See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.

net/publication/226080314

Agrobacterium mediated transformation of indica rice (Oryza sativa L.) for

insect resistance

Article in Euphytica · May 2011

DOI: 10.1007/s10681-010-0308-7

CITATION READS
S
625
16

2 authors, including:

Sebastin Raveendar
National Academy of Agricultural Science (South Korea)
55 PUBLICATIONS 274 CITATIONS

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Chloroplast Genome Sequencing View project

DNA barcode for RDA Genebank accessions View project

All content following this page was uploaded by Sebastin Raveendar on 31 October 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

2Euphytica (2011) 179:277–286 Euphytica (2011) 179:277–286

DOI 10.1007/s10681-010-0308-7

Agrobacterium mediated transformation of indica rice

(Oryza sativa L.) for insect resistance
S. Ignacimuthu • S. Raveendar

Received: 17 June 2010 / Accepted: 11 November 2010 / Published online: 25 November 2010
Springer Science+Business Media B.V. 2010

Abstract The leaffolder padi (RLF), Cnaphalocrocis Plant Biotechnology Unit, Entomology Research Institute,
medinalis adalah hama penting dari beras yang Loyola College, Chennai 600 034, Tamil Nadu, India
e-mail: entolc@hotmail.com
menyebabkan kerusakan parah di banyak wilayah di
dunia. Tanaman ditransformasikan dengan urutan S. Raveendar
e-mail: raveendars@gmail.com
kode Cry1C sintetik yang dimodifikasi penuh
(dioptimalkan kodon) serta dengan gen hpt dan gus,
masing-masing mengkode untuk hygromycin
phosphotransferase dan b-glucuronidase. Urutan
Cry1C ditempatkan di bawah kendali promotor 35S
dua kali lipat ditambah urutan pemimpin AMV, dan
gen hpt dan gus yang didorong oleh promotor virus
mosaik kembang kol 35S, digunakan dalam penelitian
ini. Kalus embriogenik setelah kokultivasi dengan
Agrobacterium dipilih pada media yang mengandung
hygromycin B. Sebanyak 67 tanaman yang tahan
hygromycin diregenerasi. Analisis PCR dan Southern
blot pada transforman primer mengungkapkan
integrasi stabil dari urutan pengkodean Cry1C ke
dalam genom padi dengan integrasi salinan tunggal
yang dominan. Tanaman turunan R1 mengungkapkan
pola monogenik (3: 1) dari segregasi transgen
sebagaimana dikonfirmasi oleh analisis molekuler.
Garis transgenik ini sangat tahan terhadap leaffolder
padi (RLF), Cnaphalocrocis medinalis seperti yang
diungkapkan oleh bioassay serangga.

S. Ignacimuthu (&) S. Raveendar

123 123
 3Euphytica (2011) 179:277–286 Euphytica (2011) 179:277–286

Keywords Rice (Oryza sativa) Agrobacterium menemukan bahwa penggerek batang

transformation Cry1C hpt Gene transfer
Transgenic plants Insect resistance
menyebabkan kehilangan hasil.
losses of

Introduction
Padi (Oryza sativa) adalah tanaman
pangan yang paling banyak dikonsumsi
dan ditanam di 152 juta hektar di seluruh
dunia (FAO 2007). Secara global lebih
dari 3 miliar orang dari Asia dan negara-
negara lain bergantung pada beras (Oryza
sativa, L.) sebagai makanan pokok
mereka, dan pada tahun 2025 sekitar
60% lebih banyak beras harus diproduksi
untuk memenuhi kebutuhan populasi
yang tumbuh (Khush 1997).
Produktivitas padi dipengaruhi oleh
berbagai faktor biotik dan abiotik.
Sekitar 52% dari produksi global beras
hilang setiap tahun karena kerusakan
yang disebabkan oleh faktor biotik, yang
hampir 21% disebabkan oleh serangan
hama serangga (Brookes dan Barfoot
2003). Kompleks hama padi di Asia
bervariasi secara substansial dengan area
geografis dan sistem produksi (Savary et
al. 2000). Keragaman besar serangga
memakan tanaman, di antaranya spesies
Hemiptera, Diptera, Lepidoptera, dan
Coleoptera adalah hama yang memiliki
signifikansi regional atau lokal (Dale
1994). Sejumlah spesies Lepidoptera
yang memberi makan daun muncul
dalam beras, yang paling penting adalah
leaffolders, Cnaphalocrocis medinalis
dan Marasmia spp. (Pyralidae). Analisis
empiris produksi beras di seluruh Asia

123 123
4Euphytica (2011) 179:277–286 Euphytica (2011) 179:277–286

2,3%, tertinggi untuk kelompok serangga mana pun

(Savary et al. 2000). Kehilangan hasil karena folder Cry1C gene in alfalfa and tobacco, and the transgenic
daun umumnya kecil karena tanaman padi pada tahap
pertumbuhan vegetatif memiliki kapasitas besar untuk
mengkompensasi kerusakan dedaunan. Namun,
kerusakan folder daun sangat terlihat oleh petani dan
seringkali merupakan stimulus paling penting untuk
aplikasi insektisida (Matteson 2000). Selain kerugian
hasil kumulatif yang diakibatkan oleh tingkat
infestasi kronis, wabah penggerek batang dan folder
daun dapat menyebabkan kerugian lokal yang lebih
tinggi. Meskipun pengendalian bahan kimia terhadap
hama serangga adalah pilihan yang efektif, paling
sering biayanya mahal dan terutama tergantung pada
kondisi cuaca. Juga ada banyak kekhawatiran tentang
penggunaan pestisida secara sembarangan pada
umumnya, dan insektisida pada khususnya.
Kekhawatiran ini termasuk pengembangan resistensi
pada hama target, efek merugikan pada serangga non-
hama dan menguntungkan, kontaminasi aliran air dan
keracunan hewan yang lebih tinggi (Desneux et al.
2007). Dengan demikian, adopsi kultivar tahan
serangga telah dianggap sebagai strategi yang paling
ekonomis dan ramah lingkungan untuk pengelolaan
hama. Selama beberapa tahun terakhir keberhasilan
dalam mengembangkan tanaman tanaman tahan
serangga melalui transfer gen telah mengesankan.
Tanaman padi transgenik pertama dengan toksin Bt
yang tahan serangga dilaporkan oleh Fujimoto et al.
(1993). Varietas padi Bt tahan terhadap folder daun
padi (Cnaphalocrocis medinalis, RLF), stemborer
bergaris (Chilo supressalis), dan stemborer kuning
(Scirpophaga incertulas) (Nayak et al. 1997; Cheng et
al. 1998; Shu et al. 2000; Tu et al. 2000; Ye et al.
2001, 2003; Bashir et al. 2005; Ramesh et al. 2004).
Gen lain seperti racun laba-laba, aglutinin, snow drop
lectin (GNA) telah digunakan untuk memberikan
ketahanan terhadap folder daun, penggerek batang
bergaris, kutu daun dan wereng coklat padi masing-
masing (Qiu et al. 2001; Khan et al. 2006; Ye et al.
2009a, b; Xiaofen et al. 2001). Beberapa laporan
memberikan laporan terperinci tentang manfaat
ekonomi, lingkungan dan kesehatan dari berbagai
tanaman transgenik tahan serangga (James 2005;
Ferry et al. 2006; Rahman et al. 2007; Gatehouse,
2008; Xia et al. 2010). Toksin Cry1C efektif terhadap
berbagai hama lepidopteran, termasuk stembor beras,
folder daun dan tidak berbagi tempat pengikatan yang
sama dengan racun Cry1A (Tang et al. 2006;
Alcantara et al. 2004). Strizhov et al. (1996)
menyatakan dimodifikasi

123 123
 5Euphytica (2011) 179:277–286 Euphytica (2011) 179:277–286

tanaman menunjukkan peningkatan resistensi beberapa situs kloning pCAMBIA1305.1,

terhadap cacing daun kapas Mesir (Spodoptera menghasilkan
littoralis) dan ulat grayak bit. Cao et al. (1999) the
mengubah brokoli dengan gen Cry1C yang
dimodifikasi, dan tanaman transgenik menunjukkan
resistensi yang tinggi terhadap ngengat punggung
berlian (Plutella xylostella). Baru-baru ini padi
japonica yang tahan serangga dikembangkan
menggunakan gen Cry1C sintetis yang ditemukan
sangat tahan terhadap stemborers dan folder daun (Ye
et al. 2009a, b; Zaidi et al. 2009). Oleh karena itu,
akan muncul bahwa toksin Cry1C dapat menjadi
alternatif potensial untuk toksin Cry1A dan juga
dapat dikombinasikan dengan gen Cry1A lainnya.
Penelitian ini berkaitan dengan transformasi
Agrobacterium yang dimediasi dari kultivar padi
komersial IR64 yang rentan terhadap serangga folder
daun padi (RLF) menggunakan gen Cry1C.

Materials and methods

Pembentukan kultur jaringan

Kultivar padi indica: IR64 digunakan dalam penelitian

ini. Bibit yang sehat, matang, sehat didisinfeksi dengan
70% (v / v) etanol selama 1 menit, diikuti dengan
pencucian dengan larutan air segar 0,1% (w / v) HgCl2
selama 5 menit, dan akhirnya dibilas lima kali dengan
air suling steril. Benih ditempatkan pada media MS
(Murashige dan Skoog 1962) (Raveendar et al. 2008)
pada 25 ± 2 C dalam gelap untuk menginduksi
perkembangan kalus dari jaringan skutel. Optimalisasi
awal seperti sensitivitas hygrocinin dan pemilihan
media regenerasi yang tepat dilakukan. Regenerasi
kalus dilakukan pada media MS. Media MS terdiri dari
garam dasar MS? Benzylamino-purine (BAP) 2,0 mg /
l? kinetin 1,0 mg / l? Asam 1-naphthaleneacetic
(NAA) 0,5 mg / l (Raveendar et al. 2008). Planlet
Regenerasi ditanam dan berakar dalam media padat
MS yang mengandung NAA 0,5 mg / l dan kemudian
dipindahkan ke tanah.

Agrobacteruim tumefaciens, strain, plasmid

dan kultur

Codon dioptimalkan kaset gen Cry1C untuk ekspresi

dalam tanaman (ganda promotor 35S? Penambah
AMV - Cry1C-nos terminator) dimasukkan ke dalam

123 123
27
Euphytica (2011) 179:277–286 27
Euphytica (2011) 179:277–286
9 9

Fig. 1 The construct

cloned in pCAMBIA
1305.1

pembentukan plasmid pCAMBIA1305.1 / Cry1C prolin, 2,5 mg / l 2,4-D, 30 g / l sukrosa, 7 g / l agar,

(Gbr. 1). Plasmid dimasukkan ke dalam strain pH 5,7 (CIM)] mengandung 500 mg / l sefotaksim
Agrobacterium LBA4404 yang dilucuti dengan selama 1 minggu pertumbuhan kalus
metode pembekuan beku (Holster et al. 1978) dan
dikonfirmasi dengan analisis penyelamatan dan
pembatasan plasmid. Sebuah koloni tunggal
Agrobacterium diambil dalam 3 ml kultur cair (kaldu)
dari media AB (Chilton et al. 1974). 300 ll inokulum
diinokulasi dalam 30 ml medium AB cair dengan
kanamycin 50 mg / l dan rifamycin 10 mg / l. Kultur
di atas diinkubasi pada suhu 28 C semalam dengan
rotary shaker. Hari berikutnya kepadatan optik (OD)
dari kultur Agrobacterium diperiksa di A600 dan
kultur yang menunjukkan OD dalam kisaran 0,6-1,0
dipilih. Kultur disentrifugasi selama 10 menit pada
6.000 rpm pada 20 C untuk membuat sel. Pelet yang
dihasilkan dilarutkan dalam 10-15 ml (tergantung
pada ukuran pelet) media pra-induksi cair [media AA
(Toriyama dan Hinata1985), 20 g / l sukrosa, 1 mg / l
2,4-D, aseto- ringone (AS) 200 lM, pH 5,5 (AA-AS)]
dan diinkubasi pada suhu 28 C selama 30 menit untuk
studi transformasi.

Kultivasi, seleksi dan regenerasi tanaman

Kalus direndam dalam suspensi bakteri selama 30

menit, dikeringkan dengan kertas saring steril untuk
menghilangkan bakteri berlebih. Kemudian kalus
dipindahkan ke selembar kertas saring yang
ditempatkan pada media coculture [(garam MS utama,
garam MS kecil, vitamin MS, 300 mg / l kasein
acidhydrolysate, 500 mg / l-prolin, 2,5 mg / l 2, 4-D,
30 g / l sukrosa, 7 g / l agar, pH 5,5, 200 lM
acetosyringone (CIM-AS)] Pelat disegel dengan
parafilm. Kultivasi dilakukan dalam gelap pada suhu
25 C selama 3 hari. Kalus yang diberi label sebagai
kontrol tidak terinfeksi Agrobacterium, setelah
kokultivasi, kalus yang terinfeksi dicuci 3-5 kali
dengan air deionisasi steril yang mengandung 500 mg /
l se-taxime untuk membunuh Agrobacterium, kalus
yang diinokulasi pertama kali dipindahkan ke induksi
kalus. [garam MS utama, garam MS kecil, vitamin
MS, 300 mg / l kasein acidhydrolysate, 500 mg / l L-

123 123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286 28
Euphytica (2011) 179:277–286
0 0
tanpa seleksi dan kemudian dipindahkan ke media
pemilihan [(garam MS utama, garam MS kecil,
vitamin MS, 300 mg / l kasein acidhydrolysate, 500
mg / l L-prolin, 2,5 mg / l 2,4-D, 30 g / l sukrosa, agar
7 g / l, pH 5,7, ditambah 50 mg / l hygromycin dan
500 mg / l sefotaksim (CIM-CCH)] .Setelah tiga
putaran seleksi, setiap 2-3 minggu, kalus yang
resisten dipindahkan ke regenerasi sedang [garam
besar MS, garam MS kecil, vitamin MS, 300 mg / l
kasein acidhydrolysate, 500 mg / l, L-prolin, 30 g / l
sukrosa, 2 mg / l BAP dan 1 mg / l kinetin, 0,5 mg / l
l NAA, 7 g / l agar, pH 5,7 ditambah 250 mg / l
sefotaksim dan 30 mg / l higromisin (RE2-CCH)]
untuk pengembangan tunas.T tunas yang diregenerasi
selanjutnya dipindahkan ke media RE2-CCH untuk
pembentukan planlet penuh dan kemudian berakar
pada media MS.Setelah rooting, tanaman transgenik
dipindahkan ke rumah kaca dan tumbuh menjadi
dewasa.

Uji histokimia untuk gen GUS

Uji histokimia dari ekspresi gen GUS (b-D-

glucuronidase) dilakukan pada eksplan kalus beras
dengan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glukouride (X-
Gluc) sebagai substrat dengan metode yang telah
ditetapkan (Jefferson 1987). Eksplan beras transgenik
putatif diinkubasi dalam buffer natrium fosfat (50
mM NaPO4, pH 6,8) yang mengandung 1% Triton X-
100 pada 37 C selama 1 jam dan kemudian diinkubasi
semalam dalam larutan yang mengandung 1,0 mM X-
Gluc, 10 mM ETDA, 100 Mm NaH2PO4, 0,1 9
Triton X-100 dan 50% metanol (pH 5,8). Jaringan
dicuci dua kali dalam 99% metanol selama 2 jam.
Jumlah jaringan yang bernoda biru dihitung sebagai
GUS positif..

Analisis PCR tanaman transgenik putatif

Analisis PCR dilakukan dengan menggunakan primer

berikut (50 primer, 50 -CCA TGG AGG AGA ACA
ATC AGA ACC AGT G-30; 30 primer, 50 -GGA
TCC TAC TTT TGT GCT CTT TCA AGG TC-30);
(50 primer, 50 -AAA GCC TGA ACT CAC CGC-30;
30 primer, 50 -GCT TTC CAC TAT CGG CGA-30).
Primer ini memperkuat fragmen 1,9 kb dari the

123 123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286
1 1
Gen Cry1C dan 1,1 kb masing-masing dari gen hpt.
Analisis PCR dilakukan dalam volume reaksi 25 ll
yang berisi DNA genom templat (100 ng), 2,5 ll 10 9
buffer amplifikasi PCR, 0,5 ll 10 mM dNTPS, 1,2 ll
50 mM MgCl2, 3 lM (2,5 ll) dari setiap primer, 13,6
ll air suling steril, 1 unit (0,20 ll polimer DNA Taq
(Genei). Sampel dipanaskan hingga 94 C selama 5
menit dan kemudian mengalami 30 siklus 30 detik
leleh pada 94 C, 30 anil pada 60 C dan 1 menit
sintesis pada 72 C dan diikuti oleh perpanjangan 10
menit terakhir pada 72 C. Produk yang diamplifikasi
diuji dengan elektroforesis pada 0,8% gel agarosa,
diwarnai dengan etidium bromida (EtBr; 0,5 lg / ml),
divisualisasikan dan difoto di bawah sinar ultraviolet.
Hibridisasi selatan
using
T0 transforman menjadi sasaran analisis hibridisasi
Southern blot menggunakan urutan pengkodean gen
Cry1C. Analisis Southern blot dilakukan dengan
menggunakan DNA genom dari transforman putatif
(T0) positif untuk PCR dan tanaman kontrol yang
tidak ditransformasi. DNA dicerna dengan HindIII;
analisis blot dilakukan menggunakan sepuluh
mikrogram DNA genom. DNA yang dicerna
diselesaikan pada 0,8% gel agarosa. DNA
dipindahkan ke membran nilon bermuatan negatif
(sesuai instruksi pabrik) untuk analisis hibridisasi
Selatan (Selatan 1975). Urutan pengkodean gen
Cry1C diberi label dengan biotin-11-dUTP
menggunakan kit pelabelan biotin decalabel DNA
(Ilmu Fermentas Life) dan digunakan sebagai probe.
Blot menjadi sasaran deteksi oleh pengembangan
warna semalam menggunakan kit deteksi kromogenik
biotin (ilmu Fermentas Life).
Bioassay serangga
Larva folder daun (Cnaphalocrocis medinalis)
dikumpulkan dari sawah di distrik Thiruvallur dan
dipelihara di serangga kami. Daun dari tanaman
berumur 40 hari dicuci di air suling, dikeringkan, dan
123
28
Euphytica (2011) 179:277–286
70% kelembaban relatif. Setelah 72 jam, kematian
serangga dicatat dan karakteristik dan perilaku larva
ditentukan. Persentase kerusakan area daun dihitung
dengan mengukur total luas daun sebelum dan
sesudah bioassay. Setiap percobaan dilakukan tiga
kali.
Data analysis
Semua percobaan dilakukan dalam desain acak
lengkap. Analisis statistik dilakukan oleh ANOVA.
Least Significant Difference (LSD) dihitung untuk
menemukan signifikansi. Multiple range test (DMRT)
Dun-can pada P = 0,05 digunakan untuk
membandingkan rata-rata setiap perawatan.
Results
Transformasi dan regenerasi padi
empat bagian hpt5 encoding hygromycin
cm ditempatkan phosphotrans-
di pertridih dilapisi
dengan kertas saring lembab. Empat larva instar
kedua dilepaskan ke setiap lempeng. Larva kelaparan
selama 5 jam sebelum dilepaskan, dan larva masing-
masing dicatat panjangnya. Pelat diinkubasi pada 28 ±
1 C dalam kegelapan dan Gen untuk
sebelum dilepaskan, dan panjang dan berat masing-
masing larva dicatat. Pelat diinkubasi pada 28 ± 1 C
dalam kegelapan dan The gene forh sebelum
dilepaskan, dan panjang dan berat masing-masing
larva dicatat. Pelat diinkubasi pada 28 ± 1 C dalam
kegelapan dan
Gen untuk ferase memberikan resistensi terhadap
hygromycin. Untuk menentukan dosis mematikan
hygromycin pada jaringan beras, kurva pembunuhan
ditetapkan untuk kalut scutellar dengan berbagai
konsentrasi hygromycin. Media seleksi berisi media
basal MS umum yang dilengkapi dengan 2,5 mg / l
2,4-D dan dengan berbagai konsentrasi hygromycin.
Eksplan diinokulasi pada media seleksi dan
diinkubasi selama 1 bulan. Pengamatan dilakukan
setelah 1 bulan untuk melihat efek antibiotik pada
eksplan. Perbanyakan dan status fisiologis kalus
secara signifikan dipengaruhi oleh kadar hygromycin
antara 30 dan 50 mg / l. Media yang dilengkapi
dengan 50 mg / l hygromycin memiliki efek yang baik
123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286 28
Euphytica (2011) 179:277–286
2 2
yang menunjukkan total pembunuhan eksplan setelah
1 bulan inkubasi. Di antara berbagai konsentrasi
hygromycin yang digunakan, konsentrasi 50 mg / l
dipilih untuk pemilihan transplantasi. Konsentrasi
hygromycin yang lebih tinggi menginduksi nekrosis
eksplan dengan sangat cepat dan mengurangi tingkat
kelangsungan hidup eksplan. Gen Cry1C
diperkenalkan ke dalam kalus embriogenik yang
berasal dari eksplan skutellum dari kultivar IR64
dengan metode transfer gen yang dimediasi
Agrobacterium. Sebanyak tiga percobaan
transformasi dilakukan untuk menentukan efisiensi
transformasi. Kalut Scutellum digabungkan dengan
LBA4404

123 123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286
3 3
(pCAMBIA1305.1 / Cry1C) selama 3 hari
menghasilkan kalus yang tahan terhadap higromisin
setelah 42 hari dalam media pemilihan (CIM-CCH)
yang mengandung 50 mg / l hygromycin, 250 mg / l
karboksilin, dan 500 mg / l sefotaksim (Gbr. 2a).
Setelah 42 hari seleksi, kalus yang resisten terhadap
higromisin dihilangkan dan disubkulasi dalam media
seleksi baru (Gbr. 2b). Pertumbuhan kalus yang tidak
terinfeksi Agrobacium secara efektif dihambat dalam
medium yang mengandung 50 mg / l hygromycin
(kontrol negatif). Kalus kontrol positif (tidak
terinfeksi Agrobactium) secara efisien berkembang
biak dalam media induksi kalus tanpa adanya
hygromycin. Frekuensi tinggi kalus yang resisten
terhadap higromisin diamati dalam tiga percobaan
berbeda (Tabel 1). Dari 212 kalus yang
dikolaborasikan dalam tiga percobaan, 101 kalus
yang tahan terhadap higromi diperoleh dengan
persentase keseluruhan sebesar 47,6. Sebagian besar
kalus yang resisten terhadap higromisin menunjukkan
pewarnaan biru untuk aktivitas GUS dalam uji
histokimia (Gambar 2c).
Gambar. 2 Agrobacterium yang dimediasi transformasi beras
(Oriza sativa L. cv. IR64). Kalus yang resisten terhadap
Hygromycin dari eksplan scutellum beras (Oriza sativa L. cv.
123
28
Euphytica (2011) 179:277–286
Setelah 63 hari seleksi, resistansi hygromycin dan
kalus positif GUS dipindahkan ke media regenerasi
yang mengandung 30 mg / l hygromycin dan 250 mg /
l sefotaksim. Kelompok tunas kecil diamati pada kalus
yang ditransformasi setelah 3 minggu pertumbuhan
dan kalus regenerasi disubkultur dalam medium
regenerasi segar dan dipertahankan selama 3 minggu
(Gbr. 2d). Dalam tiga percobaan independen, total 67
tanaman tahan higromisin diregenerasi dari 101 kalus
(Gbr. 2e). Setelah 6 minggu pada media regenerasi,
planlet tersebut di-root pada media rooting. Planlet ini
dikeraskan dan dipindahkan ke kondisi lapangan untuk
mengatur benih (Gbr. 2f). Kultivar ini (IR64)
menunjukkan frekuensi transformasi 25,6-31,4%
(Tabel 1).
PCR dan analisis selatan tanaman
transgenic
Total DNA dari lima transforman putatif IR64
menjadi sasaran analisis PCR dengan hpt dan Cry1C
IR64) setelah 21 hari dibiakkan dalam media seleksi. B
Proliferasi kalus tahan higromisin beras (Oriza sativa L. cv.
IR64) setelah subkultur dalam media pilihan. C Ekspresi gen
123
28
Euphytica (2011) 179:277–286 28
Euphytica (2011) 179:277–286
4 4
GUS yang stabil pada kalus yang resisten terhadap higromisin, beras (Oriza sativa L. cv. IR64) setelah kultivasi dengan
diinduksi dari eksplan skutel LBA4404 (pCAMBIA1305.1 / Cry1C). D Regenerasi eksplan
of kalus beras (Oriza sativa L. cv. IR64) setelah 21 hari kultur
dalam media seleksi. E Proliferasi pucuk padi yang tahan
higromisin (Oriza sativa L. cv. IR64) setelah subkultur dalam
media rooting. F Tanaman yang ditransformasi (Oriza sativa L.
cv. IR64) pada saat jatuh tempo

123 123
28
Euphytica (2011) 179:277–286 28
Euphytica (2011) 179:277–286
5 5

Table 1 Summary of genetic transformation of IR64 rice calli explants by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pCAM-
BIA1305.1/Cry1C)
Rice cultivar Number of scutellum derived calli
LBA4404 (pCAMBIA1305.1/Cry1C)
Experiment Cocultivated (A) Produced Produced Produced HyR and Transformation
number HyR calli HyR plants GUS ? plants (B) efficiency (%) (B/A)

IR64 1 54 26 21 17 31.4
2 82 39 22 21 25.6
3 76 36 24 23 30.2

genes primers. All the five putative transformants 1 kb ladder; lane 1, pCAMBIA1305.1/Cry1C plasmid as
were found to be positive for the amplification of positive control; lanes 2–6, putative transgenic plants of
IR64; lane 7, non-transformed plant as negative control
1.1 kb (Fig. 3a) and 1.9 kb (Fig. 3b) of hpt and
Cry1C genes respectively. A similar band was also
observed in the positive plasmid control, while no
such band was noticed in the untransformed control.
This indicated that the tissues were completely free of
Agrobacterium.
Primarily Southern hybridization analysis was
performed to confirm T-DNA integration of trans-
gene. Primary transformants (R0) of the cultivars
IR64 (5 lines) were subjected to genomic Southern
hybridization. The coding sequences of Cry1C were
used as probes for T-DNA integration analysis
(pCAMBIA1305.1/Cry1C). Genomic DNA (10 lg)

Fig. 3 A PCR Analysis of transgenic plants. 1.1 kb fragment

within the hpt gene was amplified by PCR from the DNA
isolated from putative transgenic plants. M, 1 kb ladder; lane 1,
pCAMBIA1305.1/Cry1C plasmid as positive control; lane 2,
non-transformed plant as negative control; lanes 3–7, putative
transgenic plants of IR64. B PCR Analysis of transgenic plants.
1.9 kb fragment within the Cry1C gene was amplified by PCR
from the DNA isolated from putative transgenic plants. M,

123 123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286
6 6
from GUS and PCR positive rice plants was digested
with HindIII and EcoRI enzymes, which released an
internal fragment of expected size of 2.9 kb Cry1C
gene along with double 35S CaMV promoter plus
AMV enhancer. The Cry1C gene sequence was
detected as a fragment of expected size (2.9 kb) in
transformed plants (Fig. 4a). Cry1C probe hybridized
to genomic DNA from transgenic plants but not to
DNA from untransformed control plants. This result
indicated that Cry1C DNA was incorporated into rice
genome.
To assess the copy number of transgene, genomic
DNA (10 lg) from GUS and PCR positive rice plants
was digested with HindIII, which released a left
border fragment containing Cry1C gene at one end
and the other end connected with genomic DNA.
Here all the hybridization signals from plant DNA
were larger than 4 kb as the HindIII site was located
at a distance of 4 kb from the left border of T-
Fig. 4 Analisis Southern blot tanaman padi transgenik R0.
Sebuah fragmen gen Cry1C berlabel Biotin berlabel 2.9
digunakan untuk menyelidiki DNA genom yang diisolasi dari
daun garis transgenik dan nontransgenik. DNA genom dicerna
dengan enzim restriksi HindIII dan EcoRI, difraksionasi
dengan elektroforesis, ditransfer ke membran nilon, dan
dibiarkan hibridisasi dengan gen Cry1C bersama dengan
promotor, promotor 35M CaMV plus penambah AMV (HindIII
dan fragmen EcoRI pCAMBIA1305.1 / Cry1C plasmid). Nama
Garis ditampilkan di bagian atas. Nama jalur yang disingkat
adalah: jalur 1, pCAMBIA1305.1 / Cry1C plasmid yang
dicerna ganda dengan EcoRI dan HindIII sebagai kontrol
123
28
Euphytica (2011) 179:277–286
DNA. Southern analysis clearly proved the
integration of the transgene Cry1C gene along with
double 35S CaMV promoter plus AMV enhancer into
the rice genome and the copy number of transgene
was estimated to be ranging from one to two (Fig.
4b). The untransformed control plants did not show a
signal at 4 kb.
Segregation analysis of the transgene
The inheritance of the Cry1C gene in selfed R1
generation was analyzed. Here the selfed progenies
were evaluated for resistance to hygromycin. R1 seeds
of 3 independent transformants of IR64 cultivar were
germinated on hygromycin (30 mg/l) containing
medium. Seeds showing hygromycin resistance
clearly displayed segregation ratio of 3:1 in
inoculation analysis (Table 2). The sensitive plants
died within
2 weeks after the treatment, while the resistant plants
positif; jalur 2, tanaman non-transformasi sebagai kontrol
negatif; jalur 3–7, DNA dicerna ganda dengan EcoRI dan
HindIII dari tanaman transgenik putatif IR64. B Analisis
Southern blot tanaman padi transgenik R0. Fragmen gen Cryot
1C 2,9 kb digunakan untuk menyelidiki DNA genom yang
diisolasi dari daun garis transgenik dan non-transgenik.
Genomik DNA dicerna dengan enzim restriksi HindIII,
difraksionasi oleh elektroforesis, ditransfer ke membran nilon,
dan dibiarkan hibridisasi dengan gen Cry1C bersama dengan
promotor, promotor 35M CaMV ganda ditambah penambah
AMV (fragmen HindIII dan EcoRI dari pCAMBIA1305.1 /
Cry1C plasmid) . Nama Garis ditampilkan di bagian atas.
Nama jalur yang disingkat adalah: M, penanda molekul
berlabel Biotin; jalur 1, pCAMBIA1305.1 / Cry1C plasmid
yang dicerna ganda dengan EcoRI dan HindIII sebagai kontrol
positif; jalur 2, tanaman non-transformasi sebagai kontrol
negatif; jalur 3–7, DNA dicerna dengan HindIII dari tanaman
transgenik putatif IR64.
123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286
7 7
were healthy as control plants. In Southern hybridiza-
tion, 2 independent transformants clearly showed two
copy number of transgene; they were not subjected to
further segregation analysis in the present study.
28
Euphytica (2011) 179:277–286
a period of 3 days. In experiments using transfor-
mants expressing a single Bt toxin, 94–100% mor-
tality was observed, with 5–12% leaf damage.
Conversely, larvae which were fed on control plants
developed normally, causing massive tissue damage
during the bioassay period.

Bioassay of transgenic rice

Discussion
R0 transgenic plants expressing Cry1C were infested
with rice leaf folder (RLF) neonates. The results are Rice is one of the most important crops for which
summarized in Table 3. All the five transgenic lines efficient transformation system has become available
showed 100% insect mortality. Feeding damage was
estimated to be only 5% on transgenic plants. There Table 3 Rice leaf folder (RLF; Cnaphalocrocis medinalis)
was no mortality on control plants and 100% of the insect larvae bioassays on transgenic plants expressing the
Cry1C gene. Table shows % of larval mortality and % of leaf
edible portion of the leaf material was consumed over damage to plants after 72 h feeding
Genomic DNA was digested with HindIII restriction enzymes, Transformed plant lines % of larval % of leaf
fractionized by electrophoresis, transferred to nylon membrane, mortality damage
and allowed to hybridize with Cry1C gene along with the
promoter, double 35S CaMV promoter plus AMV enhancer IR64 (untransformed) 0 100
(HindIII and EcoRI fragment of pCAMBIA1305.1/Cry1C IR64-Bt-1 100 ± 0.0 7.5

Table 2 Segregation of hygromycin resistant gene and GUS gene in R1 generation of rice plants transformed with Agrobacterium
tumefaciens LBA4404 (pCAMBIA 1305.1/Cry1C)
Transformant number Total R1 seeds tested Hygromycin GUS
2 2
Resistant Sensitive Ratio X value Positive Negative Ratio X value

IR64-Bt-3 52 40 12 3:1 0.10 40 12 3:1 0.10

IR64-Bt-4 26 17 9 3:1 1.28 17 9 3:1 1.28
IR64-Bt-5 30 23 7 3:1 0.04 23 7 3:1 0.04

123 123
28
Euphytica (2011) 179:277–286 28
Euphytica (2011) 179:277–286
8 8

(Hiei et al. 1994; Rashid et al. 1996; Khanna and genes conferring resistance to a selective chemical
Raina 1999; Hiei and Komari 2006). Recent progress agent (Wilmink and Dons 1993), genes conferring
in rice plant molecular biology and genome research
has lead to a desire to introduce several genes into a
single transgenic plant through particle gun and
Agrobacterium mediated method. Embryogenic calli
derived from mature seeds of IR64 cultivar were used
as explants for incorporating Cry1C gene through
Agrobacterium mediated transformation. Calli
derived from mature seeds have been reported as
excellent starting material for transformation of rice
by Agro- bacterium (Hiei et al. 1994). A binary
vector system, pCAMBIA1305.1 was modified to
construct Cry1C gene expression cassette driven
under the control of doubled 35S promoter, AMV
enhancer and nos terminator. This construct was
mobilized into Agro- bacterium LBA4404 strain.
The cloning of insecticidal crystal protein genes
(Bt) and their expression in transgenic plants provide
an alternative strategy to conventional breeding for
the protection of crops against insect damage. At least
90 genes encoding protoxins from a wide range of
Bacillus thuringiensis isolates have been isolated and
sequenced (Mazier et al. 1997). In the present study, a
large number of rice plants carrying Cry1C gene has
been produced in IR64 cultivar by Agrobacterium
mediated transformation method. High transforma-
tion efficiency was achieved in this study due to the
use of super virulent LBA4404 (pCAMBIA1305.1/
Cry1C) in IR64 cultivar (He et al. 2010) and by
incubating the co-cultivated calli in hygromycin free
medium for 1 week before transferring to selection
medium.
One of the main objectives of the present study
was to express the Cry1C gene in transgenic rice
plants in order to provide resistance to the leaf folder
larvae. The transgene’s coding sequence was driven
by a doubled 35S CaMV promoter and AMV
enhancer sequences, which would direct and ensure
the expression of recombinant protein in the whole
plant. Aragao et al. (1999) transformed bean plants
with a chimeric construct containing the doubled 35S
CaMV promoter plus the AMV enhancer sequence,
assuming that its performance would be superior to
the native 35S promoter.
For transformation systems that generate substan-
tial number of non-chimeric primary transformants,

123 123
 28
Euphytica (2011) 179:277–286 28
Euphytica (2011) 179:277–286
9 9
phenotype allowing visual or physical screening showed normal agronomic performance, but also
(Bower et al. 1996) or even PCR screening to Cry1C expression in the endosperm. The results of
identify the plants containing transferred genes
(Christou et al. 1992) can all be used for the recovery
of transformants. In the present study, molecular
analysis of the R0 plants provided evidence for the
incorporation of T-DNA into rice genome. The
expression cassettes of Cry1C gene were presumed
to be incorporated in the rice genome of putative
transformants. Hence PCR amplification was per-
formed with the genomic DNA isolated from the
putative transgenic and untransformed control plants
of IR64 cultivars using gene specific primers to
amplify Cry1C gene. All five putative transgenics
were found to be positive for the amplification of
1.9 kb (Cry1C) genes equal to the size of the positive
control and there was no amplification in the
untransformed control plants.
The transgenic plants exhibited normal growth in
terms of phenotype and yield of seeds. PCR and
Southern hybridization analyses proved the integra-
tion of the transgenes into the host genome of rice
and the copy number of transgene varied from 1 to 2.
Multiple gene copies might cause unstable inheri-
tance or transgenic silencing; therefore, transgenic
plants with the single copy insertion are more
important and facilitate rice breeding; they have
stronger resistance to pests in field experiments (Ye
et al. 2009a, b). Southern blot analysis with HindIII
and EcoRI digested DNA suggested that, all the five
transgenic lines, showed expected band of 2.9 kb
size, indicating the integration of the Cry1C gene into
the genome of rice and proved that they were derived
from independent transformants. Segregation of the
Cry1C gene in the next generation was examined by
hygromycin resistance and GUS assay experiments.
Segregation analysis of these three independent R0
lines demonstrated that the transgenes were stably
inherited in R1 progeny.
Many devastating diseases of rice, viz. tungro,
yellow dwarf diseases are transmitted by insects.
Traditional breeding for leaf folder and stem borer
resistance in rice has not been successful due to
paucity of resistance source. Ye et al. (2009a, b)
observed that transgenic plants expressing Cry1C
gene, driven by the rice rbcS promoter, possessed
high resistance to leaf folders and stemborers, and

123 123
29
Euphytica (2011) 179:277–286 29
Euphytica (2011) 179:277–286
0 0

Studi bioassay mengungkapkan mortalitas larva Almeida ERP, Gander ES, Rech EL (1999) Expression of
yang signifikan dan kerusakan jaringan pada larva a methionine-rich storage albumin from the brazil nut
(Bertholletia excelsa H.B.K., Lecythidaceae) in transgenic
folder daun, yang secara tidak langsung bean plants (Phaseolus vulgaris L., Fabaceae). Genet Mol
mengindikasikan keberadaan gen Cry1C. Pemberian Biol 22:445–449
larva pada tanaman kontrol berkembang secara
normal, dan menyebabkan kerusakan jaringan besar
selama periode bioas. Kematian serangga yang
diamati dalam penelitian ini bertepatan dengan
penelitian sebelumnya (Maqbool et al. 2001; Tang et
al. 2006; Ye et al. 2009a, b). Tanaman Bt yang
menargetkan hama lepidopteran yang serius dan
secara signifikan mengurangi penerapan insektisida
kimia memiliki potensi untuk meningkatkan peluang
untuk pengendalian biologis dan mengarah pada
program pengelolaan hama yang lebih terintegrasi
(Romeis et al. 2006). Berdasarkan hasil kami dan
penelitian sebelumnya (Chen et al. 2006),
dapat disimpulkan bahwa beras Bt memiliki
kompatibilitas yang baik dengan kontrol biologis
dalam ekosistem padi. Singkatnya, untuk
pengetahuan kami untuk pertama kalinya, dalam
penelitian ini kami telah memperkenalkan gen Cry1C
bersama dengan dua kali lipat promotor 35S CaMV
dan urutan penambah AMV ke dalam tanaman padi
dan tanaman padi transgenik diproduksi dengan biji
subur. Gen Cry1C yang diperkenalkan ditemukan
secara stabil diintegrasikan ke dalam genom padi.
Selanjutnya gen itu diwarisi oleh keturunan tanaman
transgenik. Data yang disajikan di sini
mengkonfirmasi bahwa Agrobacterium yang
dimediasi trans-formasi dalam beras kemungkinan
akan mempercepat penerapan pendekatan pemuliaan
molekuler dalam pertanian modern.

Acknowledgements We thank Prof. Dr. Illimar Altosar,

University of Ottawa, Canada for providing the binary vector
and Dr. Gabrial Paulraj, Scientist and Mr K. Baskar,
Entomology Research Institute, Loyola College, Chennai for
their help and support during insect bioassay. We are grateful
to Entomology Research Institute for financial assistance.

References

Alcantara EP, Aguda RM, Curtiss A, Dean DH, Cohen MB

(2004) Bacillus thuringiensis d-endotoxin binding to
brush border membrane vesicles of rice stem borers. Arch
Insect Biochem Physiol 55:169–177
Aragao FJL, Barros LMG, de Sousa MV, de Sa Grossi MF,

123 123
 29
Euphytica (2011) 179:277–286 29
Euphytica (2011) 179:277–286
1 1
Bashir K, Husnain T, Fatima T, Riaz N, Makhdoom R, Ri-
azuddin S (2005) Novel indica basmati line (B-370)
expressing two unrelated genes of Bacillus thuringiensis
is highly resistant to two lepidopteran insects in the field.
Crop Prot 24:870–879
Bower R, Elliott AR, Potier BAM, Birch RG (1996) High-
efficiency, microprojectile mediated cotransformation of
sugarcane, using visible or selectable markers. Mol Breed
2:239–249
Brookes P, Barfoot GB (2003) GM rice, will this be the way
for global acceptance of GM crop technology. ISAAA
Briefs no. 28, ISAAA, Ithaca
Cao J, Tang JD, Strizhov N, Shelton AM, Earle ED (1999)
Transgenic broccoli with high levels of Bacillus thurin-
giensis Cry1C protein control diamondback moth larvae
resistant to Cry1A or Cry1C. Mol Breed 5:131–141
Chen M, Zhao JZ, Ye GY, Fu Q, Shelton AM (2006) Impact of
insect-resistant transgenic rice on target insect pests and
non-target arthropods in China. Insect Sci 13:409–420
Cheng X, Sardana R, Kaplan H, Altosaar I (1998) Agrobac-
terium transformed rice plants expressing synthetic Cry
IA(b) and Cry IA(c) genes are highly toxic to stripe and
stem borer and yellow stem borer. Proc Natl Acad Sci
USA 95:2767–2772
Chilton MD, Currier TC, Farrand SK, Bendich AJ, Gordon
MP, Nester EW (1974) Agrobacterium tumefaciens DNA
and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall
tumours. Proc Nat Acad Sci USA 71:3672–3676
Christou P, Ford TL, Kofron M (1992) The development of a
variety independent gene transfer method for rice. Tibtech
10:239–246
Dale D (1994) Insect pests of the rice plant–their biology and
ecology. In: Heinrichs EA (ed) Biology and management
of rice insects. Wiley Eastern/New Age International,
New Delhi, India, pp 363–485
Desneux N, Decourtye A, Delpuech JM (2007) The sublethal
effects of pesticides on beneficial arthropods. Annu Rev
Entomol 52:81–106
FAO (2007) FAOSTAT. http://faostat.fao.org/site/567/default.
aspx
Ferry N, Edwards MG, Gatehouse J, Capell T, Christou P,
Gatehouse AMR (2006) Transgenic plants for insect pest
control: a forward looking scientific perspective. Trans-
genic Res 15:13–19
Fujimoto H, Itoh K, Yamamoto M, Kyozuka J, Shimamoto K
(1993) Insect resistant rice generated by introduction of a
modified dendotoxin gene of Bacillus thuringiensis. Bio/
Technol 11:1151–1155
Gatehouse JA (2008) Biotechnological prospects for engi-
neering insect-resistant plants. Plant Physiol 146:881–887
He Y, Jones HD, Chen S, Chen XM, Wang DW, Li KX, Wang
DS, Xia LQ (2010) Agrobacterium-mediated transforma-
tion of durum wheat (Triticum turgidum L. var. durum
cv. Stewart) with improved efficiency. J Exp Bot 61:
1567–1581
Hiei Y, Komari T (2006) Improved protocols for transforma-
tion of indica rice mediated by Agrobacterium tumefac-
iens. Plant Cell Tiss Organ Cult 85:271–283
Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient
transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by

123 123
28
6
Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of
the T-DNA. Plant J 6:271–282
Holsters M, de Waele D, Depicker A, Messens E, van Montagu
M, Schell J (1978) Transfection and transformation of
Agrobacterium tumefaciens. Mol Gen Genet 163:181–187
James C (2005) Global status of commercialized biotech/GM
crops: 2005. ISAAA brief no. 34. International Service for
the Acquisition of Agri-Biotech Applications, Ithaca, New
York, USA
Jefferson RA (1987) Assaying chimeric genes in plants: the
GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep 5:387–405
Khan SA, Zafar Y, Briddon RW, Malik KA, Mukhtar Z (2006)
Spider venom toxin protects plants from insect attack.
Transgenic Res 15:349–357
Khanna HK, Raina SK (1999) Agrobacterium-mediated
transformation of indica rice cultivars using binary and
superbinary vectors. Aust J Plant Physiol 26:311–324
Khush G (1997) Origin, dispersal, cultivation and variation in
rice. Plant Mol Biol 35:25–34
Maqbool SB, Raizuddin S, Loc TN, Gatehouse AMR, Gate-
house JA, Christou P (2001) Expression of multiple
insecticidal genes confers broad resistance against a range
of different rice pests. Mol Breed 7:85–93
Matteson PC (2000) Insect pest management in tropical Asian
irrigated rice. Annu Rev Entomol 45:549–574
Mazier M, Pennetier C, Tourneur J, Jounin L, Giband M
(1997) The expression of Bacillus thuringiensis toxin
genes in plant cells. Biotechnol Annu Rev 3:313–347
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol
Plant 15:473–497
Nayak P, Basu D, Das S, Basu A, Ghosh D, Ramakrishnan
NA, Ghosh M, Sen SK (1997) Transgenic elite indica
rice plants expressing Cry IAc D-endotoxin of Bacillus
thur- ingiensis are resistant against yellow stem borer
(Scirp- ophaga incertulas). Proc Natl Acad Sci
USA 94:
2111–2116
Qiu HJ, Wei ZM, An HL, Zhu YX (2001) Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of rice with the
spider insecticidal gene conferring resistance to leaf folder
and striped stem borer. Cell Res 11:149–155
Rahman M, Rashid H, Shahid AA, Bashir K, Husnain T, Ri-
azuddin S (2007) Insect resistance and risk assessment
studies of advanced generations of basmati rice expressing
two genes of Bacillus thuringiensis. Plant Biotech. doi:
10.2225/vol10-issue2-fulltext-3
Ramesh S, Nagadhara D, Reddy VD, Rao KV (2004) Pro-
duction of transgenic indica rice resistant to yellow stem
borer and sap-sucking insects, using super-binary vectors
of Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci 166:1077–1085
Rashid H, Yokoi S, Toriyama K, Hinata K (1996) Transgenic
plant production mediated by Agrobacterium in indica
rice. Plant Cell Rep 15:727–730
Raveendar S, Premkumar A, Ignacimuthu S, Agastian P (2008)
Effect of sea water on callus induction and regeneration of
rice genotypes. Int J Integr Biol 3:92–95
Romeis J, Michael M, Franz B (2006) Transgenic crops
expressing Bacillus thuringiensis toxins and biological
control. Nat Biotechnol 24:63–71
123
View publication stats
Euphytica (2011) 179:277–286
Savary S, Willocquet L, Elazegui FS, Castilla NP, Teng PS
(2000) Rice pest constraints in tropical Asia: quantifica-
tion of yield losses due to rice pests in a range of pro-
duction situations. Plant Dis 84:357–369
Shu QY, Ye GY, Cui HR, Cheng XY, Xiang YB, Wu DX, Gao
MW, Xia YW, Hu C, Sardana R, Altosaar I (2000)
Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from
Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepi-
dopteran rice pest species. Mole Breed 6:433–439
Southern EM (1975) Detection of specific sequences among
DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol
Biol 98:503–517
Strizhov N, Keller M, Mathur J (1996) A synthetic cry IC gene,
encoding a Bacillus thuringiensis d endotoxin, confers
Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco. Proc Natl
Acad Sci USA 93:15012–15017
Tang W, Chen H, Xu CG, Li XH, Lin YJ, Zhang QF (2006)
Development of insect-resistant transgenic indica rice
with a synthetic cry1C* gene. Mole Breed 18:1–10
Tu J, Zhang G, Datta K, Xu C, He Y, Zhang Q, Khush GS,
Datta SK (2000) Field performance of transgenic elite
commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiensis
D-endotoxin. Nat Biotechnol 18:1101–1104
Wilmink A, Dons JM (1993) Selective agents and marker
genes for use in transformation of monocotyledonous
plants. Plant Mol Biol Rep 11:165–185
Xia H, Chen L, Wang F, Lu BR (2010) Yield benefit and
underlying cost of insect-resistance transgenic rice:
implication in breeding and deploying transgenic crops.
Field Crop Res 118:215–220
Xiaofen S, Kexuan T, Bingliang W, Huaxiong Q, Xinggu L
(2001) Transgenic rice homozygous lines expressing
GNA showed enhanced resistance to rice brown plant-
hopper. Chin Sci Bull 46:1698–1703
Ye GY, Tu J, Hu C, Datta K, Datta SK (2001) Transgenic IR72
with fused Bt gene cry1Ab/cry1Ac from Bacillus thurin-
giensis is resistant against four lepidopteran species under
field conditions. Plant Biotechnol 18:125–133
Ye GY, Yao HW, Shu QY, Cheng XY, Hu C, Xia YW, Gao
MW, Altosaar I (2003) High levels of stable resistance in
transgenic rice with a cry1Ab gene from Bacillus thur-
ingiensis Berliner to rice leaf folder, Cnaphalocrocis
medinalis (Guenee) under field conditions. Crop Prot
22:171–178
Ye R, Huang H, Yang Z, Chen T, Liu L, Li X, Chen H, Lin Y
(2009a) Development of insect-resistant transgenic rice
with Cry1C free endosperm. Pest Manag Sci 65:
1015–1020
Ye SH, Chen S, Zhang F, Wang W, Tian Q, Liu JZ, Chen F,
Bao JK (2009b) Transgenic tobacco expressing Zephy-
ranthes grandiflora agglutinin confers enhanced resis-
tance to aphids. Appl Biochem Biotechnol 158:615–630
Zaidi MA, Ye G, Yao H, You TH, Loit E, Dean DH, Riazuddin
S, Altosaar I (2009) Transgenic rice plants expressing a
modified cry1Ca1 gene are resistant to Spodoptera litura
and Chilo suppressalis. Mol Biotechnol 43:232–242