E. histolytica dan E. dispar dalam sampel tinja yang diformalin (129).

Solusi PCR hibridisasi

immunoassay terkait enzim yang menargetkan DNA melingkar ekstrachromosomal dari E.
Histolytica dan E. dispar dengan primer spesifik dan probe terkonjugasi biotin terbukti sensitif
untuk deteksi dan diferensiasi dua spesies Entamoeba dalam sampel klinis (7, 11,199).

PCR untuk deteksi DNA E. histolytica dari sampel abses hati pertama kali digunakan
menggunakan pengkodean gen antigen 30-kDa, dan sensitivitas 100% dilaporkan (182). Dalam
penelitian lain, PCR yang dilakukan pada sampel hati hanya menunjukkan sensitivitas 33%
untuk kehadiran E. Histolytica menggunakan primer spesifik untuk 18S rDNA dari E.
histolytica, sedangkan yang kedua pasangan, spesifik untuk gen antigen 30-kDa (182),
menunjukkan sensitivitas 100% (215). Amplifikasi langsung untuk deteksi E. histolytica DNA
(tanpa ekstraksi DNA) dari ALA nanah dilaporkan menggunakan 10 pasang primer berbeda yang
telah diterbitkan sebelumnya (digunakan untuk amplifikasi secara terpisah E. histolytica dari
sampel hati dan tinja) (214). Dari 10 pasangan primer berbeda yang diuji, dua pasangan, yaitu,
P1-P2, menargetkan DNA melingkar ekstrachromosomal dari E. histolytica (3), dan P11-P12,
yang menargetkan gen antigen 30-kDa (182), memberikan sensitivitas 100%.

Uji PCR lain (hemo-PCR), berdasarkan pada gen hemolysin HLY6 dari E. histolytica,
dianalisis untuk sampel abses hati. Hemo-PCR memberikan hasil positif untuk 89% sampel
ALA, dibandingkan dengan 77% dan 28% untuk gen antigen 30-kDa dan 18S rDNA, masing-
masing (216). HemoPCR ditemukan sebagai alat diagnostik yang berharga untuk identifikasi E.
histolytica dalam sampel hati dan tinja.

Untuk identifikasi E. moshkovskii dalam spesimen tinja, metode riboprinting pertama

kali dilaporkan oleh Haque et al. (72). Selanjutnya, PCR untuk identifikasi E. moshkovskii
dalam sampel tinja dikembangkan sebagai PCR 18S rDNA bersarang diikuti oleh pembatasan
pencernaan endonuklease (8). Metode ini memiliki sensitivitas dan spesifisitas tinggi (100%)
dengan DNA diekstraksi langsung dari sampel tinja menggunakan kit ekstraksi tinja QIAGEN
(52).

Meskipun metode berbasis PCR telah berhasil digunakan untuk mendeteksi ketiga spesies
Entamoeba, aplikasi mereka dalam diagnosis rutin masih sangat terbatas. Pengenalan metode
berbasis PCR telah dihambat oleh kesulitan dalam ekstraksi DNA dari sampel tinja (115). Selain
itu, penguatan dan deteksi DNA memakan waktu dan mahal. Kekurangan dari tes berbasis PCR
menjadi jelas selama aplikasi praktis. Generasi fragmen DNA nonspesifik dari sampel
lingkungan dan klinis menimbulkan masalah yang signifikan yang sering menghasilkan hasil
positif palsu.

PCR Real-Time

PCR Real Time adalah metodologi baru dan sangat menarik untuk diagnosis
laboratorium penyakit menular karena karakteristiknya yang menghilangkan analisis pasca PCR,
yang mengarah pada waktu penyelesaian yang lebih pendek, pengurangan risiko kontaminasi
amplikon pada lingkungan laboratorium, dan pengurangan reagen biaya (99). Pendekatan ini
memungkinkan deteksi spesifik amplikon dengan mengikat satu atau dua probe berlabel
fluoresensi selama PCR, sehingga memungkinkan pemantauan kontinyu pembentukan amplikon
(produk PCR) sepanjang reaksi. Aspek penting dari PCR waktu-nyata adalah peningkatan
sensitivitas dibandingkan dengan PCR konvensional, dengan kemampuan untuk mendeteksi 0,1
sel per gram tinja (18). Selain itu, PCR real-time adalah metode kuantitatif dan memungkinkan
penentuan jumlah parasit dalam berbagai sampel. Protokol PCR real-time yang berbeda baru-
baru ini telah diterbitkan untuk identifikasi dan diferensiasi E. Histolytica dari E. dispar (Tabel
5). Ini termasuk uji Light Cycler yang menggunakan probe hibridisasi untuk mendeteksi
amplifikasi 18S rDNA dari sampel tinja (18, 27) dan dua tes TaqMan, satu menargetkan 18S
rDNA (98, 195, 198) dan yang lain menargetkan pengulangan episom, menggunakan DNA
diekstraksi dari sampel tinja yang dikumpulkan dari primata dan manusia (198, 200). PCR real-
time berbasis beacon molekuler menargetkan 18S rDNA dari E. histolytica untuk digunakan
pada fecal dan ALA spesimen dijelaskan (153). Hijau SYBR pengujian real-time yang
menargetkan 18S rDNA dijelaskan oleh Qvarnstrom et al. (139).

Urutan yang dipilih dalam sebagian besar studi real-time ini telah memasukkan rDNA
sebagai target untuk PCR. Baru baru ini evaluasi tiga uji PCR real-time, dengan fokus pada
kelemahan dan kekuatan masing-masing uji dan kegunaannya untuk diagnosis laboratorium
klinis, diterbitkan oleh Qvarnstrom et al. (139). Studi ini menyoroti perbedaan utama dalam batas
deteksi dan kinerja pengujian yang diamati di antara tes yang dievaluasi. Dua tes dalam
penelitian ini tidak dapat dengan andal membedakan E. histolytica dari E. dispar, termasuk uji
Light Cycler (17) dan uji TaqMan yang menargetkan pengulangan episomal (198, 200). Uji
multipleks waktu-nyata kemudian dikembangkan untuk mendeteksi parasit usus yang berbeda
dengan sensitivitas dan spesifisitas 100% (195). Pengujian ini memungkinkan deteksi E.
histolytica, G. lamblia, dan C. Parvum dan menawarkan kemungkinan memperkenalkan deteksi
DNA dalam diagnosis rutin infeksi parasit usus. Penerapan tes multipleks semacam itu dan
pengembangan prosedur isolasi DNA otomatis dapat memiliki dampak luar biasa pada praktik
parasitologi rutin. Diagnosis yang akurat mengharuskan bahwa kondisi reaksi yang sama
digunakan untuk standar dan untuk sampel. Pendekatan dupleks atau multipleks dengan
standardisasi internal memberikan solusi untuk masalah ini.

PCR real-time untuk deteksi E. moshkovskii dalam sampel klinis belum dilaporkan. Oleh
karena itu penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengembangkan metode ini untuk mendeteksi
E. moshkovskii.

Meskipun tes PCR real-time cukup sensitif untuk mendeteksi sel tunggal, jumlah probe
yang terbatas yang dapat diterapkan dalam satu reaksi menghambat kegunaannya untuk deteksi
multitarget yang pasti dan analisis genotipe (139). Kelimpahan yang berlebihan dari satu spesies
untuk dideteksi dalam PCR real-time dapat menutupi kemampuan untuk mendeteksi spesies
kedua ketika primer amplifikasi yang sama dibagi dalam pengujian dupleks. Pengujian dupleks
(atau multipleks) yang membedakan antara target hanya dengan menggunakan probe yang
berbeda tidak cocok untuk deteksi simultan lebih dari satu mikroorganisme dalam satu reaksi
tunggal. Selain itu, PCR real-time adalah prosedur yang mahal dibandingkan dengan fecal
microscopy dan tes deteksi berbasis antigen. Dengan demikian, daerah miskin di dunia, di mana
E. histolytica paling lazim, sayangnya akan cenderung kurang diuntungkan dari PCR real-time.
Sebaliknya, teknik ini akan layak terutama di laboratorium klinis di negara-negara maju yang
perlu mendiagnosis amebiasis pada kelompok berisiko tinggi seperti LSL, pelancong, dan
imigran dari kawasan dunia di mana E. histolytica endemik.
 Pengembangan Microarray

Salah satu aplikasi yang telah merevolusi era postgenomic adalah pengembangan dan
penggunaan teknologi microarray. DNA microarrays adalah teknologi yang baru dikembangkan
yang digunakan untuk mendeteksi patogen dan cepat dan sensitif. Metode ini melibatkan empat
langkah: ekstraksi DNA genomik, amplifikasi DNA target, hibridisasi DNA berlabel dengan
probe oligonukleotida diimobilisasi pada microarray, dan analisis data. Olarukleotida mikroarray
telah berhasil diterapkan pada diagnosis banyak patogen dalam beberapa tahun terakhir.
Pendekatan berbasis microarray merupakan alat diagnostik yang menarik untuk deteksi dan
identifikasi spesies parasit dalam penyelidikan klinis dan epidemiologis. Microarray
oligonukleotida pertama dikembangkan untuk deteksi paralel E. histolytica, E. dispar, G. lamblia
assemblages A dan B, dan C. parvum tipe 1 dan 2 dalam uji tunggal dengan spesifisitas tinggi
dan sensitivitas dilaporkan oleh Wang et al. (205). Selain membedakan antara genotipe utama,
uji ini terbukti bermanfaat dalam mendeteksi dan membedakan E. moshkovskii dari E.
histolytica. Namun, penelitian ini dilakukan dengan memurnikan DNA genomik yang diekstraksi
dari strain kultur standar parasit yang berbeda (205).

Teknik uji genotipe berbasis mikroarray (hibridisasi genom komparatif) kemudian

dikembangkan menggunakan klon DNA genom berurutan dari E. histolytica (HM-1: IMSS). Ini
adalah analisis genome-lebar pertama dari strain Entamoeba, dan mengungkapkan bahwa
teknologi ini dapat digunakan untuk membedakan E. histolytica dari E. dispar, untuk
mengidentifikasi gen yang terbatas pada virulen strain, dan untuk menemukan asosiasi genotipik-
fenotipik potensial (164).

Tes Microarray pada saat ini sebagian besar merupakan alat penelitian dan jarang
digunakan di laboratorium diagnostik klinis untuk deteksi dan diferensiasi parasit. Namun,
dengan perbaikan yang diantisipasi dalam teknologi microarray bersama dengan penurunan
biaya, ada kemungkinan bahwa teknologi ini dapat menjadi yang terdepan dalam penelitian
parasit.
 Penulisan Metode

Heterogenitas yang diamati dalam virulensi di antara strain, yang dapat menentukan
kemampuan strain untuk menyebabkan penyakit invasif,
telah merangsang upaya melalui studi epidemiologi molekuler untuk menentukan apakah
beberapa subkelompok E. histolytica lebih mungkin daripada yang lain untuk menyebabkan
penyakit invasif. Variabel parasit dan inang yang berkontribusi pada epidemiologi penyakit tidak
jelas, dan mungkin ada interaksi yang kompleks antara genetika inang, imunitas, bakteri enterik,
nutrisi, dan genetika parasit yang terjadi dan berkontribusi terhadap penyakit. Apakah ada
subtipe E. histolytica yang memiliki potensi virulensi lebih tinggi atau lebih rendah atau
kecenderungan untuk infeksi organ tertentu tidak diketahui. WHO telah memprioritaskan upaya
untuk menentukan apakah subkelompok fungsional E. histolytica ada, yang dapat membantu
menjawab beberapa pertanyaan yang belum terjawab seputar virulensi parasit ini (210). Alat
identifikasi regangan yang tersedia hingga saat ini terbatas. Analisis isozim memberikan penanda
pertama (159), tetapi sekarang diketahui bahwa pola isoenzim tidak tetap (lihat “Analisis isozim”
di atas), dan karena itu banyak zimodem yang ditugaskan tidak dapat diandalkan (94). Variasi
yang tidak diinginkan dalam E. histolytica dijelaskan oleh Clark dan Diamond (33), dan studi
mereka pada E. histolytica budaya (xenic dan axenic) dari wilayah geografis yang berbeda di
dunia menunjukkan adanya polimorfisme luas pada gen SREHP (174) dan gen spesifik-regangan
(SSG) (25) (Tabel 6). Gen SREHP, yang mengkode antigen permukaan imunodominan, encode
mengandung pengulangan tandem asam 8- dan 12-asam amino. Adanya perbedaan genetik di
antara strain E. histolytica yang menyebabkan penyakit usus atau hati telah ditunjukkan oleh
polimorfisme yang diperlihatkan dalam gen SREHP menggunakan PCR bersarang yang
dilakukan pada DNA yang diekstraksi dari sampel tinja dan hati (11). Namun, temuan ini
kemudian ditentang oleh Haghighi et al. (70) SSG, yang merupakan gen nonkode dan berisi
sekuens berulang berulang secara bersamaan dengan ukuran dari 8 hingga 16 bp, telah digunakan
untuk membedakan galur dengan jumlah ulangan di antara galur E. histolytica (25, 33). Namun,
tidak adanya lokus ini pada strain tertentu membuatnya menjadi penanda yang buruk untuk
mengetik intraspesies (162).

Penggunaan pengulangan tandem pendek yang terkait dengan gen tRNA telah
dikembangkan untuk genotipe E. histolytica (9). Genotip E. histolytica berbasis PCR ini harus
memungkinkan penyelidikan dari kemungkinan hubungan antara genotipe dan hasil infeksi (9).
Penanda DNA lain untuk membedakan antara isolat E. histolytica termasuk gen kitinase, yang
menyandikan pengulangan tandem dari sekuens asam 7-amino-asam yang merosot (38, 69).
Studi dengan gen kitinase sebagai penanda untuk mempelajari populasi E. dispar telah
mengungkapkan adanya strain yang berbeda di