BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Diagram Alir Penelitian

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

3.2.1 Alat

1. Bunsen/ lampu spirtus 19. Blender

2. Ose 20. Lidi kapas steril

3. Ose disposible 21. Kertas merang dan label

4. Otoklaf 22. Spidol

5. Tabung reaksi 23. Bak perwarnaan

6. Objek glass 24. Labu erlenmeyer

7. Cover glass 25. Neraca analitik

8. Pembuat lubang/perforator 26. Batang pengaduk

9. Rak tabung reaksi

10. Cawan petri

11. Pipet ukur

12. Gelas ukur

13. Pipet tetes

14. Gelas kimia

15. Micropipet

16. Tip kuning

17. Kain kasa

18. Evaporator
3.2.2 Bahan

1. Nutrien Agar ( NA) 12. NaOH 10%

2. Thiosulfate-citrate-bile salts- 13. HCl pekat

sucrose agar ( TCBS agar) 14. Serbuk Mg

3. Muller Hinton Agar 15. Pereaksi Smith-Metacalfe

4. NaCl 0,85% 16. FeCl3 1%

5. Stain Murni Vibrio Cholerae 17. Asetat Anhidrat

6. Biji Pare (Momordica charantia 18. H2SO4 pekat

L) 19. Pewarna safranin

7. Larutan BaCl2 1% 20. Iodium

8. Larutan H2SO4 1 % 21. Kristal violet

9. Alkohol 70% p.a. 22. Kapas

10. Pereaksi Wagner 23. Aquadest steril

11. Pereaksi Meyer

3.3 Prosedur Kerja dan Pengumpulan Data

3.3.1 Prosedur Kerja

Prosedur kerja yang dilakukan dalam penelitian ini adalah:

A. Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Pare

 1. Di cuci hingga bersih biji pare kemudian dikeringkan dengan cara

diangin-anginkan kurang lebih selama 3 hari.

2. Dihancurkan biji pare dengan menggunakan blender kemudian diayak.

3. Ditimbang sebanyak 200 gr serbuk biji pare lalu ditambahkan pelarut

etanol 70% dimasukan ke dalam wadah, ditutup dan dibiarkan selama

dua hari terlindung dari cahaya sambil diaduk, disaring sehingga

didapat maserat.

4. Ampas dimaserasi dengan etanol 70% menggunakan prosedur yang

sama, maserasi dilakukan sampai diperoleh maserat yang jernih.

5. Semua maserat etanol digabung dan diuapkan dengan evaporator pada

suhu ±40 C hingga diperoleh ekstrak etanol kental.

A. Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Pare

1. Di cuci hingga bersih biji pare kemudian dikeringkan

2. Dihancurkan buah pare dengan menggunakan blender kemudian

diayak.

3. Ditimbang sebanyak 200 gr serbuk buah pare lalu ditambahkan pelarut

etanol 70% dimasukan ke dalam wadah, ditutup dan dibiarkan selama

dua hari terlindung dari cahaya sambil diaduk, disaring sehingga

didapat maserat.

4. Ampas dimaserasi dengan etanol 70% menggunakan prosedur yang

sama, maserasi dilakukan sampai diperoleh maserat yang jernih.

 5. Semua maserat etanol digabung dan diuapkan dengan evaporator pada

suhu ±40 C hingga diperoleh ekstrak etanol kental.

C. Pembuatan ekstrak etanol buah biji pare dalam berbagai

konsentrasi

1. Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan.

2. Disiapkan 4 tabung reaksi steril

3. Ditambahkan 5,0 ml ektrak etanol biji pare pada tabung ke 1 dan ke 2

4. Ditambahkan 5,0 ml aquadest steril pada tabung ke 2, ke 3, dan ke 4

5. Dikocok tabung ke 2 hingga homogen

6. Dipipet 5,0 ml larutan tabung ke 2 kemudian Dipindahkan ke tabung ke 3.

kocok hingga homogen

7. Diulangi langkah ke 6 untuk tabung selanjutnya.

8. Dibuang 5,0 ml larutan pada tabung ke 4.

9. Dilakukan tahap yang sama untuk ekstrak buah pare.

Ekstrak 5,0 ml Ekstrak 5,0 ml Aqua 5,0 ml Aqua 5,0 ml

+ Aqua 5,0 ml

Gambar 3.1 Skema Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak etanol

Biji Pare
 D. Pembuatan kultur Vibrio Cholerae

Dibuat suspensi Vibrio chelerae dengan NaCl 0,85%, dihomogenkan.

Kemudian digoreskan atau ditanam suspensi bakteri yang homogen dengan ose

steril pada media NA ( Nutrien Agar). Diinkubasi sediaan bakteri pada inkubator

350- 370 C selama 1 minggu.

E. Pembuatan larutan standar Mc. Farland 0,5

Membuat BaCl2 1% dan H2SO4 1% kemudian memipet 0,05 ml BaCl2

1% dan 9,95 ml H2SO4, kemudian homogenkan. Sehingga diperoleh volume

larutan BaSO4 10 ml. Kekeruhan BaSO4 yang terbentuk dijadikan standar

terhadap kekeruhan suspensi bakteri. Mc. Farland 0,5 yang setara dengan jumlah

kuman 106 CFU/ml.

F. Pembuatan suspensi Vibrio Cholerae Mc. Farland 0,5

Dipipet 5,0 ml NaCl 0,85% yang telah disterilkan, kemudian dimasukkan

ke dalam tabung reaksi steril. Kemudian dimasukkan 1-2 ose bakteri dengan

menggunakan ose, kocok sampai homogen hingga didapat kekeruhan yang sama

dengan larutan standar Mc. Farland 0,5.

G. Uji Fitokimia terhadap ekstrak buah dan biji pare

 Uji fitokimia yang akan dilakukan meliputi uji alkaloid, uji flavonoid, uji
tanin, uji saponin, uji terpenoid dan uji steroid

Uji alkaloid

Sebanyak 1 g sampel dilarutkan dengan kloroform dan beberapa

tetes NH4OH kemudian disaring dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak
kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2M lalu
lapisan asamnya dipisahkan dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini
diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Dragendorf, Mayer
dan Wagner yang akan menimbulkan endapan dengan warna berturut turut
merah jingga, putih dan coklat.

Uji flavonoid

Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dalam aquades kemudian

dipanaskan selama 5 menit, lalu disaring dengan menggunakan kertas
saring. Sebanyak 5 ml filtrat hasil penyaringan ditambahkan serbuk
magnesium (0,5 g), 1 ml HCl pekat dan amil alkohol, kemudian dikocok
kuat-kuat. Terbentuknya warna merah, kuning dan jingga pada lapisan amil
alkohol menunjukkan adanya golongan flavonoid.

Uji tanin

Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dalam aquades kemudian

dipanaskan selama 5 menit, lalu disaring dengan menggunakan kertas
saring. Sebanyak 5 ml filtrat hasil penyaringan ditambahkan 3 tetes FeCl3
10%. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan
terdapatnya tanin.

Uji saponin
 Sebanyak 5 g sampel dilarutkan dalam aquades kemudian
dipanaskan selama 5 menit, lalu disaring dengan menggunakan kertas
saring. Sebanyak 10 ml filtrat hasil penyaringan digunakan untuk pengujian.
Uji saponin dilakukan dengan pengocokan 10 ml filtrat ke dalam tabung
tertutup selama 10 menit. Timbulnya busa hingga selang waktu 10 menit
(buih stabil) menunjukkan adanya saponin.

Uji terpenoid dan steroid

Sebanyak 2 g sampel dilarutkan dengan 25 ml etanol panas (50 0C)

kemudian disaring ke dalam pinggan porselin dan diuapkan sampai kering.
Residu ditambahkan 1 ml dietil eter dandihomogenasikan, ekstrak dietileter
dipindahkan ke dalam lempeng tetes lalu ditambahkan 1 tetes anhidrida
asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat (Uji Liemerman-Buchard). Warna
merah atau ungu menunjukkan kandungan triterpenoid sedangkan warna
hijau atau biru menunjukkan kandungan steroid.

H. Pengujian daya antibakteri ektrak etanol buah dan biji pare

(Momordica charantia L) terhadap pertumbuhan Vibrio Cholerae

Pengujian daya antibakteri ektrak etanol biji pare (Momordica charantia

L) terhadap pertumbuhan Vibrio Cholerae dilakukan dengan metode difusi agar:

Kontrol positif (+) : Tetrasiklin

Kontrol negatif (-) : Aquadest

1. Disiapkan ektrak etanol biji pare dengan konsentrasi 100%,

50%, 25% dan 12,5% masing- masing sebanyak 5 mL.

 2. Buat suspensi bakteri dengan standar Mc Farland 0,5

3. Dimasukkan kapas steril kedalam suspensi bakteri, lalu ratakan

pada Muller Hinton Agar.

4. Dibuat lubang pada media agar dengan diameter ±8mm secara

aseptik. (maksimal 4 lubang pada setiap plat agar)

5. Ditambahkan 200 uL masing masing konsentrasi ektrak etanol

biji pare pada setiap lubang secara aseptik

6. Dilakukan tahap yang sama untuk ekstrak buah pare.

7. Diinkubasi pada suhu 350-370 C (suhu inkubator) selama 2-3

hari.

8. Diamati dan diukur terbentuknya zona bening disekitar cakram.

Pengamatan dilakukan setiap hari.

3.3.2 Pengumpulan Data

Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah primer. Data diambil dari

hasil Uji daya antibakteri ektrak etanol biji pare (Momordica charantia L)

terhadap pertumbuhan Vibrio Cholerae dengan berbagai konsentrasi pengenceran

ekstrak. Data yang di peroleh disajikan dalam bentuk tabel .

Data hasil penelitian yang diperoleh kemudian dianalisa dengan uji

statistik Anova dan Regresi Linier. Uji anove digunakan untuk melihat perbedaan
antar konsentrasi sedangkan uji regresi linier digunakan untuk melihat pengaruh

konsentrasi infusum terhadap diameter daya hambat.