TEKNIK PEMBUATAN SEDIAAN (PREPARAT )UNTUK PEMERIKSAAN SITOLOGI

DANPEMERIKSAAN HITILOGI DI LABORATORIUM PATOLOGI ANATOMI

Patologi Anatomi adalah spesialis medis yang melakukan diagnosis penyakit berdasarkan

pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, molekul atas organ, jaringan, dan sel. Yang melakukan
diagnosis penyakit berdasarkan patologi anatomi adalah Spesialis patologi anatomi.
Spesialis patologi anatomi mendiagnosis penyakit seseorang berdasarkan pemeriksaan
laboratorium. Ada beberapa teknik pemeriksaan di laboratorium patologi anatomi
diantaranya pemeriksaan Histologi (morfologi jaringan) atau Sitologi (Morfologi sel). Pada
pemeriksaan lab analis kesehatan (teknisi laboratorium) bertugas membuat sediaan/preparat
jaringan atau sel yang didapat dari si pasien. Sediaan harus dibuat sebaik mungkin agar spesialis
dapat melakukan diagnosis yang akurat.Disini akan diuraikan secara singkat teknik pembuatan
sediaan pemeriksaan sitologi dan pemeriksaan histologi dilaboratorium Patologi Anatomi.

A.Sediaan untuk Pemeriksaan Sitologi

Pada pemeriksaan sitologi yang diperiksa morfologi sel-sel cairan tubuh. Sediaan atau disebut
duga preparat dibuat berupa apusan pada objek glass yang diwarani dengan pewarnaan tertentu.
 
1.Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Giemza
Tujuan : Terutama yang diperiksa adalah detail dari morfologi untuk memeriksa intisel, untuk
melihat apakah sel tersebut sel normal, sel noeplasma jinak atau ganas.
Sampel : Aspirasi Jarum Halus (AJH), Endapan cairan yang telah disentrifuge

Bahan :
 -Larutan pewarna giemza
 -Larutan Phosfat buffer (ph 6,8)
 -Methanol
Prosedur kerja :
1. Sediaan apus telah benar-benar kering di udara
2. Fiksasi dengan methanol minimal 5 menit
3. Cuci dengan aquadest, biarkan kering di udara
4. Tetesi dengan pewarna Giemsa dengan perbandingan (GZ : Bufer phosfat = 1:4)
5. Cuci dengan aquadest, kering diudara
6. Tutup EZ Mount
 
2.Sediaan/preparat dengan pewarnaan metode Papaniculo
Metode ini umumya digunakan untuk pewarnaan Papsmear (tapi terkadang ada juga selain papsmear diwarnai
dengan metode ini).Papsmear digunakan untuk mendignosis Kanker serviks. Melihat ada
tidaknya sel ganas
Sampel : apusan daerah peralihan endoserviks.
Bahan
:-Haematoksilin mayer 
-EA (Eosin alkohol) 65/EA 36
- Alkohol 95% dan Alkohol absolut
 Untuk EA 65 isinya: Eosine Y, Phospotung stic acid, light green, alk. Absolute
 
Prosedur Kerja :
1. Sedian apusan difiksasi dengan alcohol 95% 15 menit
2. Air mengalir sampai bebas alkohol 5 menit (rak preparat diletakan di wadah yang di beri air
mengalir)
3. Mayer haematoksilin 3-5 menit
4. Air Mengalir 15 menit
5. – Alkohol 95% 10 kali celup
Alkohol 95% 10 kali celup
6. EA 3-5 menit
7. –Alkohol 95% 5 kali celup
 Alkohol 95% 5 kali celup
 Alkohol absolute 5 kali celup
8. Keringkan diudara
9. Xylol/clearing
10. Tutup dengan EZ mount
Hal-hal yang harus diperhatikan untuk pembuatan sediaan/preparat papsmear:
1. Pengambilan sampel harus mendapat sel-sel endoserviks sel-sel metaplasia dan sel-sel skuamosa (komponen
daerah peralihan), harus sedikit mungkin mengandung darah.
2. Sediaan harus segera difiksasi dengan alkohol 95%. Preparat yang kering belum difiksasi
akan menyebabkan sel-sel rusak. Apabila tempat pengecatan jauh, setelah difiksasi keringkan dan masukkan
ke wadah yang dapat menjaga keamanan sediaan.
3. Jika menggunakna hairspray tidak boleh terlalu dekat, karena akan menghapus atau tidak
terfiksasi dengan baik.
Kesalahan pada kriteria yang diatas bisa menyebabkan negatif palsu.
Kesalahan pada pewarnaan dan screening dapat menyebabkan positif palsu
.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pembuatan sediaan sitologi dan fiksasinya:
1. Objek glass harus benar-benar bersih, terus beri nomor sesuai data biar tidak tertukar,
2. ¾ luas kaca objek memanjang, kita apus merata,tidak terlalu tebal dan terlalu tipis
3. Segera fiksasi sesuai dengan pewarnaan yang akan digunakan
4. Untuk cairan, disentrifuge dahulu dan kemudian diambil untuk diproses
5. Untuk bahan sputum diambil bagian berwarna dan kental untuk dibuat pulasan. Bagian yang lain bisa
gunakan sebagai sel blog.
 
B.Sediaan untuk Pemeriksaan Histologi
1. Tahap periksaan dimulai dari penerimaan sampel di tata usaha. Petugas penerima harus mengecek
kembali sampel tidak boleh asal terima.
 Jaringan atau organ yang diterima harus dalam keadaan terfiksasi dengan formalin
buffer10%(perbandingan jaringan dan cairan fiksasi, 1:9 ) dan ditutup rapat.
 * Buffer formalin 10% :
1. formaldehid 40% H.CHO = 100 ml
2. Sodium Phospat monobasic NaH2PO4.H2O = 4 gram
3. Sodium Phopat dibasic Na2HPO4 = 6.5 gram
4. Aquadest = 900 ml
 Identitas pasien harus dilengkapi seperti, nama, umur, jenis kelamin, alamat, pekerjaan,
riwayat penyakit, Dibagian yang ingin diperiksa.
Jenis sampel sampel harus di Cross check, apa sama jenis sampel yang ditulis dengan yang
diterima
Dan harus di tanya bagaimana menyampaikan hasil pemeriksaan, Jika pasien ingin mengambil sampel
sendiri harus ada surat pengantar.
Nama dan alamat dokter pengirim sampel harus ada,
Dokter pengirim harus diingatkan jika ada yang tidak sesuai kriteria.
2. Pemeriksaan Makroskopis
Pemeriksaan makaroskopis dilakukan oleh dokter tugas analis kesehatan/teknisi laboratorium
mendampingi dokter, melakukan pencatatan hasil pemeriksaan dokter.Pada tahap ini dokter
juga akan memotong jaringan yang dicurigai
3. Processing Jaringan
Untuk prosessing jaringan memakai alat yang bekerja ± 18,5 jam (bisa
diubah sesuai kebutuhan). Tahapan prosessing jaringan yaitu, Fiksasi, Dehidrasi, clearing dan
infiltrasi paraffin

Tahapan kerja pada Tissue Automatics Prosessor 

1. Fiksasi
 Botol 1. Buffer Formalin 10% 2 jam
2. Dehidrasi
Botol 2. Alkohol 70% 1,5 jam
Botol 3. Alkohol 80% 1,5 jam
Botol 4. Alkohol 95% 1,5 jam
Botol 5. Alkoho absolute I 1,5 jam
Botol 6. Alkoho absolute II 1,5 jam
Botol 7. Alkoho absolute III 1,5 jam
3. Clearing
Botol 8. Xylol I 1 Jam
Botol 9. Xylol II 1,5 Jam
Botol 10. Xylol III 1,5 Jam
4. Infiltrasi paraffin
Botol 11. Paraffin cair I 1,5 jam
Botol 12. Paraffin cair II 2 jam
jumlah 18,5 jam
 
Fiksasi
Tujuan : Untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi
dan mencegah terjadi dialysis atau pembengkakan pada rupture.
Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan rumus:
d = k √t
d = ketebalan jaringan (mm)
t = waktu yang dibutuhkan/tersedia
k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi)
Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78

Dehidrasi
Tujuan : untuk menghilangkan/menarik air dalam jaringan dengan cara mulai konsentrasi
terendah sampai konsentrasi tinggi.

Clearing
Tujuan : Menarik keluar kadar alcohol yang berada dalam jaringan, memberi warna yang bening pada jaringan
dan juga sebagai perantara mesuknya kedalam paraffin.
Zat yang sering dipakai Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol,dll.
Untuk jaringan otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform.
 
Infiltrasi paraffin
Tujuan : Mengisi rongga atau pori-pori yang ada pada jaringan setelah setelah ditinggal cairan
sebelumnya(xylol).
Jumlah waktu : 18,5 Jam

4. Pengeblokkan
Tujuan : Agar mudah dipotong menggunakan mikrotom untuk mendapatkan irisan jaringan yang sangat
tipis (sesuai yang diharapkan).
Cara Kerja :
1. Hangatkan paraffin cair, pinset, dan penutup cetakan
2. Parafin cair dituangkan kedalam cetakan
3. Jaringan dari prosessing dimasukkan kedalam cetakan yang telah disi paraffin cair, tekan jaringan agar
semakin menempel di dasar cetakan.
 4. Tutup cetakan diambil, letakkan diatas cetakan dan di tekan.Pasang etiket di pinggir.
5. Biarkan sampai membeku
6. Setelah beku, keluarkan dari cetakan. Rapikan sisi-sisi blog. Ganti etiket dengan yang
permanen
5. Pemotongan dengan Mikrotom
Cara kerja :
1. Sebelum pemotongan Masukkan kedalam plastik yang diisi air dan letakkan di freezer ±15
menitatau diberi batu es.
2. Blok dijepit pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikrotom.
Kemiringan : ±300
Tebal blok paraffin ±2-5mikron.
3. Hasil pemotongan (berupa pita/irisan tipis yang saling bersambung) dimasukkan kedalam water bath
yang diisi air yang sudah dihangatkan 500 C, kemudian diambil dengan kaca objek (Meletakkan
potongan di water bath tidak boleh terbalik).
Cttn : Pisau dan water bath bisa diberi alcohol 50% untuk menurunkan tegangan permukaan
yang membantu merentangkan pita.
Objek glass jangan diolesi albumin gliserin karena biasanya albumin bila diinkubasi akan
mengeras.menjaga agat jangan lepas saat pengecatan

6. Inkubasi
Tujuan : Menguapkan air yang terbawa oleh hasil potongan hingga jaringan menempel lebih
kuat.
Cara kerja : inkubasi preparat di atas hot plate dengan suhu±500C (dibawah titik cair paraffin)
selama15 menit.
 Sebaiknya dialasi dengan kertas merang.
 Untuk pengecatan imunnohistokima inkubasi 390C selama 1 malam
7. Pengecatan
Umumnya dalam pengecatan histopatologi digunakan cat Hetatoxylin-Eosin (HE) disamping
catkhusus (PAS, gomori, ZN, Malory, dll) dan cat yang lebih khusus yaitu immune histokimia
(ER, PR,CD20, LMP, dll)
Proses pengecatan :
1. Deparafinisasi
Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3 menit
Setelah itu dilap pinggir jaringan dengan kain kasa.
2. Rehidrasi
Preparat masuk ke alcohol 100%, 95%, 80%, 70% masing-masing 2 menit
3. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit
(air mengali ditampung dalam wadah )
Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup
4. Pengecatan Inti 7 menit
 Preparat masuk ke dalam Meyer hematoksilin
5. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit
(air mengali ditampung dalam wadah )
Sebelumnya celup kedalam dua mangkok air 3 celup
6. Counter Stain
Preparat masuk ke larutan eosin 7 celup
7. Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup
8. Dehidrasi
Preparat masuk ke dalam alcohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup
Setelah itu Dilap dengan kain kasa sekitar jaringan dan tunggu sampai kering
9. Clearing
Preparat masuk Ke Xylol I, dan II masing-masing 2 menit
10. Mounting
11. Preparat diberi 1 tetes entelan dan ditutup objek glass
Keterangan:
Deparafinisasi
Tujuanya : Berfungsi melarutkan/melepaskan paraffin yang melekat pada preparat.
Rehidrasi
Berfungsi menghilangkan xylol yang terbawa oleh preparat dan memasukan air kedalam jaringan
Air mengalir
Melepaskan sisa cat atau cairan yang terbawa sebelumnya
Meyer Hematoksilin
Memberikan warna biru pada inti sel
Eosin
Memberi warna merah pada sitoplasma, jaringan ikat,dll
Dehidrasi
Melepaskan air yang terbawa preparat
Clearing
Melepaskan alcohol yang terbawa oleh preparat dan memberi warna bening pada preparat
Mounting
Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan pengawet jaringan dari mikroba dan bakteri.

Teknik Pembuatan Sediaan Histologi:

1. Pengambilan Bahan
 Mengambil bahan dari tubuh hewan yang masih hidup atau selembat-lambatnya 4 jam post-
mortem, untuk menghindari terjadinya pencernaan oleh enzim (autolisis) atau bakteri.
2. Fiksasi
Untuk mencegah terjadinya post mortem, mengeraskan jaringan supaya mudah dipotong.
Bahan untuk larutan fiksasi adalah formalin 10%, mercuri bichloride, kalium bichloride,
osmic acid, pieric acid, aceticacid, ethyl alcohol, larutan buoin dan lainnya.
3. Dehidrasi
Bertujuan untuk menarik air dari jaringan dan diganti dengan alkohol. Caranya jaringan
dimasukkan ke dalam alkohol dengan konsentrasi meningkat yaitu dari 70% sampai alkohol
absolut.
4. Penjernihan (Clearing)
Bertujuan agar jaringan menjadi transparan.Menggunakan xylol, toliol, chloroform, benzene,
cedaroil.
5. Pengeblokan (Embedding)
Bertujuan untuk menginfiltrasi parafin ke dalam jaringan. Caranya memasukkan potongan
jaringan dan parafin dalam oven agar parafin mencair kemudian dilakukan pencetakan.
6. Pemotongan (Sectioning)
Blok parafin yang sudah siap dipotong menjadi tipis yang disebut ribbon menggunakan
mikrotom setebal 3-10 mikron. Masukkan ke water bath agar mencegah terjadinya artefak
lipatan dan mencairkan paraffin yang terpotong dalam jaringan. Kemudan jaringan diletakkan
dalam obyek glass.
7. Pengecatan (Staining)
Bertujuan untuk memberikan kontras alamiah yang sudah ada dan untuk menonjolkan sel,
jaringan dan bahan eksentrik yang hendak diteliti. Pada umumnya bahan cat larut dalam air,
maka parafin yang tersisa harus dibersihkan dengan xylol, kemudian alkohol dengan
konsentrasi menurun (dari alkohol absolut ke alcohol 70%) bertujuan memasukkan air ke
dalam jaringan kembali
8. Penutupan sediaan (mounting)
Setelah dicat maka kelebihan cat dibersihkan dengan air atau alkohol kemudian diberikan
balsam Canada satu tetes, ditutup dengan cover glass.