LAPORAN PRAKTIKUM PEMISAHAN KIMIA

ELEKTROFORESIS

Nama : Fira Tri Wulandari

NIM 181810301066
Kelas/Kelompok : A/7

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2020
Judul :
Elektroforesis
Tujuan:
Untuk mempelajari proses elektroforesis.
Pembahasan:
a. Proses Elektroforesis (Loading dan Running) menggunakan DNA pada Gel Agarose
Elektroforesis DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memisahkan sampel
DNA dengan berdasarkan ukuran (berat molekul) dan sifat fisik dari molekulnya.
Perlakuannya yaitu dengan menggunakan alat mini sub cell yang memiliki kawat elektroda
serta dialiri listrik dan bergerak dari elektroda yang bermuatan negatif ke elektroda bermuatan
positif. Elektroda negatif ini berwarna hitam sedangkan elektroda positif berwarna merah.
DNA yang digunakan dalam elektroforesis bermuatan negatif, sehingga selama proses
elektroforesis fragmen DNA akan bermigrasi dari elektroda negatif ke elektroda positif.
Langkah yang dilakukan yaitu memasukkan gel agarose ke dalam gel chamber, sumur gel nya
harus berada didekat elektroda negatif. Tanda panah kuning dilihat agar peletakannya tidak
terbalik, karena apabila terbalik akan mempengaruhi laju reaksi yang akan terjadi. Proses ini
menggunakan gel agarose karena gel agarose dapat digunakan untuk memisahkan fragmen
DNA yang lebih besar (lebih dari 200 bp). Jarak anatara dua fragmen DNA yang berbeda
ukuran tersebut dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose. Langkah
selanjutnya yaitu menuangkan larutan buffer TBE ke dalam chamber sampai gel agarose nya
terendam sekitar 2 mm. Tujuan dari penambahan larutan buffer ini adalah untuk membantu
memonitor waktu proses elektroforesis yang telah berlangsung dan membantu sampel turun ke
dalam well. Sampel DNA yang bertindak sebagai fasa gerak disiapkan dan diberi kode pada
setiap tubenya (5 tube). Tip yang digunakan harus sesuai mikropipet tersebut. Mikropipet ini
berfungsi untuk mengambil sampel DNA. Sampel DNA tersebut di ambil dengan
menggunakan mikropipet secara perlahan dan hati-hati, agar DNA dan loading buffer tidak
meluber ke bagian well yang lain. Pengambilannya dilakukan dengan cara tip disentuhkan ke
bagian dasar tube sampel. Sampel dicampurkan dengan loading dye, sebelum dimasukkan ke
dalam sumur. Sumur yang pertama diisi dengan marker, sumur kedua dan berikutnya diisi
dengan sampel DNA. Pengisian ini dilakukan secara perlahan, diusahakan tip tegak lurus dan
segera menarik mikropipet setelah semua sampel dimasukkan. Tremor harus dihindari agar
sampel tidak meluber keluar sumur. Marker DNA yang dimasukkan ke dalam sumur pertama
merupakan segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker tersebut
digunakan sebagai acuan untuk mengetahui ukuran sampel DNA hasil ampifikasi. Marker
DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan
basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Alat mini sub cell kemudian ditutup dan
disesuaikan jenis elektrodanya (negatif dan positif).
 Elektroda tersebut dicolokkan pada power supply sesuai dengan warnanya, lalu tekan
tombol on. Voltase diatur pada 100 volt dan waktu runningnya selama 60 menit,lalu klik run.
Kecepatan dari migrasi DNA dipengaruhi oleh tegangan listrik dan arus listrik yang diberikan
oleh power supply ke tangki elektroforesis. Kecepatan gerak dari fragmen DNA ditentukan
oleh besar kecilnya fragmen DNA tersebut, sehingga semakin besar fragmen DNA nya maka
kecepatan geraknya akan semakin besar dan sebaliknya. Proses dari running ini dimulai
dengan muculnya gelembung pada elektroda yang dialiri arus listrik. Gelembung yang terdapat
pada elektroda positif (merah) hasilnya lebih sedikit dibandingkan dengan gelembung pada
elektroda negatif (hitam). Gelembung ini lebih banyak pada elektroda negatif karena pada
sampel DNA terdapat muatan negatif yang nantinya akan bermigrasi ke elektroda positif.
Fragmen DNA yang bermigrasi dari elektroda negatif ke elektroda positif dapat dilihat setelah
beberapa menit proses berjalan.

b. Elektroforesis menggunakan Gel Poliakrilamid

Video yang kedua merupakan percobaan elektroforesis dengan menggunakan gel
poliakrilamid. Gel poliakrilamid berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan
menganalisis hasil dari ekstensi primer. Akrilamid ini sering dimanfaatkan untuk memisahkan
molekul yang kecil. Konsentrasi dari akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi
protein. Perlakuan pertama dari percobaan ini yaitu menyiapkan cetakan gel yang terdiri dari
small and large glass plate, spacer, clamb dan comb. Cetakan gel tersebut dipasang dengan
benar. Perlakuan selanjutnya yaitu membuat larutan gel untuk tiap gel dengan komposisi
poliakrilamid 30%, TBE 10x, dH2O atau aquabidest steril, APS 25%, dan TEMED. Tabung
dibolak-balikkan secara perlahan agar larutan gel menjadi homogen. Larutan gel yang telah
homogen segera dituangkan ke dalam cetakan gel. Proses pembuatan gel ini, akrilamid akan
berpolimerisasi secara spontan bilak tidak terdapat oksigen. Comb dipasang pada cetakan dan
didiamkan gel selama kurang lebih 30 menit hingga kenyal, lalu dilepaskan comb dari cetakan
gel. Tujuan dari pemasangan comb ini yaitu untuk membentuk well pada gel agarose. Cetakan
gel, kemudian dipasang pada flow migration chamber tepat pada perangkat elektroforesis
vertikal. Flow migration chamber ini digunakan sebagai wadah gel agarose. Tujuan dari
penggunaan perangkat elektroforesis vertikal ini yaitu untuk menganalisis DNA. Buffer dari
larutan TBE 1x dituangkan ke dalam flow migration chamber hingga gel terendam. Tujuan
dari perendaman gel ini yaitu untuk menghilangkan CBB. Larutan buffer TBE 1x
digunakan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan dari
kekuatan ionik.
 Perlakuan selanjutnya yaitu mengambil loading dye sebanyak 1µL untuk masing-
masing sampel dan diletakkan di atas parafilm. Larutan loading bye atau disebut juga larutan
buffer digunakan untuk menambahkan densitas, sehingga DNA berada di bawah bagian
sumur. Fungsi dari larutan loading bye yang lain yaitu untuk memudahkan dalam meletakkan
DNA ke dalam sumur dan sebagai penanda laju migrasi DNA. Aquabidest ditambahkan
sebanyak 2µL per sampel, kemudian dicampur dengan loading dye. DNA hasil dari PCR
ditambahkan sebanyak 3µL per sampel, lalu dicampur dengan loading bye dan aquabidest
steril. Tip pada mikropipet pada sampel diganti setiap kali melakukan pengambilan DNA, agar
tidak terkontaminasi dengan DNA yang lain. Pencampuran loading dye dengan DNA
bertujuan untuk membantu memonitor lamanya proses elektroforesis yang berlangsung, karena
campuran memiliki pewarna bromofenol biru. Campuran (DNA, loading dye, aquabidest)
dimasukkan ke dalam sumur pada gel poliakrilamid yang telah diletakkan pada flow migration
chamber. Sumur gel yang berada paling kiri ditambahkan dengan DNA leader sebanyak 4µL,
kemudian dipasang penutup flow migration chamber. Perlakuan berikutnya yaitu
menghidupkan perangkat elektroforesis dengan cara menekan tombol ‘ON’ dan diatur
voltagenya sebesar 100 volt dan arus sebesar 400 mA selama waktu 60 menit. Kabel chamber
kemudian disambungkan dengan elektroforesis dan dijalankan dengan cara menekan tombol
‘RUN’ pada alat elektroforesis tersebut. Proses elektroforesis ditunggu sampai waktu pada alat
elektroforesis yaitu selama 60 menit selesai. Fragmen DNA yang berukuran besar akan
bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran kecil. Gel agerose
yang telah terjadi perubahan warna, dikeluarkan dari ruang elektroforesis. Proses
elektroforesis yang telah selesai, alatnya dimatikan dengan menekan tombol ‘OFF’ dan tutup
dari flow migration chamber dibuka. Gel dari cetakan dilepaskan dan dimasukkan ke dalam
nampan, lalu ditambahkan dengan larutan A. Larutan kemudian dikocok selama 15 menit.
Larutan A dibuang dari nampan dan diganti dengan aquadest steril, lalu dikocok selama 15
menit. Aquadest dibuang dan diganti dengan larutan B, lalu dikocok selama 15 menit. Larutan
B dibuang dan diganti dengan larutan C, kemudian dikosok selama 6 menit. Larutan C
dibuang dan diganti dengan larutan D, lalu dikocok selama 30 menit atau sampai pita DNA
terlihat. Larutan D dibuang dan diganti dengan larutan E, kemudian dikocok selama 10 menit.
Larutan E dibuang dan diganti dengan larutan , kemudian dipindahkan ke dalam wadah box
dan disimpan selama 24 jam atau semalam.
Kesimpulan :

Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan elektroforesis ini yaitu molekul DNA
bermuatan negatif, apabila dialiri dengan listrik maka akan bergerak menuju elektroda yang
bermuatan negatif melalui matriks membran agarose. Faktor yang mempengaruhi laju
migrasi pada elektroforesis gel adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul,
densitas, muatan, pori-pori gel, voltase, dan laritan buffer yang digunakan dalam proses
elektroforesis.