akan mengikat semua IgG endogen di jaringan mouse
dan menyebabkan latar belakang yang tinggi. Penggunaan monoklonal
mouse pada jaringan tikus dibahas dalam protokol mouse-on-mouse
kami.
f) Inkubasi semalaman pada suhu 4 ° C. Inkubasi semalaman
memungkinkan penggunaan antibodi dengan titer atau afinitas rendah
dengan memberikan lebih banyak waktu bagi antibodi untuk mengikat.
Terlepas dari titer atau afinitas antibodi untuk targetnya, begitu
jaringan telah mencapai titik jenuh, tidak ada lagi ikatan yang dapat
terjadi. Inkubasi semalaman untuk memastikan ini terjadi.
g) Bilas 2 x 5 menit TBS 0,025% Triton dengan agitasi lembut.
h) Jika menggunakan konjugat HRP untuk deteksi, inkubasi slide dalam
0,3% H 2 O 2 di TBS selama 15 menit.
i) Kembangkan produk berwarna dari enzim dengan kromogen yang
sesuai. Pilihan tergantung pada enzim label, produk akhir berwarna
yang disukai dan apakah berair atau organik Media pemasangan
digunakan. AEC, Cepat Merah, INT atau chromogen berair lainnya
adalah alkohol larut. Gunakan sesuai media yang pemasangan air dan
tidak dehidrasi dan jelas.
2) Langkah deteksi
Untuk deteksi enzimatik (HRP atau AP konjugat sekunder)
1) Gunakan antibodi sekunder yang terkonjugasi enzim pada slide,
diencerkan dalam TBS dengan 1% BSA, dan inkubasi selama 1 jam
pada suhu kamar.
 5

2) Berkembang dengan kromogen selama 10 menit pada suhu kamar.

3) Bilas dengan air leding selama 5 menit.
4) Counterstain (jika perlu). Beberapa counterstains yang umum
digunakan adalah hematoxylin (biru), nuklir cepat merah, atau hijau
metil. Saat menggunakan deteksi fluoresens, DAPI (biru) atau
propidium iodide / PI (merah) dapat digunakan.
5) Dehidrasi, jelas dan me-mount.
AEC, Cepat Merah, INT atau chromogen berair lainnya adalah alkohol
larut. Gunakan media pemasangan air yang cocok dan jangan
mengalami dehidrasi dan jernih. Dehidrasi dan bagian yang jelas
dikembangkan menggunakan DAB, New Fuchsin, Vega Red, NBT,
TNBT atau bagian kromogen organik lainnya yang dikembangkan
dengan menjalankan langkah-langkah rehidrasi dalam protokol
deparaffinisasi kami. Pasang bagian dalam media pemasangan organik
yang cocok. Bagian yang dipasang di media pemasangan organik
memiliki indeks bias yang lebih baik daripada yang dipasang di media
pemasangan air. Ini memberikan gambar mikroskopis yang lebih tajam
jika media pemasangan organik digunakan.
3) Untuk deteksi fluoresens
1) Terapkan antibodi sekunder yang terkonjugasi fluorofor ke slide yang
diencerkan dalam TBS dengan 1% BSA.
2) Inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Langkah-langkah ini harus
dilakukan dalam gelap untuk menghindari pemotretan foto .
3) Bilas sebanyak 3x selama 5 menit dengan TBS.
4) Pasang menggunakan media pemasangan yang kompatibel dan
tambahkan coverlip.
b. immunostaining: bagian mengambang bebas
1) Bahan dan reagen
Blok peroksidase (40 mL)
 6

a) 20 mL 0,2M buffer fosfat

b) 8 mL methanol
c) 80 μL Triton-X100
d) 2 mL hidrogen peroksida
e) Membuat hingga 40 mL dengan DDH 2 O
Memblokir buffer
1) 0,1M Buffer fosfat
2) 0,3% Triton
3) 1% serum dari spesies inang antibodi sekunder
2) Metode
1) Potong bagian 30-40 μm pada mikrotom beku. Kumpulkan bagian-
bagian ke dalam cawan petri atau piring multi-sumur yang
mengandung 1-2 mL 0,1 M buffer fosfat (PBS).
2) Simpan bagian pada suhu 4 ° C selama tidak lebih dari seminggu.
Untuk penyimpanan yang lebih lama, tambahkan azide, bungkus
cawan petri atau piring multi sumur dalam film melekat dan simpan
pada suhu 4 ° C selama tidak lebih dari 2 bulan. Jika dibiarkan terlalu
lama, bagian-bagian menjadi lebih sulit untuk dipasang.
3) Nonaktifkan peroksidase endogen dengan menginkubasi dalam blok
peroksidase selama 15 menit dengan agitasi yang lembut.
4) Cuci (3 x 15 mnt) dalam 0,1M PBS / 0,3% Triton.
5) Inkubasi bagian dalam blokir penyangga setidaknya selama 1 jam
dengan agitasi yang lembut.
6) Cuci (3 x 15 mnt) dalam 0,1M PBS / 0,3% Triton.
7) Tambahkan antibodi sekunder baik selama 2 jam pada suhu kamar atau
semalam pada suhu 4 ° C dengan agitasi lembut.
8) Cuci (3 x 15 mnt) dalam 0,1M PBS 0,3% Triton.
9) Tambahkan antibodi sekunder baik selama 2 jam pada suhu kamar atau
semalam pada suhu 4oc dengan agitasi lembut.
 7

10) Cuci (3 x 15 mnt) dalam 0,1M PBS (no Triton).

11) Cuci sekali sebentar dalam buffer asetat 0,1M untuk menghapus PBS.
12) Buffer asetat harus dibuat segar.
13) Tempatkan bagian dalam larutan untuk reaksi DAB. Pantau reaksi
DAB pada mikroskop (2–10 menit).
14) Hentikan reaksi begitu latar cukup tinggi dengan menempatkan bagian
ke dalam buffer asetat 0,1M.
15) Cuci (3 x 15 mnt) dalam 0,1M PBS.
16) Bagian dapat disimpan di ruang dingin selama beberapa hari sampai
dipasang dan ditutup-tutupi.
17) Bagian udara kering di lemari asam. Tempatkan bagian (2 x 10 menit)
dalam histoclear.
18) Pasang dari inkubasi histoklear 10 menit ketiga.
19) Coverslip menggunakan Ralmount. Gunakan media pemasangan yang
sesuai untuk bagian-bagian yang berlabel deteksi fluoresens.
c. Amplifikasi sinyal
Untuk mencapai sinyal yang lebih kuat, berbagai strategi telah
dikembangkan untuk menambahkan lebih banyak enzim atau fluorofor ke
target yang diinginkan.
d. Kompleks Avidin-biotin (ABC)
Teknik ini menggunakan afinitas avidin yang tinggi untuk biotin, suatu
ko-faktor enzim dalam reaksi karboksilasi. Avidin memiliki empat situs
pengikatan untuk biotin da pengikatan pada dasarnya tidak dapat
dipulihkan. Singkatnya, antibodi primer terikat pada protein yang
diinginkan. Antibodi sekunder yang terbiotinilasi kemudian terikat pada
antibodi primer. Dalam reaksi terpisah, kompleks avidin dan enzim
terbiotinilasi terbentuk dengan mencampurkan keduanya dalam rasio
yang membuat beberapa situs pengikatan pada avidin tidak dihuni.
Kompleks ini kemudian diinkubasi dengan bagian jaringan setelah
 8

inkubasi antibodi. Situs pengikatan biotin yang tidak dihuni pada

kompleks berikatan dengan antibodi sekunder yang terbiotinilasi. Ini
menempel lebih banyak enzim pada target daripada yang mungkin
menggunakan antibodi sekunder atau primer yang terkonjugasi enzim.
Komponen kompleks avidin-biotin tersedia secara komersial dalam kit
dan kompleks dapat digunakan dengan antibodi yang terbiotinilasi.
Kehadiran biotin endogen dalam jaringan dapat mengikat kompleks
avidin-biotin dan menyebabkan pewarnaan latar belakang. Jaringan
tersebut termasuk ginjal, hati, otak, prostat, usus besar, usus, dan testis.
e. Labeled streptavidin biotin (LSAB)
Metode ini mirip dengan ABC karena menggunakan interaksi streptavidin
(mirip dengan avidin dalam afinitas pengikatan) dan biotin. Antibodi
primer diikuti oleh antibodi sekunder anti-lg yang terbiotinilasi, diikuti
oleh streptavidin yang terkonjugasi menjadi enzim atau fluorofor.
Streptavidin menghasilkan pewarnaan latar belakang yang tidak spesifik
dibandingkan avidin karena pewarnaan non-glikosilasi (tidak seperti
avidin) dan karenanya tidak berinteraksi dengan lektin atau protein
pengikat karbohidrat lainnya. Untuk perbandingan dengan ABS di mana
LSAB terbukti 4-8 kali lebih sensitif (lihat Giorno R (1984), Diagnosa
Immuno l. 2: 161-6). Lihat kit ABC LSAB kami .
f. Polimer HRP
Kedua metode avidin-biotin (ABC dan LSAB) kehilangan dukungan
terhadap produk polimer-enzim-antibodi baru yang terdiri dari antibodi
sekunder (misalnya anti-mouse dan / atau kelinci IgG) yang melekat pada
kompleks polimer-enzim. Ini sebagian karena masalah biotin endogen
dihindari. Micro-polimer kit deteksi untuk IHC menggunakan modul
deteksi berbasis linker kecil yang dapat menembus jaringan lebih baik
dari kompleks besar yang digunakan dalam deteksi berbasis polimer
konvensional, sehingga sensitivitas yang lebih tinggi.
 9

g. Tyramide signal enhancing (TSE)

Salah satu prosedur amplifikasi yang paling efektif adalah metode yang
dipatenkan dan berlisensi, TSE (juga dikenal sebagai TSA atau CSA).
Berguna untuk mendeteksi antigen jarang sehingga sistem lain mengalami
kesulitan mendeteksi, dan untuk meningkatkan hasil yang diperoleh
dengan antibodi yang berkinerja buruk. Metode ini bergantung pada
reaksi yang dikatalisis peroksidase untuk secara kovalen menempelkan
bagian tyramide dari tyramine-protein konjugat ke area sekitar protein
yang diinginkan, setelah menerapkan konjugat antibodi primer dan
sekunder-HRP. Protein yang melekat secara kovalen tidak dapat dicuci,
bahkan jika slide diperlakukan untuk menghilangkan antibodi, karena
ikatan tyramide bersifat kovalen. Suatu sinyal diperoleh dengan
mengarahkan konjugat antibodi-enzim atau fluorofor terhadap bagian
protein dari konjugat protein-tyramine.

2. Protokol fiksasi immunohistokimia

Fiksasi melumpuhkan antigen sambil mempertahankan struktur seluler
dan subselular. Metode fiksasi yang digunakan akan tergantung pada
sensitivitas epitop dan antibodi itu sendiri dan mungkin memerlukan beberapa
optimasi. Fiksasi dapat dilakukan dengan menggunakan reagen pengikat
silang seperti paraformaldehyde. Ini lebih baik dalam mempertahankan
struktur sel, tetapi dapat mengurangi antigenisitas beberapa komponen sel
karena ikatan silangnya dapat menghambat ikatan antibodi. Teknik
pengambilan antigen mungkin diperlukan, terutama jika ada waktu inkubasi
fiksasi yang panjang atau jika persentase tinggi fiksatif pengikat silang
digunakan.
 10

3. Gambaran Hasil

Gambar 2.5 Imunohistokimia (formalin/bagian yang ditempatkan pada

parafin)- antibodi Anti-erbB 2 (epr1954-12) (ab214275)

Analisis imunohistokimia dari pelabelan jaringan kanker payudara

manusia yang dilekatkan parafin ErbB 2 dengan ab214275 pada pengenceran
1/4000, diikuti oleh Kambing Anti-Kelinci IgG H&L (HRP) ( ab97051 ) pada
pengenceran 1/500.
Pewarnaan membran pada kanker payudara manusia diamati [PMID:
18437174].
Counterstain (pewarna penutup) diwarnai dengan Hematoxylin.
Antibodi sekunder hanya untuk kontrol: PBS yang digunakan sebagai
pengganti antibodi primer, antibodi sekunder adalah ab97051 pada pengenceran
1/500.
Lakukan pengambilan antigen yang dimediasi panas dengan Tris / EDTA
buffer pH 9.0 sebelum mulai dengan protokol pewarnaan IHC.

a. Metode fiksasi untuk sampel kultur sel

Formalin:
1) Tambahkan 10% netral buffered formalin (NPF) ke slide selama 10
menit.
2) Cuci 3x dengan PBS.
Memperbaiki dalam formalin selama lebih dari 10-15 menit akan
menghubungkan silang protein ke titik di mana pengambilan antigen
 11

mungkin diperlukan untuk memastikan antibodi memiliki akses bebas

untuk mengikat dan mendeteksi protein.

Etanol
1) Tambahkan 100–200 μL etanol 95%, asam asetat glasial 5% per slide.
2) Tempatkan pada -20 ° C selama 5-10 menit lebih disukai dalam
stoples Coplin.
3) Cuci 3x dengan PBS.

Metanol
1) Tambahkan 100–200 μL es metanol dingin, asam asetat 5% per slide.
2) Tempatkan pada -20 ° C selama 10 menit lebih disukai dalam stoples
Coplin
3) Cuci 3x dengan PBS.
Etanol dan metanol juga akan permeabilisasi. Beberapa epitop sangat
sensitif terhadap metanol karena dapat mengganggu struktur epitop.
Jika ini terjadi, cobalah aseton jika permeabilisasi diperlukan.

Aseton
1) Tambahkan 100–200 μL es aseton dingin per slide.
2) Tempatkan pada -20 ° C selama 5-10 menit.
3) Cuci 3x dengan PBS.
Aseton juga akan permeabilize. Tidak diperlukan langkah
permeabilisasi lebih lanjut.

b. Metode fiksasi untuk sampel jaringan

1) Fiksasi pencelupan
10% netral buffered formalin (NBF) paling umum digunakan. Di
mana lembar data kami menyatakan IHC-P sebagai aplikasi yang
 12

diuji, fiksatif ini telah digunakan kecuali dinyatakan sebaliknya.

Fiksatif lain seperti larutan Bouin (paraformaldehyde / picric acid)
lebih jarang digunakan. Waktu fiksasi yang ideal akan tergantung
pada ukuran blok jaringan dan jenis jaringan, tetapi fiksasi antara 18-
24 jam tampaknya cocok untuk sebagian besar aplikasi. Under-
fixation dapat menyebabkan pewarnaan tepi, dengan sinyal kuat di
tepi bagian dan tidak ada sinyal di tengah. Fiksasi berlebihan bisa
menutupi epitop; pengambilan antigen dapat membantu mengatasi
penyamaran ini, tetapi jika jaringan telah diperbaiki untuk jangka
waktu yang lama (yaitu selama akhir pekan), mungkin tidak ada
sinyal bahkan setelah pengambilan antigen.
2) Fiksasi perfusi
Fiksasi yang memadai sering diperoleh dengan cara merendam
potongan-potongan jaringan kecil ke dalam larutan fiksatif. Namun,
fiksasi yang lebih cepat dan seragam biasanya diperoleh jika larutan
fiksatif disempurnakan melalui sistem vaskular, baik melalui jantung
atau melalui aorta abdominal. Prosedur berikut menyediakan fiksasi
sebagian besar organ tikus dengan paraformaldehyde 4%.
Bahan untuk fiksasi perfusi
a) Obat bius
b) Gunting, tang, dan klem untuk prosedur bedah
c) Tang kecil dengan cakar halus
d) Pisau bedah
e) Vial (5-10 mL) dengan kelopak untuk specimen
f) 0,9% saline
g) 500 mL gelas kimia
h) 4% paraformaldehyde, larutan fiksasi
i) Sarung tangan, kacamata mata
 13

j) Pompa perfusi (atau labu dengan fiksatif ditempatkan terbalik

sekitar 150 cm di atas meja operasi)
k) Jarum suntik pendek untuk perfusi jantung aorta, panjang sekitar
50 mm, diameter luar 1,3-1,5 mm
l) Perfusi diatur dengan ruang tetesan seperti yang digunakan untuk
infus darah intravena
3) Fiksasi perfusi melalui hati
a) Menyiapkan pompa perfusi; pasang set perfusi dan jarum perfusi.
Pertama, jalankan sekitar 100 mL air ledeng melalui pipa untuk
menghilangkan residu. Kemudian tempatkan ujung terbuka
tabung perfusi dalam gelas diisi dengan paraformaldehyde dingin
4% (dalam kotak es). Volume larutan harus diskalakan sesuai
ukuran hewan dan biasanya 200–300 mL akan cukup untuk satu
hewan. Buka katup dan sesuaikan dengan tetesan stabil lambat
(20 mL / menit), lalu tutup katup.
b) Siapkan tempat operasi dengan gunting, penjepit dan penjepit.
Berikan obat bius dengan jumlah yang sesuai. Setelah hewan
berada di bawah anestesi, letakkan di atas meja operasi dengan
punggung menghadap ke bawah. Anda dapat menggunakan
beberapa selotip untuk menahan pelengkap sehingga hewan
tersebut terpasang dengan benar.
c) Gunakan metode respons terjepit untuk menentukan kedalaman
anestesi. Hewan itu harus tidak responsif sebelum melanjutkan
dengan langkah-langkah berikut.
d) Buat sayatan dengan pisau bedah melalui perut, panjang
diafragma. Dengan gunting tajam, potong jaringan ikat di bagian
bawah diafragma untuk memungkinkan akses ke tulang rusuk.
e) Dengan gunting besar, tumpul sisi bawah, potong tulang rusuk
tepat di kiri garis tengah tulang rusuk.
 14

f) Buat satu atau dua ujung tengah potongan horizontal melalui

tulang rusuk, dan buka rongga toraks. Jepit terbuka untuk
mengekspos jantung dan menyediakan drainase untuk darah dan
cairan.
g) Sambil memegang jantung stabil dengan forsep (masih harus
berdetak), masukkan jarum langsung ke tonjolan ventrikel kiri
untuk memanjang lurus ke atas sekitar 5 mm. Berhati-hatilah agar
jarum tidak terlalu panjang, karena dapat menembus dinding
interior dan mengganggu sirkulasi solusi. Amankan posisi jarum
dengan menjepit di tempat dekat titik masuk. Lepaskan katup
untuk memungkinkan aliran yang lambat dan stabil sekitar 20 mL
/ menit dari larutan garam 0,9%.
h) Buat potongan di atrium dengan gunting tajam, dan pastikan
larutan mengalir bebas. Jika cairan tidak mengalir bebas atau
keluar dari lubang hidung atau mulut hewan, posisikan ulang
jarum.
i) Ketika darah telah dibersihkan dari tubuh, ubah menjadi larutan
paraformaldehyde 4% (200–300 mL).
j) Berhati-hatilah untuk tidak memasukkan gelembung udara saat
mentransfer dari satu solusi ke solusi lainnya. Yang terbaik adalah
memakai kacamata pelindung selama seluruh proses perfusi.
k) Perfusi hampir lengkap ketika gerakan spontan dan warna hati
yang teramati diamati. (Secara umum, tikus dewasa akan
membutuhkan sekitar 30-60 menit waktu perfusi tetapi ini dapat
bervariasi tergantung pada ukuran hewan dan teknik.)
l) Hentikan perfusi dan potong jaringan yang diinginkan.
Tempatkan mereka dalam botol berisi larutan fiksasi yang sama
dan pasang selama 2 jam di atas es atau pada suhu 4 ° C sebelum
 15

melanjutkan ke dehidrasi dan penanaman. Untuk hasil yang lebih

baik, perbaiki perendaman semalaman pada suhu 4 ° C.
4) Fiksasi perfusi melalui aorta perut
a) Persiapkan bahan dan hewan seperti di atas (langkah 1-3).
b) Buka rongga perut dengan sayatan garis tengah yang panjang
dengan ekstensi lateral, dan pindahkan usus dengan lembut ke sisi
kiri hewan.
c) Paparkan aorta dengan hati-hati di bawah asal arteri renal dan
dengan lembut membebaskan aorta dari pelebaran jaringan
adiposa dan jaringan ikat.
d) Pegang dinding aorta dengan kuat dengan forsep halus dengan
cakar sekitar 0,5-1,0 cm dari bifurkasi distalnya. Masukkan jarum
bengkok ke dekat forsep ke arah jantung ke dalam lumen aorta.
e) Dalam suksesi sangat cepat: 1) Potong sebuah lubang di vena
kava rendah dengan gunting halus 2) Mulai perfusi 3) Clamp
aorta di bawah diafragma, tetapi di atas asal arteri ginjal Ketika
melakukan manipulasi akurasi dan kecepatan yang penting dan
prosedur fiksasi lebih disukai dilakukan oleh dua orang. Sangat
penting untuk menjepit aorta dengan cepat setelah perfusi
dimulai. Ini paling mudah dilakukan dengan mengompres aorta ke
arah dinding posterior rongga peritoneum dengan jari (pakai
sarung tangan) yang kemudian diganti dengan penjepit. Akhirnya,
potong aorta di atas kompresi.
f) Permukaan ginjal harus segera memucat dan menunjukkan warna
pucat yang seragam. Laju aliran harus setidaknya 60-100 mL /
menit untuk tikus dewasa. Perfuse selama 3 menit. Hentikan
perfusi dan cukai dan potong jaringannya. Simpan jaringan dalam
vial dan fix-immersion dalam fixative yang sama (langkah post-
fixation) selama 2 jam di atas es atau pada suhu 4 ° C. Untuk hasil
 16

yang lebih baik, perbaiki perendaman semalaman pada suhu 4 °

C.
g) Jaringan sekarang siap untuk dehidrasi dan penanaman.

4. Pemecahan masalah perbaikan perfusi

Fiksasi terlalu lama - solusi fiksatif tidak beredar dengan benar. Pastikan
Anda telah menjepit jarum dengan benar pada titik masuk dan tidak ada
kebocoran / tusukan ke jantung. Ini dapat dengan mudah dilakukan
dengan mengeringkan area sekitar jantung untuk melihat apakah fiksatif
bocor. Selain itu, coba posisikan ulang penempatan jarum.
a. Fiksasi bagian beku
1) Setelah dipasang pada slide yang dilapisi 3-amino-propil-tri-etoksi-
silana (APES), bagian-bagian harus dikeringkan dengan udara di
bawah aliran udara selama 30-60 menit untuk memastikan
pengeringan sepenuhnya mungkin.
2) Simpan bagian pada -80 ° C sampai dibutuhkan. Untuk hasil
terbaik, gunakan segera.
3) Bila perlu, biarkan hangat pada suhu kamar selama 5 menit.
4) Siapkan fiksatif (aseton, metanol atau etanol) pada suhu kamar.
Untuk antibodi baru, kami sarankan mulai dengan tiga sisi:
a) Paraformaldehyde
b) Aseton
c) 1: 1 larutan aseton: alkohol (metanol atau etanol)
5) Perbaiki dengan fiksatif selama 15 menit, pada suhu kamar.
6) Bilas 3–4 kali dalam PBS.
7) Untuk fiksasi aseton, udara kering sepenuhnya selama 30 menit di
bawah aliran udara.
8) Lanjutkan dengan protokol pewarnaan imunohistokimia.
 17

Jika sampel jaringan difiksasi dengan fixative aldehyde

(paraformaldehyde, glutaraldehyde dll) untuk deteksi
imunofluoresensi, sertakan 0,3 M glisin dalam buffer blocking,
sebelum menggunakan antibodi primer. Glycine akan mengikat
kelompok aldehida bebas yang jika tidak akan mengikat antibodi
primer dan sekunder, menyebabkan latar belakang yang tinggi.
Latar belakang karena kelompok aldehida bebas lebih mungkin
terjadi ketika fiksatif glutaraldehyde atau paraformaldehyde.

c. Antibodi primer dan antibodi sekunder tidak kompatibel Gunakan

antibodi sekunder yang dibesarkan terhadap spesies di mana primer
dibesarkan (misalnya primer dibesarkan pada kelinci, gunakan
sekunder anti-kelinci). Pastikan isotipe primer dan sekunder
kompatibel (mis. IgY vs. IgG).
d. Tidak cukup antibodi primer yang terikat dengan protein yang
diminati Konsentrasikan antibodi lebih banyak, inkubasi lebih lama
(misalnya semalaman) pada suhu 4 ° C.
e. Kit antibodi / amplifikasi primer / sekunder mungkin telah kehilangan
aktivitasnya karena penyimpanan yang tidak tepat, pengenceran yang
tidak tepat atau pembekuan / pencairan yang ekstensif. Jalankan
kontrol positif untuk memastikan bahwa antibodi primer / sekunder
berfungsi dengan baik (lihat bagian 4 untuk informasi lebih lanjut
tentang kontrol).
f. Protein tidak ada dalam jaringan yang diinginkan. Jalankan kontrol
positif yang direkomendasikan oleh pemasok antibodi (lihat bagian 4
untuk informasi lebih lanjut tentang kontrol).
g. Protein yang diinginkan tidak banyak terdapat dalam jaringan
Gunakan langkah amplifikasi untuk memaksimalkan sinyal. Misalnya,
 18

gunakan antibodi sekunder terkonjugasi biotin dan streptavidin

terkonjugasi.
h. Antibodi sekunder tidak disimpan dalam gelap (jika sistem deteksi
Anda adalah imunofluoresensi). Selalu mencegah antibodi sekunder
dari paparan cahaya.
i. Deparaffinisasi mungkin tidak cukup. Deparasi bagian yang lebih
panjang dan gunakan xylene segar.
j. Prosedur fiksasi (menggunakan fiksatif formalin dan
paraformaldehyde) dapat memodifikasi epitop yang diakui antibodi
1) Gunakan metode pengambilan antigen yang berbeda untuk
membuka kedok epitop (panas dimediasi dengan buffer pH 6 atau
pH 9, enzimatik, dll.).
2) Perbaiki bagian untuk waktu yang lebih sedikit.
k. Protein terletak di dalam nukleus dan antibodi (protein nukleus) tidak
dapat menembus nucleus. Tambahkan zat permeabilisasi yang kuat
seperti Triton X ke buffer blocking dan buffer dilution antibody. Lihat
protokol kami tentang teknik permeabilisasi.
l. Buffer PBS terkontaminasi dengan bakteri yang merusak kelompok
fosfat pada protein yang diinginkan. Tambahkan 0,01% azide dalam
buffer penyimpanan antibodi PBS atau gunakan PBS steril segar.

Pewarnaan tidak spesifik

a. Konsentrasi antibodi primer / sekunder mungkin terlalu tinggi. Coba
kurangi konsentrasi antibodi dan / atau periode inkubasi. Bandingkan
intensitas sinyal terhadap sel atau jaringan yang tidak
mengekspresikan target.
b. Peroksidase endogen aktif. Gunakan inhibitor enzim, yaitu Levamisol
(2 mM) untuk alkaline phosphatase atau H 2 O 2 (0,3% v / v) untuk
peroksidase.
 19

c. Antibodi primer dinaikkan terhadap spesies yang sama dengan

jaringan yang ternoda (mis. Antibodi primer tikus yang diuji pada
jaringan tikus). Ketika antibodi sekunder diterapkan, ia berikatan
dengan semua jaringan saat diangkat terhadap spesies itu. Gunakan
antibodi primer terhadap spesies yang berbeda dari jaringan Anda.
Gunakan antibodi primer yang terbiotinilasi dan streptavidin
terkonjugasi untuk sistem deteksi.
d. Bagian / sel telah mongering. Jaga agar bagian / sel pada kelembaban
tinggi dan jangan biarkan mengering.

Menggunakan kontrol
a. Kontrol positif
Mengapa kontrol positif diperlukan:
Untuk memvalidasi pewarnaan dalam sampel Anda, gunakan kontrol
positif. Ini adalah bagian dari garis sel atau jaringan yang diketahui
mengekspresikan protein yang Anda deteksi. Hasil positif dari kontrol
positif, bahkan jika sampel negatif, akan menunjukkan prosedur
dioptimalkan dan berfungsi. Ini akan memverifikasi bahwa hasil
negatif apa pun valid.
b. Cara mengetahui jenis jaringan atau garis sel apa yang merupakan
kontrol positif yang sesuai:
1) Pertama periksa lembar data antibodi. Ini akan sering memberikan
kontrol positif yang disarankan. Selalu pastikan jaringan atau garis
sel yang Anda gunakan berasal dari spesies yang diuji.
2) Jika lembar data antibodi tidak mencantumkan kontrol positif,
kami merekomendasikan hal berikut dalam keadaan berikut:
a) Periksa untuk melihat apakah ada pembatalan untuk antibodi.
Setiap jaringan, sel atau lisat yang telah digunakan dengan
 20

sukses oleh pelanggan ini dapat dianggap sebagai kontrol

positif yang sesuai.
b) Coba lihat tautan basis data Swiss-Prot atau Omnigene pada
lembar data. Database ini akan sering memiliki daftar jaringan
tempat protein diekspresikan. Ini juga dapat dianggap sebagai
kontrol positif yang sesuai.
c) Periksa entri GeneCards untuk protein. Ini biasanya akan
memberi Anda tingkat ekspresi relatif di berbagai jaringan.
d) Periksa Atlas Protein Manusia untuk protein. Ini memiliki
database deteksi protein dalam berbagai jenis jaringan, kanker,
dan garis sel.
e) Jika Anda masih kesulitan menemukan kontrol yang sesuai,
sebaiknya lakukan pencarian literatur cepat di PubMed untuk
melihat jaringan dan sel mana yang mengekspresikan protein
yang diinginkan.
c. Contol negative
Mengapa kontrol negatif diperlukan:
Gunakan bagian dari garis sel atau sampel jaringan yang diketahui
tidak mengekspresikan protein yang Anda deteksi. Ini untuk
memeriksa hasil positif palsu dan tidak spesifik yang mengikat.
Sampel jaringan kontrol negatif yang direkomendasikan adalah sampel
jaringan knock down (KD) atau knock out (KO).
Tidak ada kontrol utama
1) Ini adalah ketika antibodi primer tidak ditambahkan ke sampel. Ini
menunjukkan jika ada pengikatan non-spesifik atau positif palsu
mungkin karena pengikatan non-spesifik dari antibodi sekunder.
2) Buffer pengenceran antibodi yang tidak mengandung antibodi
diinkubasi pada sampel yang sama dengan cara yang sama seperti
biasa.
 21

Kontrol isotipe
1) Kontrol isotipe adalah antibodi dari isotipe yang sama (IgG2a,
IgY, dll.), Klonalitas, konjugat, dan spesies inang sebagai antibodi
primer yang dinaikkan terhadap molekul yang tidak ada dalam
sampel yang Anda gunakan. Biasanya ini dinaikkan terhadap
bahan kimia atau protein non-mamalia.
2) Gunakan konsentrasi yang sama (μg / ml) untuk antibodi kontrol
isotipe dan antibodi primer. Ini akan menentukan tingkat latar
belakang dalam sampel Anda.
3) Sama seperti langkah kontrol tanpa-primer, Anda akan
menggunakannya pada sampel alih-alih antibodi primer spesifik.
Anda kemudian akan menggunakan antibodi sekunder seperti
biasa.

Kontrol untuk menggunakan garis sel transfected:

Kami sarankan untuk memasukkan kontrol endogen jika Anda
menguji sampel protein rekombinan. Ini harus menjadi bagian penting
dari rencana percobaan.
Ada kesulitan yang melekat dengan deteksi antibodi protein
rekombinan yang perlu dipertimbangkan:
1) Pelipatan protein rekombinan mungkin berbeda dari bentuk asli
endogen. Lipatan ini mungkin mencegah akses antibodi ke epitop.
Ini khususnya terjadi pada protein yang ditandai.
2) Selalu pastikan label ditempatkan pada ujung terminal N atau C
dari protein rekombinan. Yang paling penting, selalu pastikan
protein rekombinan mencakup urutan imunogen untuk antibodi
yang Anda gunakan.
 22

3) Kontrol positif endogen penting untuk memvalidasi hasil, serta

untuk menunjukkan seberapa baik reagen (misalnya antibodi)
dan prosedur bekerja.