PROSEDUR ANALISIS KUANTITATIF

SPEKTROFOTOMETRI UV/VISIBLE
Dibahas tiga prosedur analisis kuantitatif, yaitu :
1. Prosedur analisis menggunakan kurva kalibrasi,
2. Teknik internal standar dan adisi standar,
3. Analisis simultan sistem larutan biner.

1. Prosedur Analisis Kuantitatif Berdasarkan Kurva Kalibrasi

Meliputi 4 langkah yang diwajibkan, yaitu :
a. Pemilihan panjang gelombang optimal (kurva spektrofotometrik)
larutan sampel.
b. Pembuatan kurva kalibrasi dan penentuan persamaan garis
regresinya (hubungan antara Absorbansi - C deret larutan baku)
c. Pengukuran koefisien serapan analit (%T atau A),
d. Penentuan konsentrasi analit (menginterpolasikan data A analit pada
kurva kalibrasi atau berdasarkan persamaan garis regresi kurva)
1). Pemilihan panjang gelombang optimum
Efek penyerapan radiasi sinar polikromatis oleh molekul sifatnya
kompleks karena meliputi eksitasi elektronik, eksitasi vibrasi (keragaman
atom yang terdapat dalam molekul) dan eksitasi rotasi (keragaman bangun
struktur molekul). Karena itu nilai optimal energi sinar pengeksitasi (E =
h*c/) harus ditemukan dari rentang serapan molekul target. Panjang
gelombang analitik molekul (=Optimum) adalah  sinar yang paling tinggi
nilai serapannnya; yang secara empiris ditunjukkan oleh nilai A yang
paling besar atau pun %T yang paling kecil. Penggunaan tabel warna dan
komplementer (Tabel 1) efektif membantu pada tahapan ini.
Tabel 1. Warna, Panjang Gelombang dan Komplementer
(Sreitwieser, et al, 1992:1225)

 (nm) Warna (diteruskan) Komplementer

400-430 ungu (violet) hijau-kekuningan
430-480 biru kuning
480-490 biru-kehijauan jingga (orange)
490-510 hijau-kebiruan merah
510-530 hijau merah-keunguan (purple)
530-570 hijau-kekuningan ungu (violet = lembayung)
570-580 kuning biru
580-600 jingga (orange) biru-kehijauan
600-680 merah hijau-kebiruan
680-750 merah-keunguan hijau

Hfr 2016 - 1
 Warna larutan (yang tampak) adalah fraksi spektrum visible
(polikromatis) yang tidak diserap (ditransmisikan) oleh molekul larutan.
Selanjutnya fraksi spektrum yang diserap oleh larutan berwarna,
didefinisikan sebagai komplementer dari warna larutan. Jadi analisis
larutan yang berwarna biru, misalnya kompleks CuSO4 - asam bioksalat;
sesuai definisi dan data pada Tabel 1; maka rentang  serapan larutan
biru, dapat dipindai pada rentang  dari komplementernya yaitu warna
kuning ( 570-580 nm).
Jadi Optimum kompleks CuSO4 - asam bioksalat (berwarna biru) ditentukan
dengan mengukur %T atau A larutan baku pada rentang  570-580 nm.
Pengaluran nilai A hasil transformasi data %T pada larutan bakunya
(Gambar 1a) terhadap  pada sistem salib-sumbu cartesius; (Gambar 1b)
menunjukkan nilai Optimum analit. Kurva spektrofotometrik dapat
digambarkan di atas kertas grafik, atau dengan penggambaran kurva orde-
I ( vs pada Gambar 2); dapat juga dengan Microsoft excell.
Proyeksi tegak lurus titik potong kurva orde-I dengan garis-Nol absolut ke
sumbu-X, efektif menunjukkan nilai Optimum analit .

Data Hasil Hasil Konversi

Pengukuran
Puncak Kurva
,nm %T A A

580 … ……
578 … ……
576 … …...  Optimum
574 … …… 576,35 nm
572 … ……
570 … ……
570 572 574 576 578 580
(a) (b)

Gambar 1. Tabulasi dan Pengaluran A vs  Untuk Penentuan Optimum

2). Penentuan hubungan antara absorbansi, A dengan konsentrasi, c

Pembuatan kurva kalibrasi ini dilakukan dengan menggunakan deret
larutan baku dengan rentang konsentrasi mencakup konsentrasi analit
dugaan (teknik apit). Setiap larutan baku yang telah disiapkan secara teliti,
diukur parameter serapannya %T pada Optimal temuan langkah 1). Data
%T dikonversi menjadi nilai A , selanjutnya dialurkan berpasangan dengan

Hfr 2016 - 2
c pada sistem salib sumbu Cartesius (Gambar 3). Perhatikan cara
penghitungan nilai b (koefisien kemiringan garis, slope).

, nm A  A
b
574 0,31
0,30/2 = 0,15
576 0,61 0 
0,09/2 = ….
578 0,70  Titik Potong
…/2=
580 … 0
… / 2=
570 … 
(a) c
Gambar 2. Tabulasi a Kurva Orde-0 (b) dan Kurva Orde-I (c)

Akurasi preparasi yang tinggi menghasilkan kurva kalibrasi berupa

garis lurus yang melewati titik NOL; yang menyatakan fungsi hubungan
linier antara Absorbansi, A dengan konsentrasi, C.
Nilai koefisien a dan b persamaan regresi garis Ŷ = a + bX, efektif
dilakukan dengan bantuan scientific calculator (seperti Casio fx-4200P)
ataupun dengan MS-Excell, dsb.

2 Koefisien a
( titik potong )
Absorbansi

a = 0.0
1.5 Koefisien b
( slope )
b = Y/X = 0,4 / 4 = 0,1
1
````

0.5 4 Persamaan Garis

Kurva
Ŷ = 0,0 + 0,1 X
0.4

0
0 2 4 6 8 10
Konsentrasi, mg/L

Hfr 2016 - 3
 Gambar 3. Contoh Kurva Kalibrasi dan Persamaan Garisnya
3). Pengukuran parameter serapan dan penentuan konsentrasi analit
Parameter serapan berupa %T atau A larutan diukur pada Optimum.
Cara pengukuran disesuaikan dengan tipe dan petunjuk pengoperasian
instrumen. Berikut panduan umum Spectronic-20 (Gambar 4),

Tempat Tombol
Kuvet Pemilih Panjang
Gelombang

Tombol
ON/OFF
Tombol T

Gambar 5. Spektrofotometer Spectronic 20

i). Spektrofotometer “ON” dan biarkan stabil selama 15 – 30 menit,
ii). Atur modus pengukuran pada %T,
iii). Set panjang gelombang yang akan digunakan;
iv). Set %T menjadi = NOL dengan memutar tombol T ke arah berlawanan
dengan jarum jam. Jika %T = 0.0 (amati di monitor) belum tercapai;
berarti alat belum siap. Biarkan “ON” beberapa menit.
v). Jika %T telah dapat diatur mencapai “0 %T”, masukkan kuvet berisi
blanko, tutup ruang kuvet, set %T menjadi = 100 tepat dengan
memutar tombol T searah jarum jam. Pada tahap ini alat siap
digunakan. Setiap pengubahan , setting wajib diulang dari %T = 0
(tanpa kuvet) dan setting %T = 100 (kuvet berisi blanko). Dengan
memasukan kuvet ; data serapan akan langsung terbaca pada monitor.
Tipe spektrofotometer berkas ganda seperti PE Lambda series
25/35/45, akan lebih efisien dalam pengoperasiannya.

Gambar 6. Spektrofotometer Perkin Elmer Lambda 25

Hfr 2016 - 4
4) Penentuan konsentrasi analit dalam larutan cuplikan
Konsentrasi analit, dapat ditentukan dengan 2 cara :
1) Menginterpolasikan data absorbansi A hasil pengukuran pada
kurva kalibrasi (Langkah I dan II pada Gambar 5)

Kurva Kalibrasi
I
A analit

Konsentrasi analit
II perolehan

| | | | [larutan baku]
0 10 20 30 40

Gambar 5. Langkah Interpolasi Data Absorbansi Pada Kurva Kalibrasi

Untuk Penentuan Konsentrasi Cuplikan
Interpolasi diawali dengan penentuan posisi data A cuplikan pada sumbu
Y. Tarik garis lurus horisontal dari posisi A pada sumbu Y hingga
berpotongan dengan kurva kalibrasi. Selanjutnya proyeksikan titik
potong vertikal ke sumbu X; maka diperoleh data konsentrasi analit
dalam cuplikan. Agar diperoleh hasil yang akurat, sebaiknya kurva
spektrofotometri dan kurva kalibrasi dibuat di atas kertas grafik.

2) Substitusikan data hasil pengukuran (X) pada persamaan regresi

linier kurva Ŷ = a + bX.

Pada sistem digital (misalnya WPA S106-D, Genesys-10, dan Cecil-8000,

PE Lambda Series) program scanning sangat efektif untuk menetapkan
optimal.

Hfr 2016 - 5
Contoh soal :
Hasil pengukuran spektrofotometrik larutan Fe(II) diperoleh sbb. :
Larutan baku  (nm) 515 520 525 530 535
1 ppm T 25,12 22,90 20,9 16,6 30,2
Larutan baku ppm 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
T 100 53,46 28,57 15,27 8,16 4,36
Cuplikan A 0,34
Tugas : a. Tentukan Optimum analisis
b. Gambarkan kurva kalibrasinya
c. Tentukan persamaan regresi kurva kalibrasi
d. Tentukan ppm [Fe 2+] berdasarkan gambar kurva kalibrasi
dan menggunakan persamaan regresi.
Penyelesaian :
a. Penentuan Optimum :
i. Tabulasi nm 515 520 525 530 535
%T 25,12 22,9 20,9 16,6 30,2
A 0,60 0,64 0,68 0,78 0,52
A/  
ii. Penggambaran kurva spektrofotometrik orde-I (orde-0 tidak
ditampilkan)
520 525 530 535
0.04
0.02
0.02 0.008
A/

-0.02

-0.04 -0.052
Optimal : 529,3 nm
-0.06

b. Penggambaran kurva kalibrasi :

i. Tabulasi data : ppm 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0
%T 100 53,46 28,57 15,27 8,16 4,36
A 0,0 0,27 0,54 0,82 1,09 1,36
ii. Penggambaran kurva kalibrasi dan persamaan regresinya :
Koefisien-koefisien garis regresi yang diperoleh adalah :
a = -0,001
b = 0,68

Hfr 2016 - 6
 0.7
Diperoleh
0.6 Konsentrasi
Cuplikan
0.5 = 0,5 ppm
0.4
Absorbansi
Absorbansi

0.3 Cuplikan
``
0.2 = 0,34

0.1
0
0 0.4 0.8 1.2
ppm

c. Penentuan konsentrasi cuplikan, dapat dilakukan dengan cara :

 Masukkan data A cuplikan ke dalam persamaan regresi; diperoleh
persamaan : 0,34 = -0,001 + 0,68X.
Dengan demikian konsentrasi cuplikan (X), dapat dihitung sebagai :
X = (0,34 + 0,001)/0,68 = 0,501 ppm.
Bandingkan akurasi perolehan ini dengan hasil
interpolasi pada kurva kalibrasi !
 Dengan Casio fx-4200P, konsentrasi cuplikan diperoleh dengan
operasi : “0,34 shift x EXE”, setelah pasangan data konsentrasi
(ppm) dan Absorbansi dientry dengan modus “LR” (linier
regression).

Latihan :
1. Logaritme absorptivitas molar aseton dalam etanol diperoleh 1,75 L
cm-1 mol-1 pada 366 nm. Tentukan rentang konsentrasi aseton yang
dapat digunakan jika % T diinginkan > 10 % dan < 90 % pada tebal
sel 1,5 cm.
2. Suatu larutan baku disiapkan dengan teliti hingga diperoleh deret
konsentrasi Fe seperti di bawah ini. Pada 25 ml cuplikan dari setiap
larutan baku dibuat senyawa kompleks Fe(II) – o-Fenantrolin
selanjutnya diencerkan hingga 50 ml. Absorbansi hasil pengukuran
yang diperoleh, adalah :

Hfr 2016 - 7
 [Fe(II)], ppm Absorbansi
larutan asli (b = 1,00 cm)
4,0 0,16
10,0 0,39
16,0 0,63
24,0 0,95
32,0 1,26
40,0 1,58

a. Buatlah kurva kalibrasi berdasarkan data ini,

b. Tentukan persamaan hubungan antara A dan c,
c. Tentukan konsentrasi Fe(II) jika %T cuplikan = 18,2
Kunci Jawaban untuk item pilihan:
1. Rentang Konsentrasi : 5,43 X 10-5 M – 1,19 X 10-3 M
2b. A = -1,01 x 10--3 + 3,95 x 10--2 ppm Fe

C. Teknik Adisi Standar

Teknik adisi standar dan internal standar dapat dikategorikan
sebagai metoda evaluasi; yang efektif diterapkan pada kondisi konsentrasi
analit sangat rendah dan volume larutan baku sangat terbatas. Teknik
adisi standar pada prinsipnya difokuskan pada efek konsentrasi larutan
baku terhadap Absorbansi larutan contoh; dan internal standar didasarkan
pada efek volume larutan baku yang ditambahkan ke dalam larutan
cuplikan terhadap Absorbansi sistem campuran.
Misalkan pada beberapa larutan cuplikan yang mengandung analit
(Cx) bervolume sama (Vx ml), ditambahkan larutan baku pada konsentrasi
tertentu (Cs ) dalam volume beragam (V s ml). Setelah pembentukan
kompleks berwarna, larutan diencerkan hingga volume tertentu (V t) dan
Absorbansi (=hasil konversi %T) diukur pada setiap larutan. Jika hukum
Lambert-Beer terpenuhi, maka absorbansi larutan dapat dijelaskan sebagai


As  b Vx Cx  b Vs Cs *5)
 Vt Vt
sss

dan pengaluran absorbansi larutan As sebagai fungsi dari Vs menghasilkan

suatu garis lurus; dengan persamaan garis sebagai :

A =  +  Vs *6)

Hfr 2016 - 8
dengan  = (bVx Cx)/Vt sebagai koefisien titik potong pada sumbu Y, dan
nilai  = ( b Cs)/Vt menyatakan slope atau kemiringan garis kurva.

Rasio antara  dan , diperoleh persamaan 6, yaitu :

 (  b Vx Cx ) / Vt Vx Cx *7)
 (  b Cs ) / Vt Cs
Pada penyederhanaan selanjutnya, diperoleh persamaan :

 Cs *8)
Cx = Vx

Pada kondisi terbatas, perlakuan dapat dilakukan pada dua

cuplikan; larutan baku hanya ditambahkan pada salah satu cuplikan. Hasil
pengukuran Absorbansi larutan cuplikan (= A 1), dan pada system cuplikan
+ larutan baku (=An); masing-masing dapat dinyatakan sebagai :
A1 = ( b Vx Cx) / Vt *9)
An = ( b Vx Cx) /Vt + (  b Vs Cs )/Vt *10)
Berdasarkan rasio antara A1 dan An, maka konsentrasi analit dalam
cuplikan Cx dapat dihitung menurut persamaan 11 berikut :

A 1 Cs Vs
Cx = ---------------- *11)
(An - A1) Vx
Contoh soal :
Cuplikan masing-masing 10 ml dimasukkan pada 5 labu volumetrik 50 ml,
kemudian ditambahkan 0,00; 0,5; 10,0; 15,0; dan 20,0 ml larutan Fe 3+
11,1 ppm dan tiosianat berlebihan. Data A setiap wadah setelah
pengenceran, diperoleh 0,215; 0,424; 0,685; 0,826, dan 0,967.
a. Gambarkan kurva A vs volume larutan baku (Vs pada absis).
b. Tentukan persamaan regresi garis Absorbansi,
c. Tentukan [Fe3+] sampel
Penyelesaian :

Hfr 2016 - 9
 1

0.8

Absorbansi
0.6

0.4
y = 0.0381x + 0.2422
0.2

0
-10 -5 0 5 10 15 20
Volume larutan baku, Vs
Koefisien garis regresi :
 = 0,2422 (titik potong)
 = 0,0381 (kemiringan),
konsentrasi lar.baku cs = 11,1 ppm
volume cuplikan Vx = 10 ml; maka :
Cx =  Cs /  Vx = (0,2422 x 11,1)/ (0,03812 x 10)
= 7,05 ppm Fe3+

2. Pengenceran 25 ml contoh larutan quinine menjadi 50 ml memberikan

absorbansi A = 0,416 pada 348 nm dan b = 1,0 cm. Cuplikan 25 ml
larutan contoh II ditambahkan 10 ml larutan baku quinine 23,4 ppm
dan diencerkan menjadi 50 ml, memberikan A = 0,61. Tentukan
konsentrasi quinine (ppm) dalam larutan contoh ?
Penyelesaian :
Diketahui Cs quinine= 23,4 ppm, volume larutan baku Vs = 10 ml, dan
volume analit Vx = 25 ml, maka konsentrasi cuplikan Cx
Cx = A1 Cs Vs / ( A2 - A1) Vx
= (0,416 x 23,4 ppm x 10 ml)/(0,61-0,416)*25 ml
= 20,1 ppm

Tugas terstruktur : Buktikan persamaan 11 berdasarkan rasio persamaan 9

dan 10
D. Analisis Simultan Sistem Larutan Biner

Jika komponen-komponen suatu campuran tidak saling bereaksi dan

masing-masing mempunyai  optimal, maka secara spektrofotometri
penentuan komponen sistemnya dapat dilakukan secara simultan. Jika
molekul M dan N masing-masing mempunyai panjang gelombang optimal

Hfr 2016 - 10
pada 1 dan 2 maka pada campurannya diperoleh 2 Absorbansi total
campuran, masing-masing sebesar AMN1 atau A’ hasil pengukuran pada 1
dan AMN2 atau A” jika diukur pada 2. Perhatikan Gambar 6.
Oleh karena A’ dan A” adalah absorbansi total dari molekul M dan
molekul N, maka dalam bentuk persamaan Lambert-Beer masing-masing
dapat dinyatakan dalam bentuk persamaan 12 dan 13 berikut ini.
A’ = ’M . b . cM + ’N . b . cN *12)
A” = ”M . b . cM + ”N . b . cN *13
Absorptivitas molar ( setiap komponen dapat dihitung berdasarkan
absorbansi (A) larutan baku pada  optimalnya. Selanjutnya melalui
substitusi antar persamaan 12 dan 13, maka konsentrasi komponen
campuran (cM dan cN) dapat diperoleh.

A’
M+N
A”

M N

1 2
Gambar 6. Spektrum Serapan Campuran Biner Molekul M dan N
(Willard, et al, 1974, p.114)

Contoh soal :
Analisis simultan spektrofotometri senyawa kompleks kobalt dan nikel
dengan 8-hidroksiquinolinol pada 365 nm dan 700 nm diperoleh Co
masing-masing 3529,0 dan 428,9; serta Ni masing-masing 3228,0 dan
10,2. Hitunglah konsentrasi molar Co dan Ni jika pada pengukuran
cuplikan campuran pada kuvet 1,0 cm diperoleh A 365 dan A700 masing-
masing sebesar 0,888 dan 0,081.

Penyelesaian :
A365 = Co 365 . b . cCo + Ni 365 . b . cNi 1)
A700 = Co 700 . b . cCo + Ni 700 . b . cNi 2)
Hfr 2016 - 11
 0,888 = 3529,0 cCo + 3228,0 cNi 3)… x 10,2
0,081 = 428,9 cCo + 10,2 cNi 4)… x 3228, 0

9,058 = 35995,8 cCo + 32925,6 cNi 5)

261,468 = 1384489,2 cCo + 32925,6 cNi 6) 6) – 5)

252,41 = 1348493,4 cCo

cCo = 252,41 / 1348493,4 = 1,87 .10-4 M

cNi = {0,888–(3529,0 x 1,87*10-4 M)}/3228,0 = 7,06 x 10-5 M

Ringkasan
Prosedur analisis kuantitatif baku adalah :
a. Penentuan panjang gelombang optimal,
b. Pembuatan kurva kalibrasi (berdasarkan A atau %T deret larutan
baku),
c. Pengukuran serapan ( A atau % T) cuplikan,
d. Penentuan konsentrasi cuplikan (dengan interpolasi atau
persamaan regresi)
Adisi standar difokuskan pada efek konsentrasi larutan baku terhadap A
cuplikan, dengan rumus Cx = A1 Cs Vs / ( A2 - A1) Vx
Teknik internal standar didasarkan pada efek volume larutan baku
terhadap A cuplikan, dengan rumus Cx =  Cs /  Vx

Tugas Terstruktur :
1. Absorbansi 3 larutan mengandung campuran molekul Y dan Z, diukur
terpisah dalam sel serapan berukuran sama. Tentukan konsentrasi Y
dan Z larutan campuran, jika hasil pengukuran diperoleh seperti
berikut ini :

Larutan A, 475 nm A, 670 nm

0,001 M molekul Y 0,9 0,2
0,01 M molekul Z 0,15 0,65
Campuran 1,65 1,65

2. Baja 0,246 gr dilarutkan dalam asam 250 ml. Pada 50 ml cuplikan

ditambahkan kalium persulfat dan katalis Ag agar terbentuk Cr 2O72-
dan MnO4-, dan selanjutnya diencerkan hingga 100 ml. Absorbansi
campuran dalam kuvet setebal 1 cm pada 440 nm dan 545 nm
diperoleh 0,932 dan 0,778. Berapakah (a) konsentrasi molar dan (b)
persen Cr dan Mn dalam cuplikan; jika  kromat dan permanganat

Hfr 2016 - 12
pada 440 nm sebesar 369 dan 95, dan pada 545 nm masing-masing
sebesar 11 dan 2350.



Hfr 2016 - 13