Plan 

• Introduction

• Matériels et méthodes

• Résultats et discussion

• conclusion.
Introduction :
Chez les espèces a GRAM(-) ,les solutés polaires et les molécules chargées ont un très
faible taux de flux passive a travers la bicouche lipidique qui constitue la membrane cytoplasmique

Les mécanismes de transport

Transport dans le
Diffusion Transport quel le substrat est
facilitée actif métabolisé comme
il est transporté

Elle n’est pas Entrainé

largement par l’ATP ou
utilisée chez exemple
par un
les gradient :PTS
procaryotes d’ion

PEP
Transporté a travers

à
EI et HPr EII

complexe

Catalyse la
phosphorylation
et Régulation Régulation
de transport Métabolisme Chimiotaxie
l’implantation allostérique
d’un glucide

Par
Par phosphorylation et déphosphorylations des protéines interaction
prot-prot
 IIE
Devisé par similarité de séquence d’acide
aminé

6 familles

-saccharose -fructose -Cellobiose -sorbose

-glucose (RCS) (FRU) (CEL) (ROS) -galactitol
(GLC) -mannitol -lactose -mannose -glucitol (GAT)
(mtl) (lac) (homme) (intestin)

-identité de séquence est d’au moins de 25%

-similarité très faible

Galactitol (transporteur spécifique d’E coli

GATA GATC BGTA

(IIA gat) (IIC gat) (IIB gat)

45% de
Similarité similarité

IIA et IIC de Lactose et

mannitol et sous unité
perméase spécifique
cellobiose IIB

Information structurelle de IIE

Domaine Domaine
AII IIB

Structures α et B
But :
Décrire par RMN la structure de l’enzyme IIB glucitol de la famille galactitol ainsi que sont
interaction avec Gata.

Matériels et méthodes:

1- clonage , expression , la préparation et la purification des protéines recombinantes GatA et

GatB :

• Lyse des cellules.

• Préparation et purification des protéines recombinantes et de GatA BGTA en utilisant

l’électrophorese SDS polyacrilamide +spectroscopie de masse .

• Clonage de GatA a partir d’E coli O157+PCR .

2- la spectroscopie RMN :

Préparation de GatB de concentration =0,8 a 1,0 mM en présence de:

 75mM Nacl

 75mM Kcl

 1mM dithiol-1,4-threitol(DTT)

 1mM NaN3
réalisation de la RMN  :
 à 298k et 303k sur un spéctrometre BRUKER 600HTZ AVANCE équipé d’une tête à triple
résonance cryosonde inverse.
Traitement de la RMN  :
 à l’aide de XWIN-RMN+ des logeciels RMN Pipe
analyse avec Sparky 

 illustration de squelette séquentiel par la méthode 3D sauf les amides épines

dorsales de la méthionine en raison de l’élargissement de l’échange.
 Attribution des listes de déplacement chimique qui ont été déposées
BioMagResBank(www.bmrb.wisc.edu) sous le numero 6259 de l’adhésion
Remarque01:

1. La majorité des protons de la chaine latérale aliphatique et résonance de C ont été obtenues
en utilisant la HCCH TQCSY. Tandis que les protons aromatiques de la chaine latérale ont eté
affectés de la hononucléaires NOESY de 2D
2. Pour mesurer le N15 (H), les spectres à 2 dimension ont été enregistré avec et sans
amélioration de NOE

3- calculation de la structure de GatB :

NOE est limité par 3 spectres

NOESY différents

N15 (NOESY H1-C13(région Spectre NOESY

de 3D de homonucléaire
de 3D) C13/N15) de 2D

Enregistrer dans D2O

La distance entre les interprotons est définie par une description

précédente

La structure est calculée en utilisant des protocoles standard

dans la version CNS

En dernier lieu de calcule, CNS est étendu pour incorporer la

82RDC pour promouvoir le raffinage des angles dans l’éspace

20 structures de faibles énergies ont été sélectionnées a partir de 100 calcules finals(tout les
résultats sont résumés dans( le tableau 1) .
Remarque 02 :

1. PROCHEK est utilisé pour évaluer la qualité des structures

2. MOLMOL est utilisé pour générer les figures correspondantes
3. Tout les coordonnés obtenus sont déposés dans la banque PDB

4-RMN de titration :

La titration de GatB marquée avec GatA non marquée est suivie par des séries de spectre
1
H-15N HSQC de 2D , les résultats sont mixés pour produire le rapport molaire :

Protéines non marquées / Protéines marquées :

De valeurs: 0, 0.25, 0.5 ,0.75, 1, 1.5, 2 et 3

5-titration isothérmique colorimétrique (ITC):

C’est une expérience effectuée par titration colorimétrique de MicroCal VP-ITC à 15°C à l’aide
d’une RMN tomponée avec de 0.14mM de GatB ainsi que des injections de 1.27mM de GatA

Résultats et discussions :

1- dans l’ensemble des fois :

 Figure:01

GatB les boucles entre

B1α1 et B3B4

Structure III Structure II

aire aire

Figure:02

Remarque03 :

1. La structure II aire des 2 bandes a été dans terme par corrélation avec NOE

2. De la boucle B1α1 à des valeurs h NOE faible, cette dernière correspond à la boucle de site
actif contenant le site de phosphorylation sur résidus cys9

3. La RMSD qui de 0,90A° pour la protéine entière (résidus 2-94)diminue à 0,58A° lorsque les
2 boucles B1α1 et B3B4 sont exclus

4. La qualité de l’intrigue Ramanchandran est plus faible pour ces boucles

5. Les statistique géométrique et énergétique pour les 20 structures de GatB sont donnés
dans l tableau 1
 Tableau:

2-comparaison avec la cellobiose enzymatique de IIB et d’autres protéines   :

Remarque04:

-structures II aire est conservées sauf pour l’hélice α située entre B3et B4

Suggestion01:

La super famille des protéines de GatB possèdent tous un motif très similaire comprenant
un feuillet B central et une hélice α qui stabilise l’intermédiaire phosphocystéine

D-ribose- galactose, les protéines l-arabinose

Liaison avec:

2 domaines
structurellement
Protéines possède
similaires avec le
site de liaison au
sucre située à
Obtention de: proximité de la
1ere boucle entre
B1 et α1
Structures proches de
GatB

Conclusion01:

GatB est similaire à la foi: de Chey ( la protéine qui fonctionne dans la voie de transduction
du signal chimiotactisme d’E coli) et au domaine N-terminal de site de phosphorylation(p1)de CheA
3-le site actif et la réaction de phosphotransfert:

Définition de P-loop :

• Dans la super famille PTPase , la cyteine fait partie d’un motif d’anion de liaison nommé P-
loop(part de boucle commun cys-X5Arg-(ser/thr)

• Dans le cas de IIBmtl et IIBcel et GatB , P-loop ne dispose pas de rédus Arg

• Des similitudes ont été trouvé entre P-loop et les dipôles proches de l’helice-α, alors que
les différences ont été observés pour les résidus de l’extérieur du site actif .

Figure:04
Suggestion02:

Les résidus situés sur IIA et IIC ont été suffisante pour stabiliser les deux états de transition
de phosphotransfert IIA et IIB-IIB-IIC.

Conclusion02:

Même si la GatB est très proche de IIBcel et des protéines IIBmtl, l’activation de la cystéine
catalytique semble étre très proche de la famille IIBglc

-Une autre caractéristique de P-loop est sa flexibilité (peut être souple ou rigide 
-un fait intéressant, une seconde boucle mobile a été observée dans le GatB entre B3 et B4
,cette situation est unique par rapport au autres membres de la famille PTPase qui
présentent habituellement de l’hélice- bien ordonnée à cet endroit.

4-étude par RMN le complexe GatB/GatA:

Le site de liaison de protéine GatB sur la formation du complexe à été identifier par RMN qui
analyse la perturbation du déplacement chimique .

• Les résidus proche du site actif de cys9 et des boucles voisins avaient les plus grand
changement de déplacement chimique lors de l’addition de Gata, ces résultats mets en
évidence:

 Boucle 1 (entre B1et α1)

 L’ extrémité N-t de α1

 Boucle 3 ( entre B2et α2)

 Boucle5(entre B3 etB4)

 α3 est le principe site de liaison de Gata

Remarque4:

• La formation de complexe a été rapide sur l’échelle de temps de la RMN

• L’analyse sous forme de raies de résonnance montrant des échanges tel que thr 15

• Ils estiment que la durée de vie du complexe est de l’ordre de 2-5ms à 258k

• L’affinité de liaison à été mesurée par calorimétrie a titration isotherme à 14uM

Conclusion :

• Ils ont déterminé la structure de la GatB et a constaté qu’il est structurellement similaire à
IIBmtl et IIBcel, avec la présence d’une structure de P-loop-like, malgré une similarité de
séquence faible. Les différences dans la carte électrostatique autour du site catalytique
suggérer un mode d’action complètement différent pour les deux hétérodimérisations
avec l’AII et/ ou sous-unités IIC et pour le transfert de phosphoryle à l’hydrate de carbone .

• Les analyses structurales de GatA seule et en complexe avec son environnement immédiat
en amont(Hpr) et en aval (GatB) les partenaires sont actuellement en cours afin de mieux
comprendre les mécanismes qui régissent atomique transfert de phosphoryle entre les
protéines PTS différents