Novel Coronavirus dari Pasien dengan Pneumonia

di Tiongkok, 2019

Dokter Pembimbing : Dr. Katharina Setyawati, Sp.PD

Disusun oleh : Chyntia Septiana Putri
NIM : 2015730023

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH

JAKARTA
RSUD SYAMSUDIN, SH
ILMU PENYAKIT DALAM
2020
 RINGKASAN

Pada Desember 2019, sekelompok pasien dengan pneumonia yang penyebabnya tidak

diketahui dikaitkan dengan pasar grosir makanan laut di Wuhan, Cina. Betacoronavirus yang

sebelumnya tidak diketahui ditemukan melalui penggunaan sekuensing tidak bias dalam sampel

dari pasien dengan pneumonia. Sel epitel saluran napas manusia digunakan untuk mengisolasi

virus corona baru, bernama 2019-nCoV, yang membentuk clade lain dalam subgenus

sarbecovirus, subfamili Orthocoronavirinae. Berbeda dari MERS-CoV dan SARS-CoV, 2019-

nCoV adalah anggota ketujuh dari keluarga virus corona yang menginfeksi manusia.

Pengawasan yang ditingkatkan dan penyelidikan lebih lanjut sedang berlangsung. (Didanai oleh

Program Penelitian dan Pengembangan Kunci Nasional Tiongkok dan Proyek Utama Nasional

untuk Pengendalian dan Pencegahan Penyakit Menular di Tiongkok.)

kesehatan masyarakat.

Virus corona adalah virus RNA yang diselimuti yang didistribusikan secara luas di

antara manusia, mamalia lain, dan burung dan yang menyebabkan penyakit pernapasan, enterik,

hati, dan neurologis. Enam spesies virus korona diketahui menyebabkan penyakit pada manusia.

Empat virus - 229E, OC43, NL63, dan HKU1 - lazim dan biasanya menyebabkan gejala flu biasa

pada individu yang imunokompeten. Dua jenis lainnya - coronavirus sindrom pernafasan akut

yang parah (SARS-CoV) dan coronavirus sindrom pernapasan Timur Tengah (MERS-CoV) -

adalah zoonosis berasal dan telah dikaitkan dengan penyakit yang terkadang fatal. 5 SARS-CoV

tadinya agen penyebab dari wabah sindrom pernapasan akut yang parah pada tahun 2002 dan

2003 di Provinsi Guangdong, Cina. 6-8 MERS-CoV adalah patogen yang bertanggung jawab
untuk wabah penyakit pernapasan parah pada 2012 di Timur Tengah. 9 Mengingat tinggi

prevalensi dan distribusi luas coronavirus, keragaman genetik yang besar dansering rekombinasi

genom mereka, dan meningkatkan antarmuka manusia-hewankegiatan, virus corona baru

cenderung muncul secara berkala pada manusia karenasering terjadi infeksi lintas spesies dan

kejadian spillover.
Pada akhir Desember 2019, beberapa fasilitas kesehatan setempat melaporkanpasien dengan
pneumonia yang tidak diketahui penyebabnya yang secara epidemiologis terkait dengan
makanan laut dan pasar grosir hewan laut di Wuhan, Provinsi Hubei, Cina.

31 Desember 2019, Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit Tiongkok (Tiongkok) CDC)
mengirim tim tanggapan cepat untuk menemani provinsi Hubei dan Wuhan otoritas kesehatan
kota dan untuk melakukan penyelidikan epidemiologi dan etiologi.

Kami melaporkan hasil penyelidikan ini, mengidentifikasi meningkat sumber dari

kelompok pneumonia,dan menjelaskan coronavirus baru yang terdeteksi di pasien dengan
pneumonia yang spesimennya. diuji oleh CDC Cina pada tahap awalkejadian luar biasa. Kami
juga menggambarkan fitur klinis pneumonia pada dua pasien ini.

METODE

Metode diagnostic virus

Empat sampel saluran pernapasan bawah, termasukcairan bronchoalveolar-lavage, dikumpulkan

daripasien dengan pneumonia yang tidak diketahui penyebabnya diidentifikasi di Wuhan pada 21
Desember 2019,atau lambat dan siapa yang hadir di HuananPasar Seafood dekat dengan waktu

klinis merekapresentasi. Tujuh cairan bronchoalveolar-lavagespesimen dikumpulkan dari pasien

di Beijingrumah sakit dengan pneumonia yang diketahui penyebabnya berfungsi sebagai sampel

kontrol. Ekstraksi nukleatasam dari sampel klinis (termasuk yang tidak terinfeksi-budaya yang

berfungsi sebagai kontrol negatif)dilakukan dengan Asam Nukleat Viral Tinggi MurniKit,

seperti yang dijelaskan oleh pabrikan (Roche).Sampel asam nukleat yang diekstraksi diuji untuk

virus dan bakteri dengan reaksi rantai polimerasetion (PCR), menggunakan

RespiFinderSmart22kit(PathoFinder BV) dan LightCycler 480 real-waktu sistem PCR, sesuai

dengan pabrikaninstruksi turer. Sampel dianalisis untuk22 patogen (18 virus dan 4 bakteri)

sebagaiberekor dalam Lampiran Tambahan. Tambahan,tidak memihak, urutan tinggi, dijelaskan

sebelumnya, 13 digunakan untuk menemukan mikrobaquences tidak dapat diidentifikasi dengan

cara yang dijelaskan diatas PCR transkripsi balik waktu nyata (RT- PCR) assay digunakan untuk

mendeteksi viral load oleh tar- mendapatkan konsensus wilayah RdRp dari pan β-CoV,

dijelaskan dalam Lampiran Tambahan.

ISOLASI VIRUS

Sampel cairan bronchoalveolar-lavage dikumpulkan dalam cangkir steril yang ditambahkan

media pembawa virus. Sampel kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan puing seluler.

Supernatan diinokulasi pada sel epitel saluran napas manusia, 14 yang telah diperoleh dari

spesimen jalan nafas yang direseksi dari pasien yang menjalani pembedahan untuk kanker paru-

paru dan dikonfirmasi bebas patogen-khusus oleh NGS.13 Sel-sel epitel saluran napas manusia

diperluas pada substrat plastik untuk menghasilkan sel-sel 1 dan kemudian dilapisi pada
kerapatan 2,5 × 105 sel per sumur pada dukungan Transwell-COL (diameter 12-mm) permeabel.

Kultur sel epitel saluran napas manusia dihasilkan dalam antarmuka udara-cair selama 4 hingga

6 minggu untuk membentuk kultur terpolarisasi yang terdiferensiasi dengan baik yang

mengembang dalam epitel mukosiliar pseudostratifikasi insevo.13

Sebelum infeksi, permukaan apikal sel epitel saluran napas manusia dicuci tiga kali dengan

larutan salin fosfat; 150 μl supernatan dari sampel cairan bronchoalveolar-lavage diinokulasi ke

permukaan apikal kultur sel. Setelah inkubasi 2 jam pada suhu 37 ° C, virus yang tidak terikat

dihilangkan dengan cara mencuci dengan 500 μl larutan salin fosfat selama 10 menit; sel epitel

saluran napas manusia dipertahankan dalam antarmuka udara-cair yang diinkubasi pada suhu 37

° C dengan 5% karbon dioksida. Setiap 48 jam, 150 μl larutan salin fosfat diaplikasikan pada

permukaan apikal sel epitel saluran napas manusia, dan setelah 10 menit inkubasi pada suhu 37 °

C sampel dipanen. Sel epitel mukosiliar pseudostrat dipertahankan dalam lingkungan ini; sampel

apikal disalurkan dalam stok vial 1: 3 untuk sel-sel baru. Sel-sel dipantau setiap hari dengan

mikroskop cahaya, untuk efek sitopatik, dan dengan RT-PCR, untuk keberadaan asam nukleat

virus di supernatan. Setelah tiga bagian, sampel apikal dan sel epitel saluran napas manusia

dipersiapkan untuk mikroskop elektron transmisi.

MIKROSKOP ELEKTRON TRANSMISI

Supernatan dari kultur sel epitel saluran napas manusia yang menunjukkan efek sitopatik

dikumpulkan, dinonaktifkan dengan paraformaldehyde 2% selama setidaknya 2 jam, dan

ultrasentrifugasi ke partikel virus sedimen. Supernan yang diperkaya diwarnai negatif pada kisi-

kisi berlapis film untuk diperiksa. Sel-sel epitel saluran napas manusia yang menunjukkan efek
sitopatik dikumpulkan dan difiksasi dengan paraformaldehyde 2% -2,5% glutaral-dehyde dan

kemudian difiksasi dengan 1% osmium tetroxide didehidrasi dengan grade ethanol yang

disematkan dengan resin PON812. Bagian (80 nm) dipotong dari blok resin dan diwarnai dengan

uranyl asetat dan timbal sitrat, secara terpisah. Kisi-kisi bernoda negatif dan bagian ultrathin

diamati di bawah mikroskop elektron transmisi.

URUTAN GENOM VIRUS

RNA diekstrak dari bronchoalveolar-lavage flu- supernatan id dan budaya digunakan sebagai

suhupiring untuk mengkloning dan mengurutkan genom. Kita menggunakan kombinasi

sequencing Illumina dan sekuensing nanopore untuk mengkarakterisasi virus genom. Urutan

membaca disusun menjadipeta contig (satu set segmen DNA yang tumpang tindih) dengan

penggunaan perangkat lunak CLC Genomics, versi 4.6.1 (CLC Bio). Primer spesifik adalah

subsedirancang khusus untuk PCR, dan 5ʹ- atau 3ʹ- RACE (amplifikasi cepat ujung cDNA)

digunakan untukmengisi celah genom dari sel Sanger konvensional quencing. Produk PCR ini

dimurnikandari gel dan diurutkan dengan BigDye Termi-nator v3.1 Cycle Sequencing Kit dan

3130XL Penganalisis Genetik, sesuai denganinstruksi facturers '.

Perataan multi-urutan 2019-nCoV dan urutan referensi dilakukandengan penggunaan Otot.

Analisis filogenetik dari genom lengkap dilakukan denganRAxML (13) dengan 1000 bootstrap

danmodel pembalikan waktu umum yang digunakan sebagai model substitusi cleotide.

HASIL
Pasien

Tiga pasien dewasa mengalami pneumonia berat dan dirawat di rumah sakit di WUHAN pada

27 Desember 2019. Pasien 1 adalah wanita berusia 49 tahun, Pasien 2 adalah pria berusia 61

tahun, dan Pasien 3 adalah seorang pria berusia 32 tahun. Profil klinis tersedia untuk Pasien 1

dan 2. Pasien 1 melaporkan tidak memiliki kondisi medis kronis yang mendasari tetapi

melaporkan demam (suhu, 37 ° C hingga 38 ° C) dan batuk dengan ketidaknyamanan dada pada

23 Desember 2019. Empat hari setelah timbulnya penyakit, batuk dan rasa tidak nyaman di

dadanya memburuk, tetapi demamnya berkurang; diagnosis pneumonia didasarkan pada

pemindaian computed tomographic (CT). Pekerjaannya adalah pengecer di pasar grosir makanan

laut. Pasien 2 awalnya melaporkan demam dan batuk pada 20 Desember 2019; gangguan

pernapasan berkembang 7 hari setelah timbulnya penyakit dan memburuk selama 2 hari

berikutnya (lihat foto rontgen dada, Gbr. 1), saat ventilasi mekanik dimulai. Dia telah sering

berkunjung ke pasar grosir makanan laut. Pasien 1 dan 3 pulih dan dikeluarkan dari rumah

sakit pada 16 Januari 2020. Pasien 2 meninggal pada 9 Januari 2020. Tidak

ada spesimen biopsi yang diperoleh.

Gambar 1. Radiografi Dada.

Ditampilkan adalah foto rontgen dada dari Pasien 2 pada hari ke 8

Dan setelah timbulnya penyakit. Trakea diintubasi dan ventilasi mekanis dilembagakan dalam

periode antara akuisisi dua gambar. Kekeruhan halus bilateral hadir di kedua gambar tetapi

meningkat dalam kepadatan, kelimpahan, dan pertemuan di gambar kedua; perubahan ini paling

ditandai di bidang paru-paru bagian bawah. Perubahan yang konsisten dengan akumulasi cairan

pleura juga terlihat pada gambar kedua.

Efek sitopatik pada culture sel epitel pernafasan manusia setelah inokulasi dengan CO-
VID-19

DETEKSI DAN ISOLASI NOVEL CORONAVIRUS

Tiga sampel bronchoalveolar-lavage dikumpulkan dari Rumah Sakit Wuhan Jinyintan pada

tanggal 30 Desember 2019. Tidak ada patogen spesifik (termasuk HCoV-229E, HCoV-NL63,

HCoV-OC43, dan HCoV-HKU1) yang terdeteksi dalam spesimen klinis dari pasien ini oleh
RespiFinderSmart-22kit. RNA diekstraksi dari cairan bronchoalveolar dari pasien digunakan

sebagai sampel untuk mengkloning dan mengurutkan genom menggunakan kombinasi

sequencing Illumina dan sequencing nano-pori. Lebih dari 20.000 pembacaan virus dari masing-

masing spesimen diperoleh, dan sebagian besar pencocokan cocok dengan genom dari garis B

dari genus betacoronavirus - menunjukkan lebih dari 85% identitas dengan kelelawar seperti

SARS CoV (kelelawar-SL-CoVZC45, MG772933). 1) genom yang diterbitkan sebelumnya.

Hasil positif juga diperoleh dengan menggunakan uji RT-PCR real-time untuk penargetan RNA

ke wilayah konsensus RdRp dari pan β-CoV (meskipun nilai ambang batas siklus lebih tinggi

dari 34 untuk sampel yang terdeteksi). Isolasi virus dari spesimen klinis dilakukan dengan sel

epitel saluran napas manusia dan garis sel Vero E6 dan Huh-7. Virus yang diisolasi bernama

2019-nCoV.

Untuk menentukan apakah partikel virus dapat divisualisasikan dalam sel epitel saluran napas

manusia yang terinfeksi 2019-nCoV, kultur epitel saluran napas manusia yang terinfeksi mock

dan 2019-nCoV diperi

ksa dengan mikroskop cahaya setiap hari dan dengan mikroskop elektron transmisi 6 hari setelah

inokulasi. Efek sitopatik diamati 96 jam setelah inokulasi pada lapisan permukaan sel epitel

saluran napas manusia; kurangnya pemukulan cilium terlihat dengan mikroskop cahaya di tengah

fokus (Gbr. 2). Tidak ada efek sitopat spesifik yang diamati pada garis sel Vero E6 dan Huh-7

sampai 6 hari setelah inokulasi.

Mikrograf elektron partikel bernoda negatif 2019-nCoV umumnya bulat dengan beberapa

pleomorfisme (Gbr. 3). Diameter bervariasi dari sekitar 60 hingga 140 nm. Partikel virus

memiliki lonjakan yang cukup khas, sekitar 9 hingga 12 nm, dan memberikan virion

penampakan korona surya. Partikel-partikel virus bebas ekstraseluler dan badan-badan inklusi

yang diisi dengan partikel-partikel virus dalam vesikula yang terikat membran dalam sitoplasma
ditemukan di bagian ultrathin epitel saluran napas manusia. Morfologi yang diamati ini konsisten

dengan keluarga Coronaviridae.

Untuk lebih mengkarakterisasi virus, urutan nova gen 2019-nCoV dari spesimen klinis (cairan

bronchoalveolar-lavage) dan isolat virus sel epitel saluran napas manusia diperoleh oleh Illumina

dan sekuensing nanopore. Virus corona baru diidentifikasi dari ketiga pasien. Dua sekuens

koronavirus yang hampir penuh diperoleh dari cairan bronchoalveolar-lavage (BetaCoV / Wuhan

/ IVDC-HB-04/2020, BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-05/2020 | EPI_ISL_402121), dan satu

sekuens panjang penuh diperoleh dari virus yang diisolasi dari pasien (BetaCoV / Wuhan /

IVDC-HB-01/2020 | EPI_ISL_402119). Urutan geografis lengkap dari tiga novel coronavirus

dikirimkan ke GASAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01/2019, nomor akses:

EPI_ISL_402119; BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-04/2020, nomor aksesi: EPI_ISL_402120;

BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-05/2019,

Partikel 2019-nCoV bernoda negatif ditunjukkan pada Panel A, dan partikel 2019-nCoV di epitel
saluran napas manusia Bagian ultrathin sel ditunjukkan pada Panel B.

ID aksesi: EPI_ISL_402121) dan memiliki 86.9% identitas urutan nukleotida untuk kelelawar

yang sebelumnya diterbitkan SARS seperti CoV (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1) genom. Tiga

geen 2019-nCoV berkerumun bersama dan membentuk subclade independen dalam subbine

sarbecovirus, yang menunjukkan organisasi betacoronavirus khas: 5 ′ wilayah yang tidak

diterjemahkan (UTR), kompleks replase (orf1ab), gen S, E gen, gen M, gen N, 3 ′ UTR, dan

beberapa kerangka bacaan terbuka nonstruktural yang tidak dikenal.

Meskipun 2019-nCoV mirip dengan beberapa beta-koronavirus yang terdeteksi pada kelelawar

(Gbr. 4), ini berbeda dari SARS-CoV dan MERS-CoV. Tiga coronavirus 2019-nCoV dari

Wuhan, bersama dengan dua turunan mirip SARS kelelawar, ZC45 dan ZXC21, membentuk

clade berbeda dalam garis keturunan B dari subgenus sarbecovirus. Strain SARS-CoV dari

manusia dan coronavirus mirip SARS yang mirip secara genetik dari kelelawar yang

dikumpulkan dari Cina barat daya membentuk clade lain dalam subgenus sarbecovirus. Karena

identitas urutan dalam domain replikasi terkonservasi (ORF 1ab) kurang dari 90% antara 2019-

nCoV dan anggota lain dari betacoronavirus, 2019-nCoV - agen penyebab kemungkinan

pneumonia virus di Wuhan - adalah betacoronavirus novel milik sarbecovirus subgenus dari

keluarga Coronaviridae.

DISKUSI

Kami melaporkan CoV baru (2019-nCoV) yang diidentifikasi pada pasien yang dirawat di rumah

sakit di Wuhan, Cina, pada bulan Desember 2019 dan Januari 2020. Bukti keberadaan virus ini
termasuk identifikasi dalam cairan bronchoalveolar-lavage pada tiga pasien secara keseluruhan.

sekuensing genom, PCR langsung, dan kultur. Penyakit yang kemungkinan disebabkan oleh CoV

ini dinamai “novel pneumonia-terinfeksi pneumonia” (NCIP). Genom lengkap dikirim ke

GASAID. Analisis filogenetik mengungkapkan bahwa 2019-nCoV masuk ke dalam genus

betacoronavirus, yang meliputi coronaviavies (SARS-CoV, kelelawar CoV seperti SARS, dan

lainnya) yang ditemukan pada manusia, kelelawar, dan hewan liar lainnya.15 Kami melaporkan

isolasi virus dan deskripsi awal tentang efek sitopatik spesifik dan morfologi.

Teknik molekuler telah digunakan secara sukses

Gambar 4. Analisis filogenetik 2019-nCoV dan Genom Betacoronavirus Lainnya di

Subfamili Orthocoronavirinae.

untuk mengidentifikasi agen infeksi selama bertahun-tahun. Urutan yang tinggi, hasil yang tinggi

adalah alat yang ampuh untuk penemuan patogen.14,16 Generasi berikutnya dan bioinformatika
mengubah cara kita merespons wabah penyakit menular, meningkatkan pemahaman kita tentang

kejadian penyakit dan transgenik. misi, mempercepat identifikasi patogen, dan mempromosikan

berbagi data. Kami menjelaskan dalam laporan ini penggunaan teknik molekuler dan sekuensing

DNA yang tidak bias untuk menemukan betacoronavirus novel yang kemungkinan menjadi

penyebab pneumonia berat pada tiga pasien di Wuhan, Cina.

Meskipun membangun kultur sel epitel saluran nafas manusia adalah padat karya, mereka

tampaknya menjadi alat penelitian yang berharga untuk analisis patogen pernapasan manusia.14

Penelitian kami menunjukkan bahwa perbanyakan awal sekresi pernapasan manusia ke kantung

sel epitel saluran napas manusia mendatang, diikuti oleh salinan elektron transmisi dan

sekuensing genom seluruh kultur supernatan, berhasil digunakan untuk visualisasi dan deteksi

human coronavirus baru yang mungkin dapat menghindari identifikasi dengan pendekatan

tradisional.

Pengembangan lebih lanjut dari metode yang akurat dan cepat untuk mengidentifikasi patogen

pernapasan yang tidak diketahui masih diperlukan. Atas dasar analisis dari tiga genom lengkap

yang diperoleh dalam penelitian ini, kami merancang beberapa tes spesifik dan sensitif yang

menargetkan daerah ORF1ab, N, dan E dari genom 2019-nCoV untuk mendeteksi viral load

dalam spesimen klinis. Perangkat primer dan prosedur operasi standar telah dibagikan dengan

Organisasi Kesehatan Dunia dan dimaksudkan untuk pengawasan dan deteksi infeksi 2019-

nCoV secara global dan di Cina. Data terbaru menunjukkan deteksi 2019-nCoV di 830 orang di

Cina.17

Meskipun penelitian kami tidak memenuhi postulat Koch, analisis kami memberikan bukti yang

mengimplikasikan 2019-nCoV dalam wabah Wuhan.

Bukti tambahan untuk mengkonfirmasi signifikansi etiologis 2019-nCoV dalam wabah Wuhan

termasuk identifikasi antigen 2019-nCoV dalam jaringan paru-paru pasien dengan analisis
imunohistokimia, deteksi antibodi antivirus IgM dan IgG dalam sampel serum dari pasien pada

dua titik waktu untuk menunjukkan konversi, dan percobaan hewan (monyet) untuk memberikan

bukti patogenisitas. Yang sangat penting adalah investigasi epidemiologis untuk

mengkarakterisasi mode transmisi, interval reproduksi, dan spektrum klinis yang dihasilkan dari

infeksi.

untuk menginformasikan dan memperbaiki strategi yang dapat mencegah, mengendalikan, dan

menghentikan penyebaran 2019-nCoV.