BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi afinitas pertama kali ditemukan oleh Pedro Cautrecasas
dan Meir Wilcheck pada tahun 1968. kromatografi afinitas adalah teknik yang
berlaku digunakan untuk memurniakan protein. Hal ini dilakukan tergantung
pada keuntungan dari afinitas tinggi protein untuk kelompok kimia yang
spesifik. Metode ini umumnya digunakan untuk mengisolasi protein tertarik
dari kolom protein. Kolom diisi dengan mekanik-mekanik yang mengandung
residu glukosa kovalen terpasang. Hal ini diambil dengan pertimbangan
bahwa residu yang dipilih sesuia dengan protein target. Sebagai campuran
protein dituangka kedalam kolom, protein akan melakukan perjalanan
kebawah melalui mekanik-mekanik.
Protein target akan dilalui dan terjabak untuk kolom dengan ikatan
kovalen akrena afinitas untuk glukosa. Sisanya protein akan berjalan ke
kolom dan akan dipisahkan. Bagian buffer perlu ditambahkan ke kolom untuk
mencuci sepenuhnya protein tak terbatas. Terakhir larutan terkonsentrasi dari
glukosa untuk memisahkan protein target dari residu glukosa.
Kromotografi afinitas merupakan cara ampuh mengisolasi factor
transkripsi, protein yang mengatur ekspresi gen dengan cara mengikat
spesifik DNA. Protein dengan afinitas tinggi untuk urutan akan mengikat dan
dipertahankan. Dalam hal ini, factor transkripsi dilepaskan dengan mencuci
dengan larutan yang mengandung konsentrasi garam yang tinggi. Umumnya,
kromatografi afinitas akan dilakukan melalui kromatografi kolom. Pertama-
tama, kemampuan mengikat protein harus dipelajari. Kemudian medi padat
dimodifikasi dengan bahan pengikat dikemas dalam kolom kromatografi.
Kemudian campuran awal yang mengandung protein yang diinginkan
ditambahkan melalui kolom untuk memungkinkan terjadi pengikatan.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara pemisahaan dengan menggunakan metode kromatografi
afinitas?
2. Bagaimana aplikasi yang digunakan dalam kromatografi afinitas?

1.3 Tujuan Penulisan

Maksud dan tujuan dari makalah ini adalah untuk mengetahui cara
pemisahaan dengan menggunakan metode kromatografi afinitas dan
mengetahui bagaimana aplikasi yang digunakan dalam kromatografi afinitas.
 BAB II
KROMATOGRAFI AFINITAS

Kromatografi afinitas adalah metode pemisahan campuran

biokimia didasarkan pada interaksi yang sangat spesifik. Seperti
antara antigen dan antibodi, enzim dan substrat, atau reseptor
dan ligan.
Pemurnian enzim atau protein menggunakan teknik
kromatografi afinitas pada saat ini sangat populer dan menjadi
pilihan utama. Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas
enzim atau protein terhadap biomolekul lain (ligan), misalnya
enzim terhadap inhibitor, substrat atau produknya, afinitas
antibodi terhadap antigennya, atau afinitas hormon terhadap
reseptornya. Fase diam biasanya matriks gel, sering dari
agarosa; molekul gula linear yang berasal dari ganggang.
Biasanya titik awal adalah kelompok heterogen terdefinisi
molekul dalam larutan, seperti lisat sel, media pertumbuhan atau
serum darah.
Pemurnian dengan teknik kromatografi afinitas disebut
pemurnian satu tahap (one step purification) Dalam proses
pemurnian satu tahap menggunakan kromatografi afinitas
diperlukan interaksi spesifik antara protein rekombinan dengan
suatu ligan.
Pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-
kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan
untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat
kompleks.
 Skema yang paling umum untuk melakukan kromatografi
afinitas adalah dengan melakukan tahap elusi gradien, Elusi
gradien di definisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak
selama analisis kromatografi berlangsung, efek dari elusi gradien
adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa senyawa
yang tertahan kuat pada kolom
Skema ini melibatkan injeksi sampel ke dalam kolom
afinitas dengan adanya fase gerak (dengan pH yang tepat) dan
komposisi pelarut untuk ikatan solut-ligan.
Pelarut ini, yang menggambarkan fase gerak lemah pada
kolom afinitas, disebut dengan bufer aplikasi. Selama fase
aplikasi pemisahan, senyawa-senyawa yang komplemen dengan
ligan afinitas akan berikatan karena sampel dilewatkan kolom
dengan bufer aplikasi. Karena selektifitas interaksi solut-Iigan
yang tinggi, sampel-sampel lain yang tidak terikat akan melewati
kolom tanpa tertahan. Setelah komponen-komponen yang tidak
t'ertahan telah tercuci secara sempurna dari kolom, solut yang
tertahan dapat dielusi dengan menggunakan pelarut yang
mampu mengeluarkannya dari kolom atau yang mampu
memecah kompleks ligan-solut. Pelarut ini merupakan fase gerak
yang kuat dan seringkali dikenal sebagai baffer elusi. solut yang
dikehendaki keluar dari kolom, maka solut dapat diukur atau
dikumpulkan untuk penggunaan lebih lanjut. Kolom selanjutnya
diiregenerasi dengan cara mensetimbangkan kembali
menggunakan bufer aplikasi sebelum injeksi lanjut.
Komplementer molekul yang mengikat (ligan) pertama
kovalen digabungkan ke larut matriks, seperti kecil agarosa
manik-manik, dan matriks dituangkan ke dalam kolom. Suatu
campuran tidak murni mengandung protein untuk diisolasi ini
kemudian diterapkan pada kolom dan memungkinkan untuk
berinteraksi dengan ligan amobil Pada tahap ini, protein yang
akan diisolasi mengikat secara khusus untuk ligan amobil
sementara sisa molekul dalam aliran campuran melalui kolom.
Protein kepentingan kemudian dapat dielusi dari kolom di bawah
kondisi yang mengganggu interaksinya dengan ligan.
Bufer pengelusi mengandung zat yang berfungsi untuk
memutuskan ikatan antara protein yang akan diambil dengan
ligannya. Jadi, buffer pengelusi ini dapat berkompetisi tempat
dengan ligan terikat, sehingga protein lepas dan selanjutnya
keluar bersama eluen. Munculnya puncak pada grafik serapan
fraksi-fraksi protein hasil pemurnian tergantung pada bufer
pengelusi. Jika bufer pengelusi kurang kuat untuk memutuskan
ikatan antara ligan dengan protein, maka akan
terjadi tailing, yaitu puncak yang melebar. Selain itu, volume
matriks juga mempengaruhi lebarnya puncak, karena ligan yang
ada semakin banyak. Jadi, semakin besar volume matriks
semakin lebar puncak serapan, sehingga protein yang dihasilkan
lebih banyak.
Keterbatasan metode ini adalah protein rekombinan yang
akan dimurnikan harus berinteraksi secara spesifik dengan suatu
ligan. Jadi, jika tidak diketahui ligan yang dapat berinteraksi
secara spesifik maka tidak dapat dilakukan pemurnian satu
tahap. Namun Keterbatasan ini sekarang dapat diatasi dengan
adanya teknologi fusi protein. Idenya adalah membuat suatu
protein fusi yang terdiri dari protein yang akan dimurnikan
dengan protein yang diketahui dapat berikatan spesifik dengan
ligan tertentu.
Kromatografi Batch
Mengikat ke fase padat dapat dicapai dengan kromatografi
kolom dimana media padat dikemas ke kolom, campuran awal
dijalankan melalui kolom untuk memungkinkan pengaturan,
buffer mencuci dijalankan melalui kolom dan buffer elusi
kemudian diterapkan pada kolom dan dikumpulkan. Langkah-
langkah ini biasanya dilakukan pada tekanan ambien. Atau,
mengikat dapat dicapai dengan menggunakan pengobatan
batch, misalnya, dengan menambahkan campuran awal ke fase
padat dalam kapal, pencampuran, memisahkan fase padat,
menghilangkan fase cair, cuci, kembali pemusingan,
menambahkan buffer elusi, kembali mensentrifugasi dan
menghapus eluat tersebut. Kadang-kadang metode hybrid yang
digunakan sedemikian rupa sehingga mengikat dilakukan
dengan metode batch, tetapi fase padat dengan molekul target
terikat dikemas ke dalam kolom dan mencuci dan elusi dilakukan
pada kolom. Metode ketiga, memperluas tempat tidur adsorpsi,
yang menggabungkan keunggulan dari dua metode yang
disebutkan di atas, juga telah dikembangkan. Partikel fase padat
ditempatkan dalam kolom di mana fasa cair dipompa masuk dari
bawah dan keluar di bagian atas. Gravitasi dari partikel
memastikan bahwa fase padat tidak keluar kolom dengan fase
cair. Kolom afinitas dapat dielusi dengan mengubah konsentrasi
garam, pH, pI, biaya dan kekuatan ion secara langsung atau
melalui gradien untuk menyelesaikan partikel bunga.
Menggunakan spesifik
Kromatografi afinitas dapat digunakan dalam sejumlah
aplikasi, termasuk pemurnian asam nukleat, pemurnian protein
dari ekstrak bebas sel, dan pemurnian dari darah.
Immunoaffinity
Lain digunakan untuk prosedur adalah pemurnian afinitas
antibodi dari serum darah. Jika serum diketahui mengandung
antibodi terhadap antigen tertentu (misalnya jika serum berasal
dari organisme yang diimunisasi antigen bersangkutan) maka
dapat digunakan untuk pemurnian afinitas antigen itu. Hal ini
juga dikenal sebagai immunoaffinity Chromatography. Sebagai
contoh jika suatu organisme diimunisasi terhadap protein GST-
fusion akan menghasilkan antibodi terhadap fusi protein, dan
mungkin antibodi terhadap tag GST juga. Protein kemudian dapat
kovalen digabungkan ke dukungan yang solid seperti agarosa
dan digunakan sebagai ligan afinitas dalam pemurnian antibodi
dari serum kekebalan.
Untuk ketelitian protein GST dan protein GST-fusion
masing-masing dapat digabungkan secara terpisah. Serum ini
awalnya diizinkan untuk mengikat matriks GST afinitas. Ini akan
menghapus antibodi terhadap GST bagian dari protein fusi.
Serum tersebut kemudian lepas dari dukungan yang solid dan
memungkinkan untuk mengikat ke GST-fusion protein matriks.
Hal ini memungkinkan setiap antibodi yang mengenali antigen
yang akan diambil pada dukungan yang solid. Elusi antibodi
bunga yang paling sering dicapai dengan menggunakan buffer
pH rendah seperti pH glisin 2.8. Eluat yang dikumpulkan menjadi
netral tris atau penyangga fosfat, untuk menetralkan pH buffer
elusi rendah dan menghentikan degradasi aktivitas antibodi. Ini
adalah contoh yang bagus seperti pemurnian afinitas digunakan
untuk memurnikan protein GST-fusion awal, untuk menghapus
yang tidak diinginkan antibodi anti-GST dari serum dan untuk
memurnikan antibodi sasaran.
Sebuah strategi sederhana yang sering digunakan untuk
memurnikan antibodi yang dihasilkan terhadap antigen peptida.
Ketika antigen peptida yang diproduksi secara sintetis, residu
sistein terminal ditambahkan baik pada N atau C-terminus dari
peptida.
Residu sistein ini berisi gugus fungsional sulfhidril yang
memungkinkan peptida yang akan dengan mudah terkonjugasi
dengan protein pembawa (Keyhole limpet Hemocyanin (KLH).
Sama sistein yang mengandung peptida juga bergerak ke resin
agarosa melalui residu sistein dan kemudian digunakan untuk
memurnikan antibodi.
Kebanyakan antibodi monoklonal telah dimurnikan menggunakan
kromatografi afinitas berdasarkan-imunoglobulin spesifik Protein
A atau Protein G, berasal dari bakteri.
Protein Rekombinan
Mungkin penggunaan paling umum dari kromatografi
afinitas untuk pemurnian protein rekombinan. Protein dengan
afinitas yang dikenal adalah protein ditandai dalam rangka untuk
membantu pemurnian mereka. Protein mungkin telah
dimodifikasi secara genetik sehingga memungkinkan untuk
dipilih untuk afinitas mengikat; ini dikenal sebagai protein fusi.
Tags termasuk glutathione-S-transferase (GST), hexahistidine
(Nya), dan maltosa mengikat protein (MBP). Tag histidin memiliki
afinitas nikel atau kobalt ion yang telah bergerak dengan
membentuk ikatan kovalen koordinasi dengan chelator
tergabung dalam fase diam. Untuk elusi, jumlah kelebihan
senyawa dapat bertindak sebagai ligan ion logam, seperti
imidazole, digunakan. GST memiliki afinitas untuk glutathione
yang tersedia secara komersial bergerak sebagai glutathione
agarosa. Selama elusi, kelebihan glutathione digunakan untuk
menggantikan protein ditandai.
Lektin
Lectin kromatografi afinitas adalah bentuk kromatografi
afinitas mana lektin yang digunakan untuk memisahkan
komponen dalam sampel. Lektin, seperti Concanavalin A adalah
protein yang dapat mengikat karbohidrat tertentu (gula) molekul.
Aplikasi yang paling umum adalah untuk glikoprotein terpisah
dari protein non-glikosilasi, atau satu glycoform dari glycoform
lain.
TUJUAN
Tujuan dari kromatografi afinitas adalah untuk memisahkan
semua molekul dari kekhususan tertentu dari keseluruhan
seluruh molekul dalam campuran.
PRINSIP
Kromatografi afinitas adalah pengikatan spesifik ligan
dengan reseptor. Jadi, dalam kromatografi afinitas minimum
harus ada dua senyawa yang berikatan spesifik.

PENGGUNAAN
Kromatografi afinitas dapat digunakan untuk:
1. Memurnikan dan berkonsentrasi zat dari campuran ke
dalam larutan penyangga
2. Mengurangi jumlah zat dalam campuran
3. Membedakan apa yang mengikat senyawa biologis
untuk zat tertentu
4. Memurnikan dan berkonsentrasi larutan enzim.

PROSEDUR

Di siapkan kolom afinitas dengan matriks dan ligan yang

sesuai

Sampel Protein dimasukkan k kolom dan protein akan melalui saringan

matriks afinitas manik-manik.
Protein berinteraksi dengan afinitas ligan dengan beberapa
protein yang mengikat dengan erat, longgar dan tak
berikatan.

Protein yang tidak mengikat akan tercuci oleh buffer aplikasi.

Protein yang mengikat di cuci dengan buffer elusi.

Protein elusi yang mengikat erat ligan dan mengumpulkan
protein murni penting.
 BAB III
KESIMPULAN
Kromatografi afinitas adalah kromatografi yang digunakan
untuk menganalisi antigen dan antibodi, enzim dan substrat,
atau reseptor dan ligan. Dan dalam kromatografi afinitas ini
penggunaan nya adalah untuk memurnikan zat dari campuran ke
dalam larutan penyangga, mengurangi jumlah zat dalam
campuran, membedakan apa yang mengikat senyawa biologis
untuk zat tertentu, memurnikan dan berkonsentrasi larutan
enzim.
 DAFTAR PUSAKA

1. Day, R.A dan Underwood.1981. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi

Keepat.Jakarta:Erlangga soebagio, dkk.2002. kimia Analitik II.
Malang : FMIPA universitas negri malang.
2. Pharmacia Biotech, Amersham. 2011. Affinity
Chromatography. Bandung: RAL Design AB.