I.

1 Bagaimana menangani
spesimen biologis
Oleh Osamu Suzuki
Beberapa pengetahuan yang diperlukan sebelum menangani spesimen
Flowchart untuk bagaimana menangani spesimen yang diperoleh dari pasien yang diracuni
ditunjukkan pada
> Gambar 1.1 . Ketika insiden keracunan terjadi dan seorang pasien dikirim ke rumah sakit,
dokter dan staf medis harus memusatkan upaya mereka pada perawatan intensif
pasien. Namun, pada titik ini, diskriminasi apakah itu kasus keracunan atau tidak,
tentu saja, sangat penting. Jika pasien meninggal dan kematian diadili karena keracunan, dokter
yang bertanggung jawab harus mengajukan kematian dengan polisi yang berlokasi di distrik
dalam waktu 24 jam menurut
hukum di Jepang.

Kematian karena keracunan makanan bakteri harus diklasifikasikan menjadi intrinsik (kematian
karena penyakit ), dan dibedakan dari kematian karena obat-obatan atau racun (kematian
ekstrinsik); tidak
perlu mengajukan ke polisi, tetapi harus diajukan ke pusat kesehatan setempat. Terlepas dari
mati atau hidup pasien, keracunan makanan bakteri dan keracunan obat harus
diajukan ke pusat kesehatan setempat. Harus disebutkan di sini bahwa kematian akibat menelan
ikan buntal dan jamur diklasifikasikan sebagai yang ekstrinsik.
Setelah polisi menerima file kematian yang tidak wajar, analisis racun penyebab
dilakukan, sesuai dengan kebutuhan, di laboratorium investigasi kriminal setempat di markas
besar polisi
di setiap prefektur di Jepang. Ketika analisis di laboratorium lokal sulit, spesimen
dikirim untuk analisis ke Lembaga Penelitian Nasional Ilmu Kepolisian di Kota Kashiwa,
Prefektur Chiba . Ketika mayat kematian yang tidak wajar menjadi sasaran otopsi yudisial di
departemen
kedokteran hukum sekolah kedokteran, spesimen racun yang diperoleh dari mayat dianalisis di
departemen jika departemen mampu menganalisanya.
Ketika seorang pasien selamat dan kriminalitas dicurigai dalam kasus keracunan, harus segera
diajukan
ke polisi; dalam kasus seperti itu, polisi benar-benar bertanggung jawab atas
analisis racun .
Hanya ketika pasien keracunan hidup tanpa kriminalitas, dan juga tidak ada diskriminasi
antara keracunan oleh makanan bakteri dan obat-obatan / racun dapat dibuat, permintaan yang
ditujukan
ke laboratorium higienis lokal untuk analisis toksin dimungkinkan melalui pusat
kesehatan. Tugas utama
laboratorium higienis adalah uji bakteri pada makanan dan analisis polutan lingkungan ;
laboratorium biasanya dilengkapi dengan instrumen analitik mahal seperti spektrometer massa,
dan tampaknya cukup memenuhi analisis obat-obatan dan racun. Namun, pada
saat ini di Jepang, permintaan tersebut biasanya ditolak oleh laboratorium setelah kemungkinan
keracunan makanan bakteri dikeluarkan. Oleh karena itu, timbul masalah terkait
lembaga mana yang melakukan analisis spesimen yang dikumpulkan dari pasien keracunan yang
dirawat
di rumah sakit, yang selamat dan tidak menunjukkan kriminalitas (percobaan bunuh diri atau
kecelakaan). Cara terbaik
adalah bahwa laboratorium klinis rumah sakit yang sama melakukan analisis spesimen ;
namun analisis obat-obatan dan racun hampir tidak mungkin dilakukan di rumah sakit setempat,
karena
biasanya tidak mudah, dan memerlukan keterampilan analis. Sayangnya, di Jepang, yang disebut
pusat kendali racun untuk melakukan analisis toksin tidak tersedia; sementara di AS
dan Eropa pusat-pusat pengendalian racun aktif untuk menganalisis spesimen semacam
itu. Masalah
kita bukan karena keterlambatan ilmiah dalam kimia analitik di negara kita, tetapi karena
keterlambatan dalam langkah-langkah yang harus diambil oleh Pemerintah Jepang. Untuk
mengatasi masalah di atas ,
banyak upaya dilakukan di tingkat non-pemerintah [1]; salah satu upaya disajikan
dalam Bab I.7.
Sampling spesimen pada adegan klinis
Darah
Darah spesimen sekarang sedang dikumpulkan dari vena menggunakan tabung vakum
pengambilan sampel; EDTA ,
sitrat atau heparin biasanya terkandung dalam tabung sebagai antikoagulan. Beberapa tabung
mengandung
natrium fluorida sebagai pengawet. Analis harus mewaspadai keberadaan aditif semacam itu.
3
Jumlah darah yang lebih besar lebih disukai untuk dijadikan sampel untuk analisis
toksin; Namun, mengingat
stres pada pasien, 5-10 mL darah harus diambil sampelnya. Jika situasi memungkinkan, beberapa
sampel pada interval yang berbeda diinginkan. Analisis kursus-waktu sangat berguna untuk
memutuskan kebijakan terapeutik dalam kasus keracunan. Ketika plasma dibutuhkan, fraksi
supernatan diperoleh dengan memusatkan tabung yang mengandung darah utuh pada 2.000-
3.000 rpm.
Urin
Juga untuk urin, jumlah yang lebih besar lebih disukai untuk dijadikan sampel. Ketika urin
diperoleh dengan kateterisasi dari pasien, harus diingat bahwa jeli yang
mengandung anestesi lokal telah diterapkan pada kateter; urin biasanya terkontaminasi oleh obat
semacam itu. Juga untuk
urin, pengambilan sampel sesuai dengan interval waktu lebih disukai. Sesuai dengan kebutuhan,
natrium
fluorida atau natrium azida ditambahkan ke sampel urin dengan konsentrasi 1 mg / mL sebagai
pengawet.
Menurut jenis obat dan racun, sejumlah besar metabolit kadang-kadang
diekskresikan ke dalam urin. Sebelum analisis, beberapa pengetahuan tentang metabolisme dan
ekskresi untuk
kemungkinan toksin diperlukan; kamus yang bermanfaat diterbitkan untuk tujuan semacam itu
[2].
Vomitus dan cairan gastrolavage Setelah konsumsi obat atau racun melalui mulut, ada
kemungkinan isi lambung mengandung toksin tingkat tinggi yang tidak
berubah. Vomitus dan cairan gastrolavage harus disimpan dalam jumlah sebesar
mungkin; volume mereka harus dicatat dengan ketat. Juga sesuai dengan kebutuhan, natrium
fluorida atau natrium azida dapat ditambahkan sebagai pengawet. Rambut dan kuku
Ketika keracunan kronis oleh suatu obat atau racun (terutama logam berat dan obat-obatan dasar)
dicurigai, setelah mendapat persetujuan dari pasien, beberapa potong rambut panjang disampel
dengan
memotong di akarnya, dimasukkan ke dalam kantong polietilena kering dengan pengikat dan
disimpan pada suhu kamar atau 4 ° C.
Kuku juga merupakan bahan yang baik untuk mendeteksi obat atau racun yang tertelan di masa
lalu, dan dapat menjadi spesimen alternatif, terutama ketika rambut kulit kepala terlalu pendek
atau tidak
tersedia. Mereka dapat disimpan juga pada suhu kamar atau 4 ° C.
Pengumpulan informasi tentang kemungkinan obat atau racun yang
diberikan atau dicerna.
Pertanyaan mengenai obat atau racun bagi pasien dan keluarganya sangat penting. Upaya harus
dilakukan untuk menemukan cangkir atau botol yang tertinggal di tempat keracunan, karena ada
kemungkinan
larutan murni atau bersih dari senyawa beracun terkandung di dalamnya. Ini adalah metode yang
baik untuk meminta anggota
layanan darurat untuk mencari barang-barang tersebut di tempat.
Pengambilan sampel spesimen di tempat klinis
4 Bagaimana menangani spesimen biologis
Pengambilan sampel dari mayat
Pengamatan di tempat keracunan
Ketika seorang dokter diminta untuk melakukan pemeriksaan postmortem, ia harus tiba di
tempat keracunan untuk mencapai tugas. Sebelum pemeriksaan mayat, dokter harus
mengamati situasi di sekitarnya secermat mungkin, dan juga harus menghirup udara. Ada
banyak kasus fatal dari keracunan pestisida organofosfat dan kresol, di mana
aroma aromatik yang kuat diberikan dari muntahan dan dari mulut mayat. Ketika tidak
ditemukan
adanya muntah, kadang-kadang berguna bagi dokter untuk mencoba mengendus bau dengan
menjaga
hidung dokter lebih dekat ke hidung dan mulut mayat dan dengan mendorong dadanya
perlahan. Banyak
mayat karena keracunan menunjukkan cairan lendir yang kotor, buih atau degenerasi bibir atau
di
sekitar mulut. Penting juga untuk mencari botol atau cangkir yang mengandung senyawa
beracun.
Ketika mereka ditemukan, mereka harus disimpan dengan hati-hati sampai analisis. Paket dan
wadah plastik untuk tablet dan kapsul harus dicari terutama di tempat sampah atau tempat lain di
ruangan. Jika paket atau kasing kosong ditemukan di tempat sampah, mereka harus dengan hati-
hati berbaris
sesuai dengan lapisan atas ke bawah. Jika tidak ditemukan di dalam ruangan,
pencarian harus diperluas ke tempat terdekat, tempat sampah dikumpulkan di luar ruangan.
Ketika diungkapkan bahwa korban telah mengunjungi klinik atau rumah
sakit, informasi terperinci
dapat diperoleh mengenai jenis obat dan jumlahnya yang ditentukan; informasi tentang diagnosis
penyakit dan waktu kunjungan terakhir dapat juga diperoleh dengan menanyakan kepada
dokter yang bertanggung jawab. Pada setiap paket atau kasing untuk tablet atau kapsul, nomor
kode atau
tanda khusus biasanya ditunjukkan; mudah untuk mengidentifikasi obat dengan nomor kode atau
tanda menggunakan
buku daftar obat [3]. Dalam kebanyakan kasus keracunan, korban biasanya menelan berbagai
jenis dan
sejumlah besar obat-obatan untuk bunuh diri. Final penghakiman apakah kematian adalah karena
keracunan obat harus dilakukan dengan menghitung jumlah obat-obatan dan dengan
mempertimbangkan toksisitas
masing-masing obat tertelan.
Pengambilan sampel di inspeksi postmortem
Ketika tersedia vomitus dan cairan gastrolavage , lebih baik menyimpan semuanya. Karena
cairan buih atau air liur yang melekat pada bibir atau kulit di sekitarnya mungkin mengandung
konsentrasi tinggi dari obat atau racun, mereka harus disampel dengan mengelapnya dengan hati-
hati dengan kain kasa dan
disimpan dalam wadah tertutup pada suhu kamar atau 4 ° C.
Penulis et al. biasanya sampel sekitar 10 mL darah pada setiap pemeriksaan postmortem, bahkan
jika penyebab kematian sangat disarankan hanya penyakit; kami menyimpannya pada –80 ° C
selama setidaknya
1 tahun. Ini karena setiap hal yang tidak dapat diprediksi dapat diungkapkan oleh penyelidikan
lebih lanjut dari
polisi. Terutama di daerah pedesaan tanpa sistem pemeriksa medis (sistem ini
hanya aktif di beberapa kota besar di Jepang), mayat, yang dianggap tidak terlibat dalam
kriminalitas ,
biasanya tidak diautopsi, tetapi hanya dilakukan pemeriksaan postmortem. Oleh karena itu,
penyimpanan
sampel darah untuk waktu yang lama tampaknya sangat penting, karena ada kemungkinan bahwa
sampel tersebut akan berfungsi sebagai bukti yang efektif di masa depan.
Karena tusukan untuk pengambilan sampel didasarkan pada permintaan petugas polisi yudisial,
mereka
tidak ilegal; tetapi lebih disukai untuk mendapatkan persetujuan dari anggota keluarga setelah
pengambilan sampel.
5
Jarum yang biasanya digunakan untuk tusukan lumbal dapat digunakan pada pemeriksaan
postmortem. Namun, kami menggunakan apa yang disebut "jarum kontras media", yang lebih
tebal dan lebih panjang dari itu
untuk tusukan lumbar ( > Gambar 1.2) ; panjangnya sekitar 16 cm dan diameter internalnya
sekitar
1 mm; ini berguna untuk jantung, kandung kemih dan tusukan suboksipital . Untuk tusukan
lambung, kami menggunakan jarum yang lebih tebal dan lebih panjang (panjang 20 cm dan
diameter internal 1,5 mm)
(  > Gambar 1.2) , karena perut biasanya berisi konten padat. Penandaan dengan spidol berbasis
minyak di lokasi 5 dan 10 cm dari ujung jarum berguna untuk memperkirakan
kedalaman tusukan. Jarum suntik kaca konvensional volume 10–30 mL
lebih disarankan daripada jarum suntik sekali pakai plastik, karena jarum suntik kaca dengan
mudah memberikan rasa sentuhan halus
untuk ditransmisikan ke jari setelah mengambil darah.
Untuk tusukan jantung, jarum harus ditempelkan dengan cepat pada kedalaman sekitar 10 cm
pada
lokasi dada berikut ini; pada garis lurus menggabungkan kedua puting susu, pada
ruang interkostal dan di margin kiri sternum. Setelah melepaskan jarum bagian dalam, jarum
suntik kaca
terhubung ke jarum; bersamaan dengan menarik plunger, posisi jarum digerakkan
maju dan mundur perlahan. Ketika darah ada di jantung, itu mudah ditarik ke dalam jarum
suntik; di
setidaknya 5 mL darah sampel dan disimpan.
Untuk pengambilan sampel urin, simfisis pubis dipalpasi, dan jarum dimasukkan ke dalam
kandung kemih pada margin atas tulang kemaluan pada sudut sekitar 45 derajat terhadap
permukaan kulit perut. Ketika sejumlah besar urin hadir dalam kandung kemih, ia mudah
ditarik ke dalam jarum suntik. Tentu saja, pengambilan sampel urin dengan
kateterisasi melalui uretra
dimungkinkan seperti dalam kasus pasien yang hidup. Jumlah urin yang lebih besar lebih disukai
untuk kasus
yang diduga keracunan.
Untuk pengambilan sampel isi lambung, jarum besar di atas dengan cepat ditusuk ke
perut di margin dalam tulang rawan kosta kiri. Ketika sejumlah besar isi perut hadir, itu mudah
diperoleh. Namun, tidak mudah ketika jumlahnya kecil; itu
sulit untuk menyuntikkan jarum melalui dinding perut, karena yang terakhir terlalu bergerak
dalam
ketiadaan sejumlah besar isi perut.
Jarum dan jarum suntik gelas untuk tusukan. Jarum besar bagian atas digunakan untuk tusukan
perut ;
yang lebih kecil untuk tusukan jantung, suboksipital , dan kandung kemih.
⊡ Gambar 1.2 Sampling dari mayat 6 Bagaimana menangani spesimen biologi Menurut
kebutuhan, cairan serebrospinal (CSF), rambut dan kuku adalah sampel. CSF diambil sampelnya
dengan tusukan suboksipital sebagai berikut. Leher ditekuk ke depan, dan jarum tersangkut di
bagian belakang setinggi antara foramen magnum dan vertebra jugularis pertama yang
mencapai cisterna magna; lebih dari 10 mL CSF dapat diperoleh dengan tusukan
tersebut. Seperti yang dinyatakan sebelumnya, ada banyak kasus di mana obat-obatan dasar atau
racun relatif stabil disimpan di rambut atau kuku untuk waktu yang lama ; rambut dan kuku
kadang-kadang menjadi spesimen alternatif yang baik untuk analisis obat-obatan dan racun pada
mayat yang rusak, dan mungkin juga berguna untuk mendeteksi racun yang telah diambil atau
diberikan di masa lalu. Kegunaan rambut dan kuku disajikan dalam Bab I.2 berjudul "Spesimen
alternatif" dari buku ini. Jarum tusukan harus dijaga kebersihannya; setelah digunakan, darah
yang menempel pada jarum harus segera diangkat dengan mencuci dengan air ledeng dengan
menggerakkan jarum dalam ke depan dan ke belakang . Jarum berdarah tidak boleh dibiarkan
kering setelah digunakan. Pengambilan sampel saat otopsi Ketika dicurigai terjadi keracunan,
isi lambung, darah dan urin jantung kanan dan kiri dikumpulkan sebanyak mungkin (10-100 mL)
dan disimpan. Lebih dari 20 g setiap jaringan otak, paru-paru, jantung, hati, ginjal dan limpa
harus diambil sampelnya. Dalam kasus mayat yang busuk , otot rangka di paha dapat menjadi
spesimen yang berguna untuk analisis, karena jaringan bagian ini paling resisten terhadap
pembusukan dan mengandung kadar obat dan racun yang hampir sama dengan darah. Jaringan
dari organ yang berbeda tidak boleh diletakkan dalam wadah atau kantung polietilen yang
sama; mereka harus disimpan secara terpisah. Perawatan khusus harus diambil untuk isi
lambung, karena mungkin mengandung sejumlah besar obat atau racun, yang dapat mencemari
spesimen lain. Ketika dicurigai injeksi toksin subkutan atau intramuskuler, kemungkinan tempat
injeksi diinsisi, dan kulit dikeluarkan dengan hati-hati untuk mengambil sampel jaringan atau
otot adiposa subkutan yang sesuai, yang mungkin mengandung obat atau racun dalam kadar
tinggi yang tidak berubah. Penyimpanan sampel Darah atau urin yang diperoleh dari pasien
yang masih hidup atau mayat disimpan dalam botol kaca (atau tabung) dengan tutup ulir
Teflon; vial harus disegel sepenuhnya. Ketika polietilen atau tabung plastik digunakan,
kontaminasi sampel oleh plasticizer dan senyawa lain harus dipertimbangkan . Sampel padat
(organ dan jaringan) secara terpisah dimasukkan ke dalam kantong polietilen kecil dengan
pengencang untuk mencegahnya mengering. Lebih disukai bahwa setiap sampel disiapkan
dalam rangkap dua; satu disimpan pada suhu 4 ° C untuk analisis dalam beberapa hari dan yang
lainnya disimpan pada suhu -80 ° C untuk penyimpanan yang lama. Ketika tabung gelas
disimpan pada suhu di bawah 0 ° C, pecahnya gelas karena ekspansi cairan beku harus dihindari
dengan bersandar atau meletakkan tabung. 7 Referensi Suzuki O, Watanabe-Suzuki K, Seno H
(2000) Situasi saat ini dan perspektif penyelidikan laboratorium klinis. J Med Technol 44: 1480–
1486 (dalam bahasa Jepang ) Yamamoto I (1995) Kamus Metabolisme Narkoba
Yamamoto. Hirokawa Publishing Co., Tokyo (dalam bahasa Jepang ) Pusat Informasi Farmasi
Jepang (2001) Obat-obatan di Jepang, edisi ke-24 . Jiho Inc., Tokyo (dalam bahasa Jepang)

I.2 Spesimen alternatif

Oleh Fumio Moriya
Pendahuluan Isi
darah, urin, dan lambung (termasuk cairan lavage lambung dan muntah) biasanya
digunakan sebagai spesimen untuk analisis obat dan racun bagi subjek yang hidup. Konsentrasi
racun dalam darah dapat menjadi indikator untuk memperkirakan tingkat keracunan. Urin
terkadang mengandung
sejumlah besar metabolit dan / atau bentuk toksin yang tidak berubah; mengandung kadar
protein yang rendah , yang biasanya mengganggu analisis, dan dengan demikian cocok untuk tes
skrining menggunakan
immunoassay tanpa pretreatment yang membosankan. Isi perut dapat menjadi spesimen yang
berguna untuk
identifikasi racun, hanya ketika waktu setelah konsumsi pendek; itu mengandung sejumlah besar
dari bentuk yang tidak berubah dari senyawa yang dicerna. Namun, ada banyak kasus, di mana
darah, urin atau isi lambung tidak dapat diperoleh, karena berbagai alasan. Bahkan dengan
air seni, obat-obatan terlarang menjadi tidak terdeteksi beberapa hari setelah pemberian mereka.
Baru-baru ini, sesuai dengan perkembangan teknologi analitik, kemungkinan sedang diperluas
hingga
analisis ultra-sensitif racun pada rambut, kuku, air liur dan keringat; spesimen ini terbukti
bermanfaat untuk analisis toksin, karena banyak racun diekskresikan ke dalam spesimen ini [1].
Penggunaan obat-obatan non-terapi, oleh wanita hamil sekarang menjadi masalah, karena
efek buruknya pada janin. Untuk menilai efek penggunaan obat oleh ibu pada janin, data
diperoleh
dari bayi yang baru lahir bersama dengan ibu terkadang menjadi perlu. Dalam hal ini ,
darah dan urin, tentu saja, biasanya digunakan. Namun baru-baru ini, meconium yang akan
dikeluarkan oleh
bayi yang baru lahir telah menjadi objek yang menarik [2].
Pada otopsi, cairan tubuh dan jaringan apa pun dapat digunakan untuk analisis; darah, urin,
empedu,
isi lambung dan hati digunakan dengan baik. Untuk penilaian tingkat keracunan,
kadar obat dan racun dalam darah biasanya digunakan; Namun, kami kadang-kadang
menemukan kasus-kasus, di
mana jumlah darah yang cukup tidak dapat dikumpulkan, karena exsanguination. Di tempat
sampel darah, cairan pericardiac , cairan serebrospinal, humor vitreous dan otot rangka dapat
digunakan [3, 4].
Rambut
Rambut terdiri dari batang dan akarnya; penampang menunjukkan kutikula, korteks dan
medula. Bagian
korteks terdiri dari keratin dan melanin, dan bagian itu menghitung 80-90% dari seluruh berat
badan.
Di umbi rambut, ada papilla rambut dengan bundel pembuluh kapiler, di mana obat-obatan dan
racun diangkut dari darah ke sel-sel rambut. Sel-sel keratin selama pertumbuhan mereka.
Melalui prosedur ini, obat-obatan dan racun dimasukkan ke dalam rambut, menghasilkan
penyimpanan yang stabil di dalamnya. Tingkat pertumbuhan rambut tergantung sampai batas
tertentu pada usia, jenis kelamin, ras dan
kondisi kesehatan ; tarifnya masing-masing sekitar 10 mm dan 6 mm per bulan untuk rambut
kepala dan rambut kemaluan [5].
Rambut telah digunakan untuk mendeteksi paparannya terhadap logam berat dengan analisis
kimia dari
tahun 1950-an [6]. Penggunaan pertama rambut untuk analisis obat tidak terlalu
tua; Baumgartner et al. [7] adalah
2
10 spesimen alternatif
pertama yang mendeteksi opiat dari rambut pengguna heroin oleh radioimmunoassays pada
tahun 1979. Setelah itu ,
banyak jenis obat dilaporkan menumpuk di rambut. Saat ini, analisis rambut diakui sebagai alat
yang berguna untuk mendeteksi penggunaan atau penyalahgunaan narkoba. Dimungkinkan untuk
mendeteksi
riwayat penggunaan obat selama beberapa bulan dengan membuat analisis segmental rambut,
ketika cukup lama [8].
Sebagai contoh, penulis et al. [9] dapat mendeteksi penyalahgunaan metamfetamin berulang
hingga
waktu 3-5 hari sebelum kematiannya dengan analisis segmental rambut dan kuku yang diperoleh
saat otopsi
(  > Tabel 2.1) ; dalam hal ini, metamfetamin tidak dapat dideteksi dari darah, urin, dan
organ.
Untuk sampel rambut, rambut kulit kepala di bagian posterior wilayah parietal dikatakan
terbaik ,
karena laju pertumbuhannya yang konstan 10]. Sebelum dianalisis, perlu untuk menghilangkan
senyawa lingkungan (eksogen) yang menempel pada permukaan rambut. Beberapa surfaktan,
0,05–1% sodium
laurylsulfate , pelarut organik seperti n-heksana, diklorometana, metanol, etanol dan aseton, dan
0,01-0,1 M HCl digunakan untuk mencuci permukaan rambut. Untuk meningkatkan efisiensi
pencucian, pembersih ultrasonik sering digunakan. Untuk mengekstraksi senyawa target dari
rambut, sampel
dimasukkan ke dalam metanol, 0,1 M HCl atau 0,1 M NaOH dan diinkubasi pada 40-60 ° C. Ada
juga metode yang menggunakan pencernaan dengan NaOH 2,5 M atau proteinase K. Ekstrak ini
dikenai
ekstraksi cair-cair atau ekstraksi fase padat untuk memurnikan senyawa target; analisis akhir
biasanya dilakukan oleh immnnoassays , HPLC, GC atau GC / MS [1, 11].
Atas dasar data analisis rambut yang luas, nilai cutoff ketika diukur dengan GC / MS
dianggap 1,0 pg / 10 mg rambut untuk metabolit ganja, 5 ng / 10 mg rambut untuk kokain,
opiat dan metamfetamin, dan 3 ng / 10 mg rambut untuk phencyclidine [12].
Rambut adalah spesimen yang baik untuk deteksi jangka panjang obat-obatan dan racun; adalah
mungkin untuk menganalisis suatu senyawa beberapa hari kemudian. Namun, harus diingat
bahwa penggunaan obat dalam waktu 3 hari tidak dapat dideteksi dengan analisis rambut.
⊡ Tabel 2.1 Analisis segmen metamfetamin pada rambut dan kuku, yang diperoleh dari pelaku
kebiasaan pada otopsi, dengan spektrometri massa dalam mode CI * Panjang Spesimen dari akar
(cm) Konsentrasi metamfetamin ( ng / 10 mg) Rambut kulit kepala (wilayah parietal) 0-0,2 0,2-
1,0 1,0-2,0 2,0-3,0 10,8 1,38 2,19 0,68 kemaluan rambut 0-0,2 0,2-2,0 2,0-5,0 25,2 0,76

0,08
Kuku jari (ibu jari kiri) 0–0,5
0,5–1,0
1,0–1,5
1,5–2,0
0,83
0,76
0,38
0,08
Kuku jari kaki (ibu jari kaki kiri) 0–0,5
0,5–1,0
1,0–1,5
1,5–2,0
1,51
0,60
0,23
0,23 0,23
* Dikutip dari referensi [9]; metamfetamin tidak dapat dideteksi dari cairan atau organ tubuh apa
pun.
11
Kuku
The kuku terdiri dari tubuh kuku (plate) dan akar; pertumbuhannya berlangsung pada akar kuku
dan
yang Malphigi lapisan kuku. Kuku mengandung keratin keras dan proses pertumbuhannya
mirip dengan korteks rambut. Obat-obatan dianggap diangkut dari darah ke
sel-sel matriks kuku di pembuluh kapiler yang terletak di sekitar akar kuku. Obat yang
dimasukkan ke dalam kuku
sangat stabil seperti pada rambut. Laju pertumbuhan kuku dilaporkan masing-masing 3-5 mm
[13] dan 1,1 mm [14 ]
per bulan untuk jari tangan dan kaki, meskipun mereka berbeda sampai batas tertentu menurut
musim. Terlepas dari kenyataan bahwa mekanisme serupa memang ada di kuku untuk
transportasi dan
akumulasi obat dengan yang ada di rambut, laporan tentang analisis kuku tidak banyak. Pada
tahun 1984 ,
Suzuki et al. [15] pertama kali melaporkan deteksi amfetamin dari kuku penyalahguna
metamfetamin. Sejak itu hanya sedikit laporan tentang deteksi metamfetamin dari kuku yang
dilaporkan [9, 16].
Prosedur analitis untuk kuku bisa serupa dengan yang dilakukan pada rambut. Sebelum ekstraksi,
kuku
harus dicuci dengan metanol dan air untuk menghindari kontaminasi eksogen. Ekstraksi
dapat dilakukan setelah pelarutan dalam 2,5 M NaOH dengan pemanasan atau setelah
penghancuran dalam 0,6 HCl . Meskipun laporan analisis kuku tidak banyak, kegunaannya
tampaknya sebanding dengan
analisis rambut, mengingat kemampuan identifikasi obat yang sebelumnya diberikan dan
estimasi
jumlah dan waktu (periode) pemberian [9]. Kuku tampaknya layak dipertimbangkan sebagai
spesimen alternatif yang baik untuk subjek antemortem dan postmortem.
Air liur
Saat itu di pertengahan 1950-an ketika obat dilaporkan bergerak dari darah ke air liur [1]. Sejak
itu banyak peneliti memeriksa kegunaan analisis air liur, dan mengklarifikasi bahwa konsentrasi
obat dalam air liur mencerminkan mereka dalam darah, menunjukkan hubungan yang erat
dengan efek farmakologis dan dapat digunakan untuk perhitungan dalam farmakokinetik. Baru-
baru ini, air liur sedang
dicoba untuk pemantauan obat terapeutik dan untuk mendeteksi mengemudi di bawah pengaruh
obat di dunia. Obat-obatan biasanya diekskresikan ke dalam air liur dalam bentuknya yang tidak
berubah. Rasio konsentrasi saliva dengan darah cenderung kurang dari 1 untuk obat asam dan
netral, dan lebih
dari 1 untuk obat dasar; rasio ini juga tergantung pada nilai pH saliva [17]. Rasio alkohol sekitar
1,1 dan tidak dipengaruhi oleh pH saliva [18].
Air liur dapat dengan mudah disampel dengan meludah langsung ke tabung; bola kapas kecil,
yang telah
ditimbang, dapat ditempatkan tepat di bawah lidah dan disimpan di sana untuk sementara waktu
untuk penyerapan
air liur ke dalam kapas. Ini semua non-invasif. Dimungkinkan untuk meningkatkan sekresi air
liur dengan
menggigit pelat Teflon atau karet gelang; asam sitrat juga berguna untuk merangsang sekresi.
Namun, harus diingat bahwa selama perubahan dalam tingkat sekresi, jumlah
obat yang diekskresikan ke dalam air liur dapat berubah sesuai dengan perubahan pH-nya [17].
Hubungan yang erat antara konsentrasi obat dalam darah dan air liur hanya dapat ditemukan
dalam kondisi yang dikontrol secara ketat. Ini berarti bahwa sulit untuk menentukan
konsentrasi obat dalam darah dari hasil analisis saliva pada kasus yang sebenarnya. Namun,
analisis obat
menggunakan air liur secara kualitatif bermanfaat untuk membuktikan penggunaan obat, ketika
kontaminasi dikecualikan.
Saliva
12 Spesimen alternatif
Keringat
Keringat adalah cairan yang dikeluarkan dari kelenjar keringat ( tipe ekrin dan
apokrin). The ekrin kelenjar
didistribusikan secara luas di permukaan seluruh tubuh. Kelenjar apokrin terletak di
daerah aksila, mamaria, genital, dan perianal. Kelenjar di bawah kendali saraf simpatik; tetapi
sebagian besar kelenjar adalah kolinergik dan sebagian kecil adrenergik. Volume ekskresi
maksimal dilaporkan sekitar 2 L / hari pada subyek sehat dan sekitar 4 L / hari pada
atlet olahraga terlatih; tetapi volume dan komponen sangat berbeda sesuai dengan individu, jenis
kelenjar dan berbagai tekanan (emosional, fisik dan termal) [19].
Analisis keringat dimulai pada sekitar tahun 1970, dan menunjukkan bahwa berbagai obat dapat
dideteksi
dari keringat [19]. Johnson dan Malbach [20] melaporkan bahwa ada hubungan yang erat antara
p K  a obat dan jumlahnya ekskresi ke dalam keringat, dan juga antara konsentrasi obat dalam
keringat dan dalam plasma. Namun, pengambilan sampel keringat merupakan masalah; sulit
untuk mengumpulkannya secara
kuantitatif. Dalam kasus aktual, komponen keringat dikumpulkan dengan menyeka permukaan
kulit
dengan kapas, kain kasa atau handuk; Patch keringat PharmChek TM ( PharmChem Lab. Inc ,
Menlo Park , CA, USA) tersedia secara komersial untuk menyerap komponen keringat
[19]. Celana dalam , yang menyerap komponen keringat, digunakan untuk mendeteksi
amfetamin [21]. Komponen yang diserap dapat dielusi dengan air, diikuti oleh ekstraksi obat
sebelum analisis instrumental . Keringat tidak cocok untuk analisis kuantitatif obat, karena
masalah untuk pengambilan sampel. Namun, satu-satunya keuntungan dari penggunaan keringat
adalah semakin lama periode ekskresi obat menjadi keringat; obat dapat dideteksi dari keringat
bahkan 1-4 minggu setelah pemberian tunggal [1]. Meconium Meconium berwarna hijau
kehitaman / kehitaman dan kehitaman, tetapi tidak berbau seperti kotoran anak-anak dan orang
dewasa. Ini berisi vesikel meconium, turun, sel skuamosa, tetesan lipid dan kristal kolesterol. Itu
mulai menumpuk di usus besar pada minggu ke-16 kehamilan, dan tidak dikeluarkan sebelum
lahir; itu dikeluarkan 1-3 hari setelah lahir [22]. Ostrea et al. [23] pertama kali
melaporkan bahwa meconium cocok sebagai spesimen untuk analisis obat pada bayi baru
lahir. Obat, yang telah diberikan kepada wanita hamil, melewati plasenta, mencapai janin , dan
dimetabolisme di hati janin. Obat bersama dengan metabolitnya sebagian diekskresikan ke dalam
empedu dan akhirnya disimpan dalam meconium [24]. Cairan ketuban, yang mungkin
mengandung obat ibu dan metabolitnya, ditelan oleh janin, juga mengakibatkan akumulasi
senyawa dalam mekonium [25]. Sampel meconium mudah; meconium diekskresikan dalam
popok dimasukkan ke dalam wadah. Volume meconium yang akan dianalisis biasanya 0,5-1
g. Ekstraksi cair-cair dan / atau ekstraksi fase padat digunakan [2]. Penulis et al. [26] membuat
analisis obat untuk meconium dan urin dari 50 bayi yang baru lahir yang dilahirkan dari ibu-ibu,
yang telah diduga karena penyalahgunaan obat - obatan mereka , di University of Southern
California Medical Center; karena hasil benzoylecgonine dapat dideteksi dalam 12 kasus; 5
kasus positif untuk meconium dan urin, 3 kasus positif hanya untuk meconium dan 4 kasus
positif hanya untuk urin. Opiat juga terdeteksi dalam 7 kasus; 3 kasus positif untuk meconium
dan urin, 2 kasus positif hanya untuk meconium dan 2 kasus positif hanya untuk urin. Selain itu,
phencyclidine terdeteksi dari meconium dalam satu kasus [26]. 13 Penulis et al. [27] membagi
usus besar yang mengandung meconium menjadi 5 bagian dari bayi yang dilahirkan dari seorang
wanita, yang telah terbiasa menyalahgunakan kokain selama kehamilan, dan
mengukur kadar benzoylecgonine di setiap bagian; tetapi kami memperoleh kadar metabolit
yang serupa (1,86-2,24 ng / g) di setiap bagian. Meconium tidak dapat digunakan untuk
mendeteksi penggunaan obat oleh seorang ibu pada beberapa hari sebelum melahirkan; tetapi ini
berguna untuk digunakan selama periode sebelumnya. Kelebihan dari penggunaan meconium
adalah bahwa konsentrasi obat biasanya tinggi ketika obat itu biasa digunakan oleh seorang ibu
dan jumlah mekonium yang diperoleh cukup besar. Tampaknya menjadi spesimen alternatif yang
lebih baik untuk bayi yang baru lahir hidup daripada rambut dan kuku. Cairan pericardial
Cairan pericardial ada di ruang perikardial; 5–10 mL atau lebih dapat diperoleh, jika mayat
relatif segar. Cairan dapat dengan mudah diambil sampelnya dengan jarum suntik setelah
membuka perikardium. Cairan perikardial belum menarik perhatian sebagai spesimen untuk
analisis obat sampai sekarang. Namun, penulis et al. [3] telah mengklarifikasi kegunaannya
dalam toksikologi forensik dengan memeriksa kasus otopsi. Konsentrasi ( x ) obat asam, netral
dan basa dalam cairan perikardial dibandingkan dengan mereka ( y ) dalam darah vena femoralis
menggunakan mayat baru hampir tanpa perubahan postmortem [4]; ada korelasi yang baik antara
kedua cairan tubuh ( y = 1,03 x -0,034, r = 0,994, n = 16), menunjukkan bahwa konsentrasi obat
dalam cairan perikardial berguna untuk estimasi tingkat keracunan. Rasio konsentrasi obat dalam
cairan perikardial dengan yang ada dalam darah vena femoralis adalah 1,33 ± 0,55
[4]. Kelebihan lain adalah bahwa jumlah cairan perikardial yang cukup dapat diperoleh bahkan
dari tubuh yang benar-benar telah keluar dan cairan bersih dapat langsung digunakan untuk
skrining obat dengan kit immunoassay seperti Triage TM tanpa pretreatment. Selain itu, penulis
et al. [4] melaporkan bahwa nilai rata-rata konsentrasi obat dalam cairan perikardial dan dalam
cairan serebrospinal memberikan nilai yang lebih akurat untuk estimasi konsentrasi obat darah
daripada nilai cairan perikardial saja. Perawatan harus diambil terhadap cairan perikardial yang
mudah terkontaminasi oleh difusi postmortem , ketika sejumlah besar obat ada di
lambung. Mekanisme di mana obat diangkut dari darah ke antemortem cairan
perikardial dianggap difusi pasif. Konsentrasi obat dalam cairan perikardial tampaknya berubah
hampir sejajar dengan yang ada dalam darah; tetapi data yang lebih tepat
tentang hubungan farmakodinamik antara interval dari asupan obat sampai mati dan konsentrasi
cairan perikardial diperlukan. Cairan serebrospinal (CSF) CSF adalah cairan agak kekuningan
yang dikeluarkan dari pleksus choroids ventrikel, dan mengisi ruang ventrikel dan
subaraknoid; kandungan proteinnya serendah sekitar 0,02%. Sekitar 400 mL CSF diproduksi per
hari, dan diangkut ke sinus; jumlah total CSF di sebuah dewasa manusia adalah 100-150 mL
[28]. CSF dapat diambil sampelnya dengan lumbar atau tusukan suboksipital pada inspeksi
postmortem, atau dengan memasukkan tabung vinil tipis ke dalam ventrikel setelah
pengangkatan beberapa bagian otak saat otopsi. Cairan serebrospinal (CSF ) 14 Spesimen
alternatif Hampir tidak ada laporan yang berurusan dengan hubungan antara konsentrasi obat
dalam CSF dan dalam darah kecuali alkohol. Para penulis et al. [4] membandingkan konsentrasi
( x ) obat asam, netral dan basa dalam CSF dengan yang ( y ) dalam darah vena
femoralis; persamaan dan koefisien korelasi adalah: y = 1,28 x -0,055 dan r = 0,991 (n =
16). Rasio konsentrasi obat dalam CSF dengan dalam darah vena femoralis adalah 0,55 ±
0,29. Meskipun nilainya jauh lebih kecil dari 1,0, data konsentrasi obat dalam CSF dapat menjadi
bukti pendukung untuk menilai apakah kematian disebabkan oleh keracunan. Vitreous
humor Vitreous humor adalah cairan seperti gel yang mengisi tubuh vitreous bola
mata. Volume cairan 1-2 mL dapat diperoleh dari satu bola mata dengan tusukan. Humor
vitreous pertama kali digunakan untuk analisis alkohol pada tahun 1966 [29]. Sejak itu, banyak
peneliti mencoba analisis berbagai obat yang disalahgunakan dan terapi dalam humor vitreous,
dan mempelajari hubungan antara konsentrasi obat dalam humor vitreous dan dalam darah
[30]. Penulis et al. [4] juga membuat eksperimen serupa; itu diungkapkan bahwa konsentrasi
obat dalam humor vitreous kadang-kadang membantu untuk penilaian tingkat keracunan, seperti
yang ada di cairan perikardial dan CSF. Namun, tampaknya sulit untuk memperkirakan
konsentrasi obat dalam darah hanya dengan konsentrasi dalam humor vitreous. Volume humor
vitreous terbatas, dan karenanya tidak cocok untuk analisis ekstensif untuk banyak obat. Otot
rangka Garriott [31] dan penulis et al. [3] mengklarifikasi bahwa konsentrasi obat dalam otot
rangka mencerminkan dengan baik dalam darah. Dalam kasus alkohol, rasio otot-ke-darah
dari konsentrasi alkohol biasanya menunjukkan nilai sekitar 1,0. Oleh karena itu, ketika darah
tidak dapat diambil sampelnya atau dicurigai adanya kontaminasi darah, konsentrasi alkohol
dalam otot rangka dapat menjadi indikator untuk tingkat keracunan dan estimasi jumlah yang
dikonsumsi [18, 32]. Meskipun kesetaraan konsentrasi yang diamati untuk alkohol dalam otot
rangka tidak berlaku untuk obat lain [33], konsentrasi obat dalam otot tampaknya sangat
membantu untuk penilaian keracunan dan derajatnya. Selain itu, otot rangka diperoleh dalam
jumlah besar; spesimen berguna dalam kasus-kasus di mana cairan tubuh tidak dapat diambil
sampelnya, dan bahkan dalam kasus-kasus tubuh yang terpotong-potong dan dipotong-potong.

I.3 Jebakan dan peringatan dalam

analisis obat-obatan dan racun
Oleh Fumio Moriya
Pendahuluan
Darah dan urin adalah spesimen umum untuk analisis obat pada kasus antemortem dan
postmortem. Biasanya, urin digunakan untuk skrining obat menggunakan immunoassays pada
langkah pertama;
kedua, obat yang terdeteksi secara kromatografi dikuantifikasi dengan darah. Data yang
diperoleh
dinilai secara hati-hati dengan mempertimbangkan nilai yang dilaporkan dalam referensi
bersama
dengan temuan klinis dan postmortem; penilaian keracunan dan tingkatannya dibuat secara
komprehensif.
Periode antara pengambilan sampel dan analisis dan kondisi penyimpanan sampel sangat
penting untuk penilaian hasil analitik untuk spesimen manusia, terutama untuk
spesimen postmortem ; interval postmortem dan tingkat pembusukan harus selalu
dipertimbangkan. Bahkan dalam vial ( in vitro ) setelah pengambilan sampel dan juga di dalam
postmortem seluruh tubuh, obat-obatan dapat dimetabolisme oleh enzim yang hidup bersama [1,
2]; produksi postmortem [3, 4]
dan dekomposisi [5] dapat terjadi melalui aksi pertumbuhan bakteri. Dalam kasus otopsi,
sumber sampel darah harus dicatat dengan tepat; konsentrasi tinggi dari obat yang
ada di paru-paru, jantung dan hati dapat berdifusi ke dalam jaringan di sekitarnya, menghasilkan
lebih tinggi
konsentrasi obat dalam darah di sana [6]. Ketika sejumlah besar obat hadir di perut, ia berdifusi
ke jaringan di sekitarnya dan postmortem darah [7, 8]. Kandung kemih
terkadang mengandung sejumlah besar urin dengan konsentrasi obat yang tinggi; dalam kasus
seperti itu,
difusi obat dari kandung kemih ke dalam darah vena femoralis dapat terjadi postmortem [9].
Ketika muntah yang mengandung konsentrasi obat yang tinggi disedot ke trakea atau bronkus,
atau agar-agar anestesi lokal diterapkan pada trakea saat intubasi, konsentrasi
obat dalam darah jantung dapat ditingkatkan postmortem [10, 11]. Sekalipun instrumen analitik
sangat bagus, diagnosis keracunan yang benar tidak mungkin dilakukan tanpa
mempertimbangkan fenomena di atas. Dalam analisis obat-obatan dan racun, ada banyak hal
yang harus dipertimbangkan; dalam
bab ini , perangkap dan peringatan disajikan untuk analisis yang benar dalam keracunan.
Metabolisme obat dengan enzim yang hidup berdampingan
Senyawa ester, seperti anestesi lokal, rentan terhadap metabolisme mereka oleh
enzim yang hidup berdampingan ; mereka mudah dimetabolisme postmortem oleh plasma
cholinesterase dalam mayat dan
bahkan secara in vitro setelah pengambilan sampel antemortem [1, 2]. Aktivitas cholinesterase
dalam darah hampir tidak menurun 3 minggu setelah disimpan pada suhu kamar [12]. Kokain,
salah satu
anestesi lokal dan obat-obatan terlarang yang paling populer, sebagian besar dikonversi menjadi
benzoylecgonine oleh reaksi kimia dalam darah antemortem pada pH 7,4, dan sebagian kecil
obat dimetabolisme oleh
plasma cholinesterase untuk menghasilkan ecgonine methyl ester [13]. Yang terakhir ini
selanjutnya didekomposisi menjadi
ecgonine oleh hidrolisis kimia dengan sangat cepat dan dengan demikian tidak terakumulasi
dalam darah makhluk hidup.
Masalah dan peringatan dalam analisis obat-obatan dan racun
persimpangan [13]. Dalam kasus darah postmortem, nilai pH darah dengan cepat menurun
karena
postmortem glikolisis anaerob, sehingga tidak ada hidrolisis kimia kokain menjadi
benzoylecgonine tetapi dalam akumulasi ester metil ester oleh aksi coolinisting
cholinesterase [13]. Oleh karena itu, konsentrasi kokain dalam darah pada titik kematian
dilaporkan diperkirakan secara tepat dengan menyimpulkan konsentrasi kokain dan ekgonin
metil ester [14].
Untuk mencegah senyawa ester dari dekomposisi dalam darah, penambahan NaF,
penghambat cholinesterase, pada konsentrasi sekitar 1% direkomendasikan. Kokain
nampak stabil dalam darah selama 2-3 minggu di hadapan NaF dalam lemari es [2]. Namun,
dalam
kasus tetracaine, penambahan neostigmin diperlukan sebagai pengganti NaF untuk
menekan metabolisme
in vitro  sepenuhnya. Harus disebutkan bahwa dichlorvos, pestisida organofosforus tipe ester,
terurai lebih mudah dengan adanya NaF [15].
Heroin lebih rentan terhadap dekomposisi oleh plasma cholinesterase daripada kokain; yang
paruh reaksi dalam kehidupan subyek hanya beberapa menit [13]. Oleh karena itu, sulit
untuk mendeteksi heroin dari darah mayat, yang telah menerima injeksi intravena hanya
beberapa
menit sebelumnya [16]; tetapi 6-monoacetylmorphine, metabolit utama heroin, relatif
stabil dalam darah dan postmortem yang dapat dideteksi [16].
Produksi postmortem dan dekomposisi senyawa
oleh bakteri putrefactive
Berbagai jenis senyawa adalah postmortem yang diproduksi oleh bakteri yang tumbuh dalam
spesimen manusia; terutama senyawa alkohol dan amina harus dicatat dalam analisis
toksikologis.
Etanol paling umum diproduksi oleh fermentasi. The in vitro produksi etanol di
darah dan urin jauh lebih sedikit dibandingkan produksinya di dalam mayat, dan biasanya tidak
memberikan masalah
di bawah kondisi penyimpanan pada suhu 4 ° C selama seminggu. Namun, ketika sejumlah besar
glukosa dan kontaminasi ditandai oleh bakteri hadir, jumlah etanol yang tidak dapat diabaikan
dapat diproduksi dalam
spesimen yang dikumpulkan. Untuk membedakan etanol yang dihasilkan postmortem dari
antemortem
satu, n-propanol dapat digunakan sebagai indikator, karena diproduksi oleh bakteri secara
bersamaan [3].
Konsentrasi n-propanol tidak lebih rendah dari 5% dari konsentrasi etanol postmortem [3].
Amina yang paling khas yang dihasilkan selama pembusukan adalah β -
phenylethylamine. Strukturnya
mirip dengan amfetamin. Kesamaan amina kadang-kadang memberikan
hasil positif palsu selama skrining oleh immunoassays [17, 18].
Dalam analisis obat dalam spesimen yang dikumpulkan dari mayat yang dibunuh terutama oleh
cedera parah, diikuti oleh perawatan medis intensif, diperlukan kehati-hatian khusus. Dalam
mayat seperti itu,
jumlah yang tidak dapat diabaikan dari etanol dan β -phenylethylamine kadang-kadang
diproduksi oleh
aksi translokasi bakteri [19,21].
Reaksi metabolik untuk obat oleh bakteri pada dasarnya reduktif; nitro, N-
oksida, oksim,
thiono, heterosiklik yang mengandung sulfur dan senyawa aminofenolat diketahui terurai dengan
cepat [5]. Robertson dan Drummer [22] melaporkan bahwa obat nitrobenzodiazepine
dimetabolisme menjadi bentuk tereduksi 7-amino oleh bakteri enterik dan bahwa reaksi reduksi
tersebut tidak dapat ditekan dengan menambahkan NaF. Penulis et al. dikumpulkan korteks
serebral, diencepalon, otak kecil dari pengguna nitrazepam di otopsi, dan diukur nitrazepam dan
7-aminonitrazepam baik segera dan 10 hari (pada suhu 4 ° C) setelah otopsi seperti yang
ditunjukkan pada > Tabel 3.1  .
19
Reaksi reduktif untuk nitrazepam berlangsung setelah penyimpanan spesimen pada 4 ° C, tetapi
reaksi tersebut dapat sepenuhnya ditekan pada –20 ° C [22].
Clozapine, obat antipsikotik, adalah antemortem yang mudah dimetabolisme menjadi
bentuk N- oksida,
yang terakumulasi dalam darah subjek yang hidup; metabolit dapat sebaliknya dikurangi untuk
membentuk
clozapine prekursor dalam mayat dan dalam darah yang disimpan dalam botol oleh aksi bakteri.
Rasio konsentrasi masing-masing bentuk bebas untuk setiap bentuk opiat terkonjugasi
glukuronat
dalam darah diketahui membantu memperkirakan interval setelah pemberiannya; tetapi bentuk
terkonjugasi dapat dihidrolisis untuk membentuk opiat bebas oleh metabolisme bakteri, ketika
pertumbuhan bakteri ditandai [23].
Redistribusi obat
postmortem Redistribusi postmortem lebih umum untuk obat-obatan dasar, yang memiliki
afinitas tinggi pada
paru - paru, otot jantung dan hati dan menunjukkan daerah distribusi yang luas [6]. Obat-obatan
ini sebagian dibebaskan dari jaringan dengan kandungan tinggi, menembus dinding pembuluh
dan berdifusi ke dalam darah, menghasilkan
konsentrasi obat yang lebih tinggi dalam jaringan di sekitarnya daripada konsentrasi sebenarnya
pada saat
kematian. Setelah kematian, pasokan oksigen dan ATP, dan fungsi memompa Na + / K + dari
membran sel berhenti; kemudian selaput sel dan organel rusak. Di dalam sel, ikatan protein yang
membutuhkan energi dengan obat dihambat, dan pH diturunkan sebagai akibat dari akumulasi
asam laktat yang dihasilkan oleh glikolisis anaerob. Kondisi sel ini menyebabkan obat dasar
lebih mudah berdifusi keluar sel.
Holt dan Benstead [24] pertama kali menunjukkan peningkatan konsentrasi obat postmortem
darah sebagai akibat dari redistribusi; mereka menemukan konsentrasi yang lebih tinggi dari
digoxin dalam darah
jantung daripada dalam darah vena femoralis dalam kasus otopsi dari pengguna digoxin. Jones
dan
Pounder [25] melaporkan hasil analitik dari imipramine dan metabolit desipramine dalam darah
dan berbagai organ korban, yang telah meninggal dengan menelan imipramine dan
acetaminophen
bersama-sama dengan alkohol (interval postmortem: 12 jam); ketika konsentrasi imipramine
(2,3 μg / mL) dan desipramine (1,5 μg / mL) dalam darah perifer diasumsikan sebagai 1,0, nilai
relatifnya
adalah 2,3 dan 2,2 dalam darah aorta toraks, 2,1 dan 1,4 dalam darah vena inferior
cava, 3,5 dan 3,4 dalam darah arteri pulmonalis, 7,0 dan 7,1 dalam darah vena paru,
70 dan 115 di paru-paru, dan 78 dan 52 di hati, masing-masing. Data di atas menunjukkan bahwa
konsentrasi imipramine dalam darah arteri pulmonalis dan vena lebih tinggi dari pada
darah vena cava inferior, meskipun konsentrasi imipramine di paru-paru hampir
sama dengan di hati, menunjukkan bahwa difusi obat ke dalam darah lebih ditandai
⊡ Tabel 3.1 Perubahan postmortem dalam tingkat (μg / g) nitrazepam dan 7-aminonitrazepam
selama penyimpanan in vitro spesimen yang diperoleh dari pengguna nitrazepam di
autopsi Spesimen Segera setelah otopsi 10 hari setelah otopsi * Nitrazepam 7-
Aminonitrazepamepam 7-Aminonitrazepam Korteks serebral 3.49 2.55 0.626 5.11 Diencephalon
6.22 2.49 4.61 3.82 Cerebellum 2.17 5.11 0.545 6.55 * Disimpan pada suhu 4 ° C. Redistribusi
obat postmortem 20 Jebakan dan peringatan dalam analisis obat dan racun untuk paru-paru
daripada untuk hati. Hilberg et al. [26] melaporkan, menggunakan tikus, bahwa
konsentrasi amitriptyline dan metabolit nortriptyline dalam darah jantung meningkat dalam 2
jam setelah kematian, dan mereka yang dalam darah vena cava inferior meningkat lebih dari 5
jam setelah kematian. The Penulis et al. [27, 28] juga mengklarifikasi bahwa obat-obatan dasar
didistribusikan dalam jaringan paru-paru pada konsentrasi tinggi postmortem difus, melalui
dinding tipis vena paru, ke dalam darah vena dan selanjutnya didistribusikan ke dalam darah
atrium kiri jantung; ini adalah mekanisme konsentrasi obat-obatan dasar yang lebih tinggi dalam
darah jantung. Peningkatan kadar obat dalam darah jantung kanan kurang dari pada darah
jantung kiri. Dalam banyak kasus otopsi, konsentrasi obat dalam darah jantung kanan mirip
dengan darah tepi (pada vena femoralis) ( > Gambar 3.1)  . Oleh karena itu, darah jantung kanan
bersama dengan darah perifer tampaknya menjadi spesimen yang baik untuk penentuan tingkat
obat darah yang benar, ketika mayat relatif masih segar [29]. Perhatian diperlukan terhadap
gerakan postur tubuh pada inspeksi postmortem dan selama pengangkutannya dapat
menyebabkan aliran darah dalam pembuluh dan dengan demikian meningkatkan distribusi ulang
obat-obatan tersebut. ⊡ Gambar 3.1 Variasi konsentrasi obat dalam darah yang diperoleh dari
lokasi yang berbeda dari masing-masing mayat. Spesimen darah diperoleh dari mayat baru, yang
telah menelan berbagai obat, dengan hampir tidak ada perubahan postmortem. Setiap nilai
dinyatakan sebagai rasio konsentrasi dalam darah dari lokasi target dengan dalam darah vena
femoralis untuk setiap korban dan untuk setiap obat. Semua nilai yang diperoleh dari darah di
setiap lokasi rata-rata terlepas dari jenis obat. Batang menunjukkan rata-rata ± SD (n = 11-
16). Obat yang terdeteksi adalah: fenobarbital, fenitoin, efedrin, diazepam, nordiazepam,
lidokain, metamfetamin, kodein, barbital, zotepin, amitriptyline, dan nortriptyline. 21 Difusi
postmortem obat dari lambung dan kandung kemih. Etanol paling baik dipelajari untuk
difusi postmortem dari lambung. Pounder dan Smith [7] melaporkan bahwa cairan tubuh yang
paling dipengaruhi oleh difusi etanol lambung adalah cairan perikardium, diikuti oleh darah vena
paru kiri, aorta, jantung kiri, arteri pulmonalis , vena cava superior, vena cava inferior, kanan
jantung dan vena paru kanan; darah di vena femoralis hampir tidak terpengaruh. Difusi etanol
postmortem dari lambung tergantung pada jumlah residu etanol dalam lambung, interval fisik
dan postmortem. Dalam kasus aktual, difusi seperti itu menjadi masalah, ketika lebih dari 100 g
konten yang mengandung lebih dari beberapa persen etanol ada di perut dan interval postmortem
lebih lama dari satu hari. Tidak banyak penelitian dasar yang belum dilaporkan mengenai difusi
postmortem dari obat-obatan umum dari lambung. Suatu obat dapat berdifusi dari lambung
postmortem ke dalam jaringan di sekitarnya dan cairan tubuh di hadapan sejumlah besar (lebih
dari beberapa sepuluh mg) obat di lambung dengan interval postmortem yang panjang. Namun,
darah vena femoralis dan subklavia hampir tidak terpengaruh sekitar 2 hari setelah kematian
[8]. Meskipun difusi postmortem suatu obat dari kandung kemih jarang terjadi, dapat terjadi
dengan adanya sejumlah besar urin yang mengandung kandungan obat yang tinggi. Penulis et
al. [9] mengalami kasus otopsi dari penyalahguna obat, di mana diphenhydramine dan
dihydrocodeine berdifusi dari kandung kemih, menghasilkan peningkatan yang luar biasa
dalam konsentrasi mereka dalam vena femoralis; walaupun interval postmortem adalah 9
hari, pembusukan tidak begitu ditandai karena musim dingin. Jumlah urin dalam kasus ini adalah
sebesar 600 mL, dan konsentrasi diphenhydramine dan dihydrocodeine di dalamnya
adalah masing-masing 22,6 dan 37,6 ug / mL; konsentrasi mereka dalam vena femoralis yang
1,89 dan 3,27 μ g / mL, yang jauh lebih tinggi daripada mereka (0,204-0,883 dan 0,173-
1,01 μ g / mL) yang diperoleh dari bagian lain dari sirkulasi, masing-masing. Meskipun diterima
secara tegas oleh ahli kimia forensik bahwa darah vena femoralis paling cocok untuk
analisis obat postmortem , tampaknya berbahaya untuk hanya menggunakan darah vena
femoralis untuk analisis obat karena pengalaman kami di atas. Difusi postmortem obat dari
trakea ke dalam darah jantung. Dalam kasus otopsi, di mana vomitus yang mengandung
sejumlah besar obat disedot ke dalam trakea, difusi postmortem dari obat ke jaringan sekitar
trakea, terutama ke dalam darah jantung, harus dipertimbangkan [10]. Dalam praktik sains
forensik, etanol merupakan kasus difusi seperti itu dari trakea [10]. Dalam kasus aspirasi etanol,
ceritanya menjadi rumit, karena baik difusi dari trakea dan dari lambung terjadi
bersamaan. Tidak banyak laporan yang membahas perbandingan difusi dari trakea dengan yang
dari perut. Kecepatan difusi postmortem toluena dari trakea dilaporkan lebih cepat dari pada
lambung, setelah pelarut yang lebih tipis disuntikkan ke trakea dan lambung mayat manusia
[30]. Menurut percobaan, di mana etanol, parasetamol, dan dekstropropoksifen dimasukkan
ke dalam trakea, obat-obatan berdifusi ke dalam darah vena paru-paru dan arteri paling cepat,
diikuti oleh darah jantung, vena cava superior dan aorta [31]. Difusi obat postmortem dari trakea
ke dalam darah jantung 22 Jebakan dan peringatan dalam analisis obat dan racun Di
Jepang, jeli Xylocaine TM biasanya digunakan pada intubasi endotrakeal dalam pengobatan
darurat; kami sering mengalami deteksi lidokain dari darah karena intubasi pada mayat, yang
telah menerima resusitasi kardiopulmoner [32]. Meskipun banyak korban tanpa mendapatkan
kembali detak jantung dimasukkan dalam kasus resusitasi seperti itu, konsentrasi lidokain yang
relatif tinggi dapat dideteksi dari darah jantung mereka [11]. Distribusi lidokain, yang telah
digunakan pada intubasi endotrakeal, dalam cairan tubuh dan organ dari 4 korban, yang tidak
mendapatkan kembali detak jantung, ditunjukkan pada > Tabel 3.2 . Interval postmortem
adalah sesingkat 12 ~ 20 jam, tetapi difusi cepat postmortem dari obat dari trakea menjadi darah
jantung (terutama darah jantung kiri) diamati; tidak ada pengaruh pada darah vena
femoralis. Tingkat lidokain sangat meningkat dalam darah jantung kiri, mungkin karena lidokain
dalam trakea berdifusi melalui dinding tipis vena paru menjadi darah dan kemudian pindah ke
atrium kiri jantung. Lidocaine di trakea tampaknya berdifusi ke dalam darah arteri
pulmonalis. Namun, kecepatan difusi lambat karena dinding tebal ⊡ Tabel 3.2 Konsentrasi
Lidocaine dalam berbagai cairan dan organ tubuh yang diperoleh dari 4 korban yang
tidak mendapatkan kembali detak jantung setelah perawatan resusitasi * Spesimen Konsentrasi
Lidocaine (μg / mL atau ug / g) Kasus 1 Kasus 2 Kasus 3 Kasus 4 Darah arteri paru - - -
2,04 Darah vena paru - - - - 2,29 Darah jantung kiri 0,349 1,02 - 1,55 Darah jantung kanan 0,102
0,209 - 0,699 darah Aorta - - 0,642 - Darah vena cava superior - - 0,746 - Darah vena cava
inferior 0,195 0,163 0,133 0,491 Darah vena Iliac - 0,074 0,057 0,152 Darah vena kewanitaan -
0,015 ND Cairan serebrospinal ND - - 0,191 Humor cairan - - - 0,007 Cairan perikardium 0,193
0,097 0,171 0,489 Empedu - - ND Urine - ND Cerebrum ND ND ND 0,044 Paru kiri - 10,9 1,37
9,33 Paru kanan - 2,65 1,41 2,60 Otot jantung - - - 0,186 Liver ND ND ND 0,183 Ginjal kanan -
ND ND 0,020 Otot kanan femoralis ND ND ND ND * Xylocaine TM jelly digunakan saat
intubasi. ND: tidak terdeteksi. Kasus 1: 3,5 bulan wanita, resusitasi 5 menit, interval postmortem
sekitar 20 jam. Kasus 2: 44 tahun pria, resusitasi 5 menit, interval postmortem sekitar 20
jam. Kasus 3: 38 tahun pria, resusitasi 60 menit, interval postmortem sekitar 20 jam. Kasus 4:
wanita 60 tahun, resusitasi 20 menit, interval postmortem sekitar 12 jam. 23 arteri; darah arteri
pulmonalis sulit mengalir ke ventrikel kanan jantung. Ini tampaknya menjadi alasan mengapa
konsentrasi lidokain lebih tinggi dalam darah jantung kiri daripada dalam darah jantung
kanan. Difusi postmortem dari lidokain dari trakea juga dikonfirmasi oleh percobaan dengan
kelinci [11]. Ahli kimia analitik harus selalu menyadari fenomena seperti itu bagi para korban
yang telah menerima perawatan medis darurat. Penanggulangan Seperti disebutkan di atas,
ketika penanganan spesimen tidak hati-hati, dapat menyebabkan variasi konsentrasi obat
yang serius tergantung pada jenis obat pada analisis mereka. Penyimpanan sementara spesimen
dapat dilakukan pada suhu 4 ° C dalam lemari es; tetapi mereka harus dijaga pada –20 ° C
atau lebih disukai pada –80 ° C sampai analisis, ketika interval antara pengambilan sampel dan
analisis lebih dari satu minggu. Ketika senyawa ester dan nitro dianalisis, penambahan bahan
pengawet yang sesuai (biasanya NaF dan / atau NaN 3 ) harus dipertimbangkan. Dalam kasus
otopsi, spesimen darah harus dikumpulkan dari atrium / ventrikel kedua sisi, dan juga dari vena
femoralis; data analitik dari lokasi yang berbeda harus dinilai. Untuk para korban, yang telah
menerima perawatan medis, analis harus mengetahui rincian perawatan dan proses klinis
I.4 Pretreatment
spesimen manusia
Oleh Akira Namera dan Mikio Yashiki
Pendahuluan
Sejumlah kecil obat-obatan dan racun yang dimasukkan ke dalam tubuh manusia tersembunyi di
antara
sejumlah besar komponen biologis, seperti protein, lipid, asam nukleat, dan membran. Tidak
mudah mendeteksi hanya senyawa target dari matriks rumit tersebut. Sebelum analisis
instrumental, prosedur ekstraksi biasanya penting dan sangat penting. Metode ekstraksi
digunakan untuk menghilangkan protein dan lipid yang ada dalam jumlah besar dalam matriks
biologis,
untuk menghilangkan senyawa pengotor yang mengganggu pemisahan kromatografi, untuk
kondensasi senyawa target, dan untuk menghilangkan senyawa yang menyebabkan masalah
(seperti penyumbatan kolom kromatografi dan kontaminasi detektor) dalam analisis
instrumental.
Ada banyak metode ekstraksi, sesuai dengan senyawa target. Dalam bab ini,
penulis menyajikan secara singkat beberapa metode pretreatment termasuk ekstraksi dan
derivatisasi yang
biasanya digunakan dalam analisis biomedis. Banyak ulasan dan buku tentang rincian ekstraksi
tersedia [1-5].
Metode ekstraksi
Menurut kemajuan instrumen analitis, ada beberapa laporan tentang analisis
senyawa menggunakan sampel biologis kasar tanpa prosedur ekstraksi yang membosankan (atau
dengan pengenceran dengan air saja); ini semata-mata tergantung pada kemampuan instrumen
yang tinggi. Namun, mengingat stabilitas dan masa pakai alat, diinginkan untuk membuat
perlakuan awal yang sesuai. Dalam pengobatan darurat, di mana waktu yang lama untuk analisis
tidak diizinkan, metode ekstraksi cepat dengan langkah pemurnian minimal dipilih untuk
memenuhi permintaan tersebut.
Untuk ekstraksi senyawa polar atau ionik, spesimen biologis dapat diasamkan dengan
asam tartarat, diikuti dengan penambahan aseton atau etanol, pengocok campuran dan
sentrifugasi. Untuk mengekstraksi logam, senyawa organik dalam spesimen biologis harus
dihancurkan sepenuhnya ; metode pembakaran kering atau basah digunakan. Untuk detail
prosedur,
pembaca dapat merujuk ke buku-buku [3, 6]. Para penulis menggambarkan beberapa metode
ekstraksi hanya untuk
senyawa organik sebagai berikut.
Metode deproteinisasi
Dalam analisis obat dan racun pada spesimen manusia, senyawa utama yang mengganggu adalah
komponen protein dan lipid. Untuk menghilangkan molekul-molekul ini, metode berikut sedang
digunakan.
26 Pretreatment spesimen manusia
i. Ultrafiltrasi
Ultafiltrasi adalah metode pemisahan menurut ukuran molekul senyawa, dan juga
digunakan untuk menghilangkan makromolekul. Banyak jenis filter dengan berbagai ukuran pori
untuk melewati
makromolekul (30.000, 10.000 dan 5.000 dalton) tersedia secara komersial (Millipore ,
Advantec atau Whatman). Keuntungan dari metode ini adalah kesederhanaan penanganan dan
volume kecil (<0,5 mL) sampel cairan yang diperlukan. Namun, tidak mungkin memisahkan
obat
atau racun dari senyawa ukuran sedang dan kecil endogen dengan metode ini.
ii. Sedimentasi
Dengan menambahkan asam atau pelarut organik ke spesimen, protein dapat didenaturasi untuk
membentuk
agregat yang tidak larut , yang dapat dengan mudah dihilangkan dengan sentrifugasi. Reagen
yang banyak digunakan untuk
sedimentasi adalah: metanol atau asetonitril, asam trikloroasetat atau asam lain, dan amonium
sulfat atau tungstat. Jenis metode ini sederhana, relatif cepat dan karenanya cocok untuk
digunakan dalam
pengobatan darurat. Analis, bagaimanapun, harus berhati-hati terhadap kehilangan senyawa
target yang serius, karena penggabungan mereka ke dalam makromolekul teragregasi dan
terendapkan.
aku aku aku. Dialisis
Membran semipermeabel tipe tubular biasanya digunakan untuk ekstraksi
senyawa molekul rendah dengan dialisis. Biasanya, volume cairan spesimen kasar dikemas
dalam
tabung membran , yang kemudian dimasukkan ke dalam sejumlah besar pelarut organik dalam
gelas dengan pengadukan
batang magnet berlapis Teflon. Karena pergerakan obat berhenti, ketika keseimbangan dicapai
antara solusi dalam dan luar, pemulihan lengkap tidak dapat dicapai dengan
ekstraksi tunggal . Meskipun prosedur penanganannya sendiri sangat sederhana, dibutuhkan
waktu yang lama untuk mencapai
keseimbangan sesuai dengan jenis senyawa target; metode ini tidak cocok untuk
perawatan banyak spesimen.
Headspace metode
Sebuah spesimen dimasukkan dalam botol dengan septum topi Teflon, dan menghangatkan (atau
dipanaskan) dalam bak air
atau di blok pemanas. Setelah waktu pemanasan yang tepat, jarum jarum suntik dimasukkan
melalui
septum untuk menarik gas ruang angkasa yang mengandung senyawa target. Metode ini sangat
cocok untuk analisis kromatografi gas. Metode headspace banyak digunakan untuk analisis
senyawa volatil, tetapi tidak cocok untuk senyawa termolabil. Ini digunakan untuk analisis etanol
dan toluena [5]; dan juga digunakan untuk senyawa semi-volatil seperti amfetamin [7].
Metode ekstraksi cair-cair
Banyak obat atau racun menunjukkan sifat hidrofobik, walaupun tingkat hidrofobisitasnya
berbeda dalam senyawa yang berbeda. Dengan memanfaatkan kelarutan dalam pelarut organik
(perbedaan
dalam koefisien partisi), obat-obatan dan racun dapat diekstraksi dari spesimen berair ke
dalam pelarut organik dengan mengocoknya. Berbagai metode modifikasi ekstraksi cair-cair
dilaporkan; masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan. Contoh metode
ditunjukkan pada > Gambar 4.1 .
27
Metode ini memungkinkan ekstraksi selektif obat sesuai dengan sifat-sifat senyawa (keasaman
atau kebasaan). Cara transfer obat dari fase ke fase lain sudah
diketahui secara empiris dan dapat diperkirakan secara fisikokimia; ini sangat berguna untuk
analisis
senyawa yang tidak diketahui. Namun, selama ekstraksi dari spesimen dengan protein dan tinggi
isi lipid dengan metode ini, pembentukan emulsi kadang-kadang muncul dan membuatnya sulit
untuk
memisahkan dua fase cair dengan jelas.
Extrelut ® adalah diatomit dengan struktur berpori, dan dapat menyerap dan mempertahankan
fase air pada permukaannya. Spesimen berair kasar dapat langsung diterapkan
ke kolom Extrelut ® ; kemudian pelarut organik, yang tidak larut dengan air, digunakan untuk
mengelusi suatu obat.
Meskipun prosedur ini sangat mirip dengan ekstraksi fase padat, prinsip Extrelut ® pada
dasarnya adalah ekstraksi cair-cair, yang terjadi antara
fase berair dan organik pada permukaan diatomit. Kelebihan dari
penggunaan kolom Extrelut ® adalah emulsi tidak terbentuk bahkan untuk spesimen darah
lengkap.
Contoh pemisahan obat dengan ekstraksi cair-cair (dikutip dari referensi 2).
⊡ Gbr. 4.1 Metode ekstraksi 28 Pretreatment spesimen manusia Ekstraksi fase padat Ekstraksi
fase padat digunakan untuk pemisahan obat dari komponen biologis dengan
memanfaatkan afinitas berbeda pada bahan kemasan (fase diam) [8]. Awalnya, bahan alami
seperti silika gel digunakan; tetapi baru-baru ini, banyak jenis bahan pengemasan,
yang terikat dengan berbagai gugus fungsi dan bahan polimer ( > Tabel 4.1) , telah
dikembangkan dan telah tersedia secara komersial. Oleh karena itu, rentang pilihan mereka telah
ditingkatkan secara luas. Untuk jenis asli kolom fase padat (kartrid), aktivasi bahan kemasan
sebelum digunakan diperlukan dan bahan tidak dapat dikeringkan selama prosedur. Seperti
ditunjukkan dalam > Gambar 4.2 , bagaimanapun, item baru untuk ekstraksi fase padat
tanpa perlu aktivasi seperti (abselut TM NEXUS, Varian) dan tanpa perlu peduli tidak
mengering kolom (Oasis ® , Waters) telah dikembangkan. Untuk mewujudkan throughput tinggi
untuk ekstraksi , piring untuk ekstraksi simultan sebanyak 96 sampel sekarang tersedia secara
komersial. Kondensasi diperlukan untuk volume besar larutan yang dielusi setelah ekstraksi fase
padat. Prosedur ini membutuhkan waktu yang lama, ketika volume eluen besar dan
volatilitas eluen relatif rendah. Baru-baru ini, cakram tipis (Empore Disk ® , 3M), yang
memungkinkan adsorpsi obat yang efisien dan elusi yang efisien hanya dengan sejumlah kecil
pelarut, telah dikembangkan. Ekstraksi mikro fase padat Ekstraksi mikro fase padat adalah
metode yang menggunakan adsorpsi obat ke fase diam yang dilapisi serat yang melekat pada
microsyringe [9, 10]. Obat yang diadsorpsi didesorpsi di dalam port injeksi instrumen GC pada
suhu tinggi, di dalam antarmuka instrumen HPLC atau di dalam kapiler CE, untuk memasukkan
obat ke dalam setiap instrumen analitis. Untuk mengadsorpsi obat-obatan , metode headspace
dan metode perendaman langsung sedang digunakan. Baru-baru ini, magnet pengaduk
khusus dilapisi dengan fase diam telah tersedia secara komersial (Twister TM ,
Gerstel). ⊡ Tabel 4.1 Jenis dan karakteristik dari berbagai bahan kemasan untuk ekstraksi fase
padat Packing bahan Karakteristik oktadesil (C 18 ) fase grup Reversed: sangat hidrofobik Grafit
karbon fase Terbalik: yang sangat hidrofobik Oktil (C 8 ) fase grup Terbalik: hidrofobik fase
Silica normal: polar dan netral Florisil Fase normal: polar dan basa lemah Alumina A Fase
normal: penukar kation asam dan polar Pertukaran kation Penukar anion Pertukaran anion Mode
campuran Fase terbalik (C 8 ) ditambah penukar kation Kelompok Aminopropyl (NH2) Fase
normal, fase terbalik atau lemah kation exchanger Kelompok Cyanopropyl (CN) Fase normal
atau fase terbalik fase Diol (OH) Fase normal atau fase terbalik 29 Derivatisasi Derivatisasi
senyawa biasanya digunakan untuk volatilisasi dan stabilisasi senyawa non-volatil atau
termolabil, untuk modifikasi menjadi bentuk yang sesuai. dideteksi oleh detektor spesifik
(misalnya, pentafluorobenzilasi untuk ECD GC dan dansilasi untuk deteksi fluoresensi oleh
HPLC) dan untuk mendeteksi puncak fragmen molekul tinggi dalam spektrometri massa. Selain
itu, senyawa polar (ionik) kadang-kadang dikonversi menjadi senyawa non-polar dengan
mengikat gugus hidrofobik untuk ekstraksi efisien produk turunan ke dalam pelarut organik. Para
penulis secara singkat menyebutkan beberapa metode derivatisasi yang banyak digunakan dalam
analisis biomedis sebagai berikut. Untuk perincian tentang reagen dan prosedur, pembaca dapat
merujuk ke buku [11] atau selebaran instruksi yang dilampirkan pada setiap reagen
derivatisasi. Prosedur penanganan ekstraksi fase padat. ⊡ Gambar 4.2 Derivatisasi 30
Pretreatment spesimen manusia Alkilasi Salah satu metode derivatisasi yang paling populer
adalah alkilasi; gugus alkil, seperti gugus metil atau propil, dapat terikat pada senyawa asam atau
amino menggunakan tetrabutil ammonium (TBA) atau pentafluorobenzyl bromide (PFB-
Br). Asam organik, asam salisilat dan asam barbiturat sering dialkilasi untuk analisis
GC. Asilasi Asilasi juga banyak digunakan untuk derivatisasi gugus amino, hidroksil, dan tiol,
dan meningkatkan pemisahan kromatografi dengan menekan adsorpsi non-spesifik ke kolom
kromatografi gas; trifluoroacetyl chloride (TFA-Cl) dan p  -nitrobenzoyl chloride digunakan
sebagai reagen untuk asilasi. Kondisi anhidrat diperlukan untuk reaksi sesuai dengan jenis reagen
derivatisasi. Untuk analisis amfetamin, trifluoroasetilasi banyak digunakan untuk mencegah
mereka dari adsorpsi ke port injeksi dan untuk mendeteksi ion fragmen dalam rentang massa
yang lebih tinggi. Namun, turunan trifluoroacetyl menderita ketidakstabilan dan kehilangan
karena penguapan. Sililasi Ini adalah reaksi untuk mengubah senyawa yang tidak mudah
menguap akibat aksi dipol dari kelompok donor hidrogen seperti hidroksil, fenol, asam
karboksilat dan gugus amino menjadi yang mudah menguap . Pola fragmentasi karakteristik
membuat analisis struktur lebih mudah. Derivatisasi sililasi biasanya digunakan untuk analisis
morfin dan kodein. Meskipun senyawa-senyawa ini dapat dianalisis dengan GC ( / MS) dalam
bentuk yang tidak terdelivatisasi, derivatisasi memberikan banyak peningkatan bentuk puncak
dan peningkatan sensitivitas. Esterifikasi Obat-obatan asam yang mengandung gugus asam
karboksilat sangat polar, menunjukkan tailing yang disebabkan oleh interaksi antara obat-obatan
dan kolom GC, dan biasanya tidak mudah terjadi karena hubungan antar molekul. Untuk
mengatasi masalah ini, esterifikasi dibuat pada senyawa asam karboksilat menggunakan alkohol
yang mengandung asam klorida atau diazometana. Pereaksi terakhir dianggap sebagai senyawa
terbaik untuk esterifikasi, tetapi menunjukkan bahaya karsinogenesis dan ledakan; sebagai
pengganti diazomethane, trimethylsilyldiazomethane dilarutkan dalam heksana sekarang tersedia
secara komersial, karena keamanannya. Derivatisasi lain Derivatisasi juga digunakan untuk
tujuan menambah absorptivitas yang terlihat atau ultra violet, fluoresensi dan aktivitas optik pada
senyawa yang akan dianalisis. Untuk derivatisasi demikian, reagen yang bereaksi dengan gugus
amino, karboksil dan hidroksil tersedia. Rinciannya dijelaskan dalam buku
[11]. 31 pretreatments otomatis Dalam paralel dengan meningkatnya jumlah insiden
keracunan, jumlah spesimen manusia untuk dianalisis meningkat. Analisis jejak diperlukan
dalam banyak kasus analisis obat dan racun; ini berarti bahwa waktu yang relatif lama diperlukan
untuk pretreatment masing-masing sampel. Sulit bagi pekerja dalam jumlah terbatas untuk
menangani banyak sampel secara bersamaan. Penggunaan instrumen pretreatment otomatis
adalah penghematan tenaga kerja, mengurangi kesalahan buatan dan
meningkatkan reproduktifitas dan keandalan data. Ketika senyawa berbahaya ditangani,
instrumen tersebut membuat pekerja bebas dari situasi berbahaya dan meningkatkan
keselamatan. Instrumen pretreatment otomatis telah dibangun untuk ekstraksi cair-cair dan
ekstraksi fase padat. AASP ( pemroses sampel otomatis canggih ) sedang dijual oleh Gilson dan
Varian; PROSPEK dari GL Sciences, Tokyo.
I.5 Metode deteksi
Oleh Osamu Suzuki
Pendahuluan
Kemajuan teknologi luar biasa selama setengah abad terakhir;
instrumen analitis baru telah ditemukan dan diperbaiki. Sekitar 30 tahun yang lalu, kromatografi
lapis tipis (KLT) digunakan secara luas untuk deteksi dan identifikasi obat-obatan dan racun.
Sekitar waktu itu, penggunaan GC / MS dimulai di bidang kedokteran. Oleh karena itu,
prosedur yang ideal untuk analisis obat dan racun dianggap sebagai skrining oleh TLC, diikuti
oleh identifikasi akhir dan kuantisasi oleh GC / MS.
Namun, baru-baru ini, berbagai enzim immunoassays untuk obat tanpa perlu pretreatment
telah muncul, dan beberapa kit skrining obat sekali pakai telah tersedia, menghasilkan
perubahan besar prosedur analitik untuk racun yang tidak diketahui dalam sampel
manusia. > Gambar 5.1
menunjukkan diagram alur dari prosedur analitik terkini untuk spesimen manusia. Untuk
perincian
⊡ Gambar. 5.1 Diagram alir metode analitik untuk obat-obatan dan racun. 34 Metode
pendeteksian titik awal atau tes warna, para pembaca dapat merujuk pada buku baru [1], yang
telah diterbitkan baru-baru ini. Kromatografi lapis tipis (KLT) KLT adalah metode
kromatografi di mana lapisan tipis yang terbuat dari silika gel, alumina, florisil atau selulosa
dilapisi pada pelat kaca atau aluminium. Banyak jenis TLC yang siap digunakan tanpa perlu
pretreatment tersedia secara komersial.

Cairan ekstrak terlihat di bagian bawah piring. Setelah mengeringkan tempat, pelat
dikembangkan dengan fase gerak yang terdiri dari berbagai rasio pelarut organik, asam dan / atau
air. Selama pengembangan dengan fase gerak, senyawa terlihat bergerak dengan
kecepatan tertentu ke arah atas. Pergerakan senyawa yang akan dianalisis biasanya dinyatakan
dengan R  f
nilai (jarak yang senyawa perjalanan dari asal / jarak dimana pelarut
perjalanan dari asal).
Metode ini tidak memerlukan instrumen mahal dan sangat sederhana. Karena
sampel yang relatif banyak dapat dianalisis dengan metode ini dalam beberapa jam, itu banyak
digunakan sebagai metode sederhana
untuk deteksi dan identifikasi tentatif obat. Untuk mendeteksi setiap titik, larutan pereaksi
yang disiapkan khusus dapat disemprotkan pada pelat untuk mendeteksi senyawa secara spesifik.
Rincian
metode TLC dijelaskan dengan baik dalam banyak buku kimia forensik dan analitik [2, 3];
reagen spesifik yang akan disemprotkan juga dijelaskan [4, 5].
Bintik-bintik yang dipisahkan dan dideteksi oleh TLC dapat dikuantisasi sampai batas tertentu
(semiquantitatively) oleh densitometer; batas deteksi beberapa ng sepuluh beberapa μ g di piring.
Baru-baru ini, pelat TLC dilapisi oleh fase diam dengan partikel kecil dan seragam
( diameter 4,5-5 μ m) telah tersedia secara komersial [6]; pelat ini unggul dalam kemampuan
pemisahan dan membutuhkan waktu yang lebih singkat untuk pengembangan. Mereka disebut
"TLC kinerja tinggi (HPTLC)".
Analisis spektrofotometri dan fluoresensi
Spektrofotometer dan fluorofotometer (spektrofluorofotometer) adalah
instrumen analitis yang sangat umum yang terdapat di hampir setiap laboratorium kimia atau
biokimia. Dengan
spektrofotometer, penyerapan sinar ultraviolet dan / atau cahaya tampak dapat diukur. The
batas deteksi biasanya beberapa μ g / mL dengan spektrofotometri dan sekitar beberapa sepuluh
ng / mL
oleh fluorophotometry. Setiap spektrum senyawa dapat direkam untuk identifikasi sementara
dengan kedua metode, tetapi hanya dengan spektrum senyawa, identifikasi akhir tidak
dapat dicapai.
Spektrofotometer dan fluorofotometer juga berguna sebagai detektor dalam kromatografi cair
kinerja tinggi (HPLC); dalam kasus ini, detektor disederhanakan dan dirampingkan.
Spektroskopi serapan inframerah
Ketika sebuah molekul diiradiasi oleh sinar cahaya inframerah, rotasi atau getaran tertentu
terjadi tergantung pada sifat suatu molekul. Penyerapan inframerah hanya terjadi ketika
perubahan
35
dalam momen dipol terjadi. Jenis dispersif konvensional spektrometer memberikan rendah
sensitivitas dan membutuhkan beberapa sepuluh μ g ke beberapa mg dari senyawa murni untuk
pengukuran. Dengan
membandingkan spektrum serapan, konfirmasi identitas dapat dicapai untuk
senyawa yang diketahui ; estimasi ikatan tertentu dan gugus fungsi dapat dimungkinkan untuk
senyawa yang tidak diketahui.
Jenis dispersif konvensional dari instrumen bertenaga tinggi dengan mengubah
struktur optik dan dengan menggunakan sistem komputer untuk membuat Fourier transform
infrared
spectrophotometer (FT-IR). Instrumen ini semahal spektrometer massa. Dengan menambah
jumlah pemindaian dan dengan mempersingkat waktu pemindaian, FT-IR dapat dihubungkan
dengan GC dan HPLC. Namun, dalam analisis toksikologis, FT-IR tampaknya tidak lebih unggul
daripada spektrometri massa.
Radio- dan enzim-immunoassays dan fluoroimmunoassays
Radioimmunoassays (RIA) didasarkan pada persaingan obat dalam spesimen dengan yang
diberi radiolabel untuk mengikat situs antibodi spesifik, yang telah disiapkan sebelumnya.
Sensitivitas RIA biasanya sangat tinggi dengan batas deteksi level pg hingga ng. Prinsip dasar
enzim-immunoassay (ELISA) adalah sama dengan RIA. ELISA menggunakan enzim yang
dikaitkan dengan obat sebagai penanda radioisotop. Pengujian dapat dilakukan di laboratorium
mana pun tanpa lisensi untuk senyawa radioaktif. Produk-produk terbaru ELISA memiliki
sensitivitas dan spesifisitas yang sebanding dengan RIA. Dalam metode sandwich
ELISA, antibodi primer dipasang pada piring dan antibodi sekunder berlabel
penanda enzim digunakan. Antigen (obat-obatan atau racun) terikat di antara kedua
antibodi.
Salah satu fluoroimunoassay didasarkan pada perbedaan polarisasi antara bentuk
terikat dan bebas dari obat berlabel fluorofor yang dapat diamati selama reaksi antigen-antibodi
. Meskipun metode ini sederhana, sensitivitasnya tidak terlalu tinggi.
Dalam semua immunoassay di atas, antibodi khusus untuk obat atau racun harus disiapkan
terlebih dahulu. Ada kerugian dari reaksi silang antara obat-obatan dengan struktur yang sama.
Namun, ketika begitu metode ditetapkan untuk obat sebagai kit, spesimen biologis kasar
dapat dianalisis tanpa ekstraksi atau pemurnian; ini sangat berguna untuk skrining atau sebagai
tes pendahuluan.
Sekarang, kit immunoassay tersedia secara komersial dari produsen di AS dan
Eropa untuk amfetamin, antiepilepsi, antiaritmia, glikosida jantung, antibiotik,
agen bronkodilatasi, antikarsinogen, antipiretik-analgesik, dan imunosupresif.
Baru-baru ini, kit sekali pakai Triage ® sedang banyak digunakan untuk menyaring obat
penyalahgunaan dan
metabolitnya dalam urin; kit ini juga didasarkan pada immunoassay menggunakan partikel
koloid emas. Ini
secara kualitatif dapat mendeteksi benzodiazepin, metabolit kokain, amfetamin,
metabolit kanabinoid , opiat, phencyclidine, dan antidepresan trisiklik hanya dalam waktu sekitar
10 menit. Beberapa
kit serupa sedang dijual di AS dan Eropa. Situasi obat yang banyak digunakan atau
disalahgunakan
berbeda menurut negara. Kasus penyalahgunaan phencyclidine sangat jarang di Jepang,
sedangkan kasus dengan phenothiazines, bromisovalum dan acetaminophen sangat umum.
Pengembangan kit skrining immunoassay yang mencakup obat-obatan di atas yang banyak
digunakan di
Jepang sedang ditunggu.
Radio dan enzim-immunoassays dan fluoroimmunoassays
36 Metode deteksi
Kromatografi gas (GC)
GC sebelumnya disebut "kromatografi gas-cair". Ini didasarkan pada pemisahan oleh partisi
antara fase gas dan cair untuk senyawa menguap mengalir bersama dengan
gas pembawa (N 2 atau He) di dalam kolom GC pada suhu yang relatif tinggi. Oleh karena itu,
GC tidak cocok untuk analisis senyawa yang tidak mudah menguap atau termolabil, tetapi lebih
unggul dalam kemampuan pemisahannya, karena tingginya jumlah pelat teoritis; reproduktifitas
metode ini sangat baik, karena struktur instrumen yang sederhana. GC sekarang sangat
diperlukan untuk
analisis obat .
Kolom GC Kolom
pengemasan konvensional disiapkan dengan memasukkan bahan pengemas ke dalam
kolom kaca dengan diameter internal 2–3 mm dan dengan panjang beberapa meter. Bahan
pengepakan disiapkan dengan mencampur dengan baik butiran inert dengan fase cair berminyak.
Jenis
pendukung dan fase cair banyak; yang paling cocok dapat dipilih dari
banyak.
Baru-baru ini, kolom kapiler silika leburan jauh lebih populer daripada kolom yang dikemas. The
mantan kolom tabung-terbuka dan beberapa sepuluh meter panjang; gas pembawa dapat
mengalir dengan cepat melalui
mereka. Fasa cair dengan ketebalan 0,1–2,0 μ m dilapisi pada permukaan bagian dalam setiap
kolom.
Ada tiga jenis kolom kapiler sesuai dengan ukuran diameter internalnya; kolom bore sempit
untuk 0,1-0,18 mm, kolom bore sedang untuk 0,25-0,32 mm dan
kolom bore lebar untuk 0,53-0,72 mm.
Kolom kapiler memberikan pemisahan yang lebih baik dan lebih sedikit adsorpsi analit daripada
kolom yang dikemas, sehingga menghasilkan puncak yang tajam dan simetris dengan
sensitivitas tinggi. Sebagai fase cair, dimethylsilicone non-polar, sedikit 5% phenylsilicone /
95% dimethylsilicone, polar menengah 50% phenylsilicone / 50% dimethylsilicone
dan sangat polar polietilen glikol sedang digunakan. Bahkan untuk senyawa, yang tidak
memberikan
puncak dengan kolom dikemas, puncaknya dapat dideteksi dengan kolom kapiler dalam banyak
kasus.
Kolom kapiler lubang lebar bermanfaat, ketika sejumlah besar gas harus
disuntikkan tanpa pemisahan; dapat digunakan untuk analisis alkohol dalam kombinasi dengan
metode headspace. Karena aliran gas di dalam kolom bore lebar cepat, dan dengan demikian
waktu untuk
pemaparan menjadi pendek, kolom kadang-kadang cocok untuk analisis senyawa yang relatif
termolabil seperti benzodiazepin.
Karena laju aliran gas untuk kolom kapiler menengah-bore biasanya beberapa mL / menit,
1-2 μ L dari ekstrak pelarut organik untuk disuntikkan harus dibagi sebelum diperkenalkan ke
kolom; ini berarti bahwa hanya kurang dari 10% dari seluruh volume sampel yang diinjeksi
terdeteksi,
menghasilkan sensitivitas yang lebih rendah. Namun, sekitar sepuluh tahun yang lalu, perangkat
switching otomatis
antara mode splitless dan split menjadi sangat populer untuk instrumen GC jenis baru.
Alat ini memungkinkan untuk memasukkan seluruh jumlah senyawa untuk dianalisis ke
dalam kolom kapiler medium-bore dalam mode tak-terbelah pada suhu kolom yang relatif rendah
untuk sepenuhnya menjebak senyawa di dalam bagian depan kolom; setelah mengubah ke
mode split , suhu oven dinaikkan secara bertahap, sampai puncak besar karena seluruh jumlah
analit muncul.
37
Trapping oven cryogenic GC
Komputer mikro yang mengendalikan suhu oven cryogenic di bawah 0 ° C menjadi banyak
tersedia untuk jenis instrumen GC modern. Awalnya dirancang untuk pendinginan
oven yang cepat untuk mengurangi waktu analisis. Para penulis et al. [7, 8] menggunakannya
untuk menjebak senyawa organik volatil (VOC) yang terkandung dalam sampel gas, dan
menamakannya "cryogenic oven trapping (COT)". Dengan
menggunakan metode ini, sejumlah besar uap headspace (5 mL atau lebih) dapat dimasukkan,
dalam
mode tak terbagi, ke dalam kolom kapiler bore sedang pada suhu oven rendah. Prosedur
menghasilkan perangkap VOC di dalam zona sempit ujung inlet dari kolom yang didinginkan
tanpa kehilangan analit dalam mode splitless ( > Gambar 5.2)  . Oleh karena itu,
puncak yang sangat tajam dan besar serta pemisahan yang baik dapat dicapai dengan metode ini.
Terlepas dari penggunaan detektor ionisasi nyala konvensional, sensitivitas yang diperoleh oleh
GC-COT adalah 10-50 kali lebih tinggi
dibandingkan dengan headspace GC biasa. Penulis et al. [7] pertama kali menerapkan metode ini
untuk
analisis sensitif kloroform dan diklorometana dan menetapkan rincian prosedur. Setelah
penelitian ini, kami memperluas garis percobaan ini ke VOC lain dan mendapatkan hasil yang
baik.
Biaya perangkat COT rendah, dan penanganan perangkat sangat sederhana sehingga tidak
diperlukan prosedur khusus selama analisis GC. Salah satu kelemahan COT dengan
CO 2 cair adalah
kemungkinan keracunan CO 2 . Udara yang mengandung lebih dari 3% CO 2 dilaporkan
berbahaya
bagi manusia; 6–10% CO 2 sangat berbahaya. Bahaya seperti itu harus diingat, dan laboratorium
harus berventilasi selama percobaan tersebut. Konsumsi CO 2 cair cepat
terutama untuk COT pada suhu yang sangat rendah; ini berarti bahwa lebih banyak biaya untuk
CO 2 cair diperlukan untuk suhu oven yang lebih rendah.
Skema struktural perangkap oven cryogenic (COT) GC. Nitrogen cair diuapkan dalam
oven GC untuk pendinginan di bawah kendali komputer mikro. Setelah injeksi 5 mL volume
gas headspace, seluruh jumlah senyawa target terperangkap di dalam bagian depan
kolom kapiler.
⊡ Gambar 5.2 Kromatografi gas (GC) 38 Metode deteksi Detektor GC Detektor ionisasi nyala
(FID) paling umum digunakan untuk analisis GC. Setiap senyawa yang memiliki ikatan CH
dapat dideteksi dengan FID. Di outlet aliran GC, gas hidrogen dan udara dicampur dengan gas
pembawa dan dibakar di hadapan tegangan; arus ion karena karbon terionisasi diukur. Batas
deteksi FID adalah 1–10 ng dalam volume yang disuntikkan. Detektor fotometrik nyala (FPD)
sebagian mirip dengan FID di atas bahwa senyawa target dibakar dengan gas hidrogen dan
udara; namun dalam metode ini, perubahan warna nyala hidrogen dideteksi secara optik. Ini
sensitif dan spesifik untuk senyawa yang mengandung belerang dan fosfor. Detektor
penangkapan elektron (ECD) menggunakan sinar β yang diradiasi dari 63 Ni untuk mendeteksi
senyawa yang mengandung kelompok halogen dan nitro dalam strukturnya. Batas deteksi yang
diperoleh dengan ECD adalah beberapa pg hingga beberapa ng dalam volume yang
disuntikkan. Detektor termionik nyala (FTD) sama dengan detektor fosfor nitrogen (NPD), dan
merespons senyawa yang mengandung nitrogen dan fosfor dengan sensitivitas tinggi. Batas
deteksi adalah beberapa sepuluh pg hingga beberapa ng; sensitivitas dengan FTD sekitar
sepuluh kali lebih rendah daripada dengan ECD. Detektor ionisasi permukaan (SID)
dikembangkan di Jepang. Ini sangat sensitif dan spesifik untuk senyawa amino tersier. Hasil
yang baik diperoleh untuk analisis antidepresan trisiklik dan antihistamin
diphenylmethane. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) Bertahun-tahun yang lalu, lebih
dari sembilan juta senyawa telah terdaftar dalam Abstrak Kimia; di antara mereka jumlah
senyawa yang dapat dianalisis oleh GC dikatakan hanya 130.000 (1,4%). Ini menunjukkan
bahwa sebagian besar (lebih dari 98%) senyawa sangat polar, tidak mudah menguap atau
termolabil. Oleh karena itu, tampaknya benar bahwa untuk menganalisis senyawa yang tidak
diketahui, HPLC lebih cocok daripada GC. Bahkan, penggunaan HPLC meningkat. Dalam
kolom HPLC, bahan pengemasan partikel halus (fase diam) dikemas; setelah memasukkan
larutan sampel yang dimurnikan ke dalam kolom, campuran pelarut organik dan /
atau larutan penyangga dikirim ke kolom. Senyawa target dapat dipisahkan dari senyawa
lain selama melewati kolom sesuai dengan perbedaan laju aliran untuk senyawa yang berbeda.
Kemampuan pemisahan HPLC jauh lebih rendah dibandingkan dengan kapiler GC. Kolom
HPLC dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaitu. fase normal, fase terbalik
dan kolom penukar ion . Di antara mereka, kolom fase terbalik sedang digunakan paling populer;
sebagai bahan pembungkus , kelompok C 18 dan CN yang terikat secara kovalen dengan bahan
pendukung digunakan dengan baik. Sebagai fase gerak, campuran air dan metanol (atau
asetonitril) biasa digunakan. Ketika octanesulfonate atau heptanesulfonate ditambahkan ke fase
gerak, efek penukar ion dapat ditambahkan ke fase terbalik HPLC, menghasilkan kemampuan
resolusi kolom yang lebih baik. Ini disebut "HPLC fase pembalikan ion" dan menjadi lebih
populer juga dalam analisis obat dan racun. Sebagai salah satu tren dalam HPLC, miniturisasi
kolom pemisahan dan sistem terkait dapat disebutkan. Selain kolom bor standar dengan diameter
internal 3–6 mm, yang disebut kolom micro-bore dengan diameter internal 1,0–2,1 mm telah
digunakan secara populer. Kapiler HPLC kolom 0,3-0,5 mm diameter juga komersial
availa- 39 ble. Minimalisasi semacam ini membuat volume yang akan disuntikkan lebih kecil,
yang pada akhirnya terkait dengan peningkatan sensitivitas, dan membuat kemampuan resolusi
lebih baik. Sebelum memasukkan kolom pemisahan, sistem switching yang terdiri dari kolom
kondensasi dan katup switching dapat dipasang ke instrumen HPLC. Dengan sistem ini,
sebanyak 500 μ L larutan sampel dapat diinjeksikan dan dikirim ke kolom pemisahan
tanpa kehilangan senyawa target, sehingga menghasilkan sensitivitas yang jauh lebih
tinggi. Sebagai pendeteksi untuk HPLC, UV plus spektrofotometer terlihat dan fluorofotometer
adalah yang paling umum. Dengan detektor terakhir, beberapa sepuluh pg hingga beberapa ratus
pg senyawa dapat ditentukan dalam kondisi instrumental terbaik. Katekolomin dapat dideteksi
dengan detektor elektrokimia HPLC dengan sensitivitas sangat tinggi. HPLC kadang-kadang
mengalami pergeseran dalam waktu retensi selama pengujian berulang dan paling serius dari
penyumbatan kolom. Lebih banyak upaya pemeliharaan diperlukan untuk HPLC daripada untuk
GC. Ion chromatography (IC) IC adalah jenis khusus HPLC; itu secara khusus diadaptasi
untuk analisis senyawa ionik termasuk senyawa anorganik dan logam. Insiden keracunan arsenik
yang terjadi di Wakayama, 1998, dan insiden keracunan natrium azida berikut mengingatkan kita
akan pentingnya analisis senyawa anorganik. Untuk menganalisis ion anorganik dengan
sensitivitas tinggi, IC sekarang menjadi alat yang paling berguna. Namun, biaya untuk instrumen
IC jauh lebih tinggi daripada HPLC biasa. Sistem IC terdiri dari pompa, kolom pemisahan
penukar ion, penekan, detektor konduktivitas, dan stasiun kerja untuk integrasi dan pemrosesan
data. Untuk analisis anionik dan kation, masing-masing kolom anion dan kation penukar
digunakan. Karena perubahan konduktivitas listrik yang disebabkan oleh ion inorganik target
diukur oleh IC, garis dasar yang tinggi dan puncak yang mengganggu yang disebabkan oleh ion
yang bercampur dalam fase gerak menjadi masalah serius. Oleh karena itu, penekan sangat
penting untuk menurunkan garis dasar dan menstabilkannya untuk mendeteksi puncak senyawa
target dengan sensitivitas tinggi; itu harus, tentu saja, terletak di depan detektor. Batas deteksi
beberapa ng ke beberapa μ g on-kolom tergantung pada jenis senyawa yang akan
dianalisis. Berbagai kombinasi fase gerak dengan kolom pemisahan, hampir
setiap ion anorganik (anion dan kation) dapat dideteksi dan dikuantifikasi. IC untuk ion
anorganik sebanding dengan HPLC untuk senyawa organik; dengan demikian identifikasi akhir
tidak dapat dicapai hanya dengan IC. Untuk identifikasi ion anorganik, ICP-MS
diperlukan. Spektrometri massa (MS) Dalam mode dampak ion elektron positif (EI) MS,
molekul target sangat bertabrakan dengan elektron untuk menghasilkan banyak / beberapa ion
fragmen. Ion fragmen positif dipercepat dalam medan listrik, dimasukkan ke dalam lensa medan
listrik atau magnet atau ke medan listrik quadrupole untuk pemisahan sesuai dengan jumlah
massa ion fragmen, dan akhirnya terdeteksi. Spektrum massa karakteristik diperoleh dengan
nomor massa pada sumbu horizontal dan bar dengan berbagai intensitas pada sumbu vertikal.
Spektrum massa EI menunjukkan stereo Mass spectrometry (MS) 40 Metode deteksi pola yang
diketik sesuai dengan masing-masing senyawa dalam kondisi MS yang serupa; diterima secara
luas bahwa MS adalah metode identifikasi yang paling dapat diandalkan. Ketika profil spektrum
massa EI yang diperoleh dari suatu senyawa dalam spesimen bertepatan dengan yang diperoleh
dari senyawa otentik , hampir dapat disimpulkan bahwa kedua senyawa tersebut identik.
Dalam mode pemantauan ion (SIM) yang dipilih dari MS, kuantitasi ultra-sensitif dapat
diwujudkan pada level pg atau fg di kolom. Spektrometer massa sektor magnetik relatif besar
dan mahal. Untuk mendapatkan angka massa yang tepat dengan empat tempat desimal,
spektrometri massa resolusi tinggi menggunakan spektrometer massa sektor magnetik fokus
ganda diperlukan. Fungsi instrumen MS baru-baru ini telah sangat ditingkatkan; bahkan dengan
spektrometer massa resolusi rendah, pengukuran yang baik dapat dicapai tanpa pergeseran dalam
satuan massa. Oleh karena itu, untuk analisis obat dan racun, spektrometer massa jenis
quadrupole bangku-atas, yang relatif murah dan mudah ditangani, digunakan secara luas. GC /
MS Spektrum massa dapat diperoleh dengan metode saluran masuk langsung; dalam metode
ini, senyawa yang hampir murni harus digunakan. Ketika ekstrak kasar dari spesimen manusia
dianalisis, senyawa target harus dipisahkan dengan kromatografi sebelum aplikasi ke MS. Oleh
karena itu, GC / MS online biasanya digunakan dalam kasus seperti itu. Ada 3 jenis ionisasi
dalam GC / MS; ion positif EI, ionisasi kimia ion positif (CI) dan mode ion ion negatif. Mode EI
ion positif paling umum, terstandarisasi dan cocok untuk pengukuran spektrum massa. Namun,
ada banyak kasus di mana ion molekuler (M + ) tidak dapat diperoleh; berat molekul tidak dapat
diperkirakan dalam kasus tersebut. Mode CI ion positif adalah metode ionisasi yang jauh lebih
lembut daripada mode EI; tabrakan elektron mengionisasi gas pereaksi, dan gas terionisasi
berinteraksi dengan senyawa target sebagian besar untuk menghasilkan ion molekul
terprotonasi [M + 1] + yang kuat, yang berguna untuk memperkirakan berat molekulnya. Dalam
mode CI ion negatif, mekanisme reaksi mirip dengan yang positif di atas; tetapi hanya ion
negatif yang dihasilkan yang terdeteksi. Metode ini memberikan berbagai keunggulan
karakteristik; dengan metode ini, senyawa yang mengandung gugus halogen dan gugus nitro
dapat dideteksi dengan sensitivitas tinggi, dan gugus ini dapat dengan mudah diidentifikasi
dengan adanya puncak karakteristik halogen yang dibebaskan. Metode ini juga memberikan
puncak dasar karakteristik untuk pestisida organofosfor, yang sangat berguna untuk penyaringan
dan kuantisasi sensitif oleh SIM. LC / MS Alasan mengapa on-line GC / MS pertama kali
disadari adalah bahwa koneksi antara GC dan MS sangat mudah; dengan menggunakan kolom
GC kapiler bor sedang, gas sampel dapat langsung dimasukkan ke dalam ruang ionisasi tanpa
menggunakan pemisah, karena laju alirnya rendah. Namun, ada banyak kesulitan untuk
menghubungkan LC (HPLC) dengan MS hingga saat ini. Saat ini, masalah ini telah diatasi, dan
banyak jenis instrumen LC / MS online tersedia secara komersial. Banyak laporan yang
dipublikasikan tentang analisis obat dan racun oleh LC / MS. Perangkat koneksi antara LC dan
MS disebut "antarmuka". Seperti antarmuka, termospray, pemboman atom cepat, ionisasi kimia
atmosfer (APCI) dan mode ionisasi elektrospray 41 (ESI) dapat disebutkan. Di antara mereka,
ESI dan APCI sedang digunakan terbaik, karena sensitivitas tinggi dan kuantitas yang
baik. Instrumen LC / MS telah menyebar sangat cepat. Banyak obat dan racun dalam spesimen
biologis dapat diidentifikasi dan dikuantifikasi tanpa ada derivatisasi dengan metode
ini. Sensitivitas LC / MS telah ditingkatkan dan sekarang sebanding dengan GC / MS. MS / MS
(tandem MS) Dua instrumen MS digabungkan; MS pertama digunakan untuk pemisahan
senyawa seperti GC, dan yang kedua digunakan untuk deteksi selektif. Sampel yang relatif kasar
dengan banyak pengotor dapat disuntikkan ke dalam MS pertama dengan metode saluran masuk
langsung, dan satu ion yang diproduksi dipilih dan dimasukkan ke yang kedua untuk bertabrakan
dengan molekul netral (gas inert), menghasilkan pembentukan ion produk. Proses terakhir
disebut "collision induced disociation (CID)" dan berguna untuk identifikasi dan kuantisasi
menggunakan ion produk. GC atau LC (HPLC) dapat dihubungkan dengan MS / MS; GC / MS /
MS atau LC / MS / MS memberikan spektrum massa ion produk bersih tanpa puncak pengotor,
dan memungkinkan kuantisasi sensitif dengan pemantauan reaksi terpilih (SRM) dengan kota
dengan spesifikasi sangat tinggi. GC / MS / MS dan LC / MS / MS sekarang menjadi alat paling
ampuh untuk analisis obat dan racun. Seperti dijelaskan di atas, tipe tandem dengan dua
instrumen MS disebut " mode tandem-in-space ", dan relatif mahal. Jenis tandem lainnya adalah
MS dari mode perangkap ion; tidak perlu dua instrumen. Satu instrumen MS dapat memenuhi
fungsi tandem dengan prinsip yang berbeda dan dengan regulasi oleh komputer; tipe ini disebut
"mode tandem-in-time", dan lebih murah daripada tipe MS tandem-in-space. Meskipun tipe
tandem-in-time tidak memungkinkan pemindaian simultan dari kedua ion prekursor dan produk,
sensitivitasnya sangat tinggi. Dikatakan bahwa kuantitativeness dari perangkap ion MS rendah;
untuk mencapai kuantisasi yang akurat, diperlukan standar internal isotop stabil. Plasma-MS
yang digabungkan secara induktif (ICP-MS) “Plasma” adalah gas yang netral tetapi
terionisasi, di mana atom-atom bergerak secara acak, ion dan elektron hidup berdampingan. ICP
adalah plasma argon, yang telah bersemangat dengan induksi frekuensi tinggi [9]. Sebuah kawat
tembaga digulung di sekitar tabung pelepasan yang terbuat dari kaca kuarsa, yang
disebut "obor"; dan medan listrik diproduksi di dalam obor dengan menyalakan listrik
melalui koil. Ketika gas argon dimasukkan ke dalam obor, atom argon dipercepat di medan
listrik untuk menghasilkan plasma argon setelah tabrakan berulang. Suhu ICP
yang dihasilkan adalah setinggi 6.000–8.000 K. Ketika spesimen yang dinebulasi dimasukkan ke
dalam obor bersama dengan gas pembawa argon, atom-atom dalam spesimen tereksitasi dan
memancarkan setiap berkas spektrum , yang khusus untuk suatu elemen; bagian dari atom
terionisasi secara bersamaan. Spektrometri emisi ICP adalah metode untuk mendeteksi sinar
yang dipancarkan oleh ICP secara spektrofotometri; ICP-MS adalah metode untuk mendeteksi
ion oleh MS. Dalam ICP-MS, instrumen MS quadrupole biasanya digunakan; banyak elemen
dapat dideteksi secara bersamaan dengan sensitivitas tinggi pada level pg / mL dalam waktu
singkat. Metode ICP ini cocok untuk analisis unsur senyawa anorganik dan logam daripada
senyawa organik. Spektrometri massa (MS) 42 Metode deteksi Spektrum massa ICP-MS berbeda
dari MS biasa untuk senyawa organik. Ini adalah analisis unsur dan tidak menunjukkan struktur
molekul. Untuk memperkirakan struktur ion anorganik, disarankan untuk menghubungkan
kromatografi ion (IC) dengan ICP-MS. > Gambar 5.3 menunjukkan spektrum massa ICP yang
khas; sumbu horizontal menunjukkan jumlah massa dan sumbu vertikal intensitas masing-
masing ion elemen [10]. Dalam spektrum massa untuk arsenik, harus diingat bahwa Ar yang
digunakan sebagai gas plasma mudah terikat dengan Cl untuk membentuk argride (ArCl + , m /
z 75), yang memberikan nomor massa yang sama dengan As + . Analisis kuantitatif juga dapat
dilakukan oleh ICP-MS. Biaya untuk ICP-MS sama tingginya dengan spektrometer massa sektor
magnetik. IC / ICPMS sangat berguna untuk identifikasi dan kuantisasi molekul anorganik, tetapi
biayanya bahkan lebih tinggi. IC / ICP-MS sebanding dengan LC / MS untuk senyawa
organik. Analisis fluoresensi sinar-X Dalam analisis fluoresensi sinar-X, kata "fluoresensi"
digunakan. Namun, itu tidak berarti penggunaan lampu fluoresensi yang sebenarnya. Dalam
spektrofotometri fluoresensi biasa, ketika molekul aromatik yang memiliki ikatan rangkap
terkonjugasi diiradiasi oleh cahaya dengan panjang gelombang lebih pendek (energi lebih
tinggi), molekul menyerap energi cahaya untuk ditingkatkan ke keadaan tereksitasi dan
memancarkan cahaya dengan panjang gelombang lebih panjang. (energi yang lebih rendah)
sebagai fluoresensi. Fenomena serupa dapat diamati untuk radiasi lain; ketika sebuah atom
disinari oleh sinar-X, γ berkas atau berkas elektron, karakteristik X-ray atom dipancarkan. Oleh
karena itu, sinar-X yang dipancarkan disebut "sinar-X fluoresensi". Dalam analisis fluoresensi
sinar-X, unsur-unsur yang memiliki berat molekul tidak lebih kecil dari Na dapat dengan mudah
dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif; metode ini sangat cocok untuk analisis unsur senyawa
anorganik dan logam. Keuntungan dari metode ini adalah kemampuan analisis tanpa merusak
spesimen; itu noninvasif, dan spesimen, yang spektrum massa ICP untuk arsenik dan logam
lainnya. Kuku manusia digunakan untuk analisis. Puncak pada m / z 75 adalah karena arsenik.
Puncak bayangan diperoleh dari sampel kosong. ⊡ Gambar 5.3 43 telah digunakan untuk
analisis fluoresensi sinar-X dapat digunakan lagi untuk analisis lain. Oleh karena itu, metode ini
sangat berguna untuk skrining senyawa anorganik (lihat > Gambar 5.1 ), dan analisis akhir dapat
dibuat dengan IC atau ICP-MS. Dalam insiden keracunan kari di Wakayama, arsenik dapat
diidentifikasi dari kari dengan metode ini [10]. Sensitivitas dari metode fluoresensi X-ray di μ g /
g tingkat, dan biaya untuk instrumen relatif tinggi. Spektrometri serapan atom Ketika kristal
NaCl dimasukkan ke dalam nyala api gas burner, warna biru nyala api segera berubah menjadi
warna oranye. Dengan memanfaatkan fenomena seperti itu, berbagai senyawa anorganik dan
logam dapat dianalisis secara spektrofotometri dengan membakar spesimen [12]. Ini sangat
cocok untuk analisis logam kation; namun, setiap lampu, yang memancarkan cahaya
yang menunjukkan panjang gelombang tertentu, perlu untuk setiap elemen dianalisis. Baru-baru
ini, apa yang disebut spektrometri serapan atom flameless sedang digunakan; tidak
menggunakan pembakaran api, tetapi menggunakan tungku suhu tinggi. Keuntungan dari metode
flameless adalah volume spesimen yang dibutuhkan lebih kecil dan sensitivitas lebih
tinggi. Batas deteksi spektrometri serapan atom dengan api pembakaran yang di
beberapa μ tingkat g / g. Pretreatment untuk metode ini umumnya sederhana. Metode ini
memiliki sejarah panjang; para pembaca dapat menemukan rincian metode ini di banyak buku
12]