LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

UJI POTENSI SENYAWA ANTIMIKROBA

SECARA DIFUSI SUMURAN DAN DIFUSI PAPER DISK

OLEH

Nama : I Gede Wira Darma Atmaja

NIM : 198114113

GOLONGAN/ MEJA : C2/02

Penanggung Jawab Laporan : Theodora Diva Meita A.

NILAI 28 April 2020

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
2020
PERTANYAAN PENUNTUN
 HASIL

Kontrol Kontaminasi :

Metode Sumuran :

Kontrol Pertumbuhan Metode Sumuran

Uji Metode Sumuran

1 1
Luas Zona Hambat metode Sumuran : π d 2− π d 2
4 4

1 1
Zona jernih 25mg/mL = x 3,14 x 4,82 − x 3,14 x 0,5 2=17,890cm
4 4

1 1
Zona jernih 12,5mg/mL = x 3,14 x 3,32− x 3,14 x 0,52=8,352 cm
4 4

1 1
Zona jernih 6,25mg/mL = x 3,14 x 3,12− x 3,14 x 0,52=7,348cm
4 4

1 1
Zona jernih 3,125mg/mL = x 3,14 x 32− x 3,14 x 0,52=6,869 cm
4 4

Diameter 1 = 4,8 cm

Diameter 2 = 3,3 cm

Diameter 3 = 3,1 cm

Diameter 4 = 3,0 cm
Metode Paper Disk

Kontrol Pertumbuhan Metode Paper Disk

Uji Metode Paper Disk

Diameter 1 = 3,0 cm

Diameter 2 = 2,8 cm

Diameter 3 = 3,0 cm

Diameter 4 = 2,5 cm

Diameter 5 = 2,0 cm

Diameter 6 = 1,2 cm

1 1
Luas Zona jernih metode Paper Disk : = π d 2− π d 2
4 4

1 1
Zona jernih 25mg/mL = x 3,14 x 32− x 3,14 x 0,62=6,782cm
4 4

1 1
Zona jernih 12,5mg/mL = x 3,14 x 2,82− x 3,14 x 0,62=5,872 cm
4 4

1 1
Zona jernih 6,25mg/mL = x 3,14 x 32− x 3,14 x 0,62=6,782 cm
4 4

1 1
Zona jernih 3,125mg/mL = x 3,14 x 2,52− x 3,14 x 0,62=4,624 cm
4 4

1 1
Ampicilin = x 3,14 x 22− x 3,14 x 0,62=2,857 cm
4 4
 1 1
Aquadest = x 3,14 x 1,22− x 3,14 x 0,62=0,848 cm
4 4

PEMBAHASAN

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroorganisme yang tidak dapat
dilihat dengan kasat mata. Mikroorganisme dapat dikelompokkan menjadi virus, bakteri,
jamur, dan Protista. Dalam melakukan penelitian mengenai mikroorganisme diperlukan teknik
atau cara-cara khusus untuk mempelajari dan meneliti sifat serta karakteristik dari
mikroorganisme (Pratiwi, 2008)

Antimikroba adalah zat yang mampu membunuh atau menghambat pertumbuhan

mikroorganisme sedangkan antibiotic adalah segolongan senyawa, baik alami maupun
sintetik, yang mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia dalam
organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Suatu antibiotik yang dapat
membunuh beberapa jenis mikroba disebut antibiotik yang berspektrum luas sedangkan
antibiotik hanya dapat membunuh satu jenis mikroba saja disebut antibiotic yang berspektrum
sempit (Susrama dan dkk, 2008)

Pada percobaan ini dilakukan uji potensi senyawa antimikroba dari antibiotic berupa
amoxcicillin dan ampicillin. Amoksisilin adalah antibiotik penisilin yang melawan bakteri.
Amoksisilin digunakan untuk mengobati berbagai jenis infeksi yang disebabkan oleh bakteri,
seperti tonsilitis, bronkitis, pneumonia, dan infeksi pada telinga, hidung, tenggorokan, kulit,
atau saluran kemih (Durbin, 2020). Ampicilin adalah obat antibiotik yang digunakan untuk
mengobati infeksi tertentu yang disebabkan oleh bakteri seperti meningitis (infeksi pada
selaput yang mengelilingi otak dan sumsum tulang belakang); dan infeksi tenggorokan, sinus,
paru-paru, organ reproduksi, saluran kemih, dan saluran pencernaan. Ampisilin ada dalam
kelas obat yang disebut penisilin. Ia bekerja dengan membunuh bakteri (Anonim, 2018).

Uji ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri
dari suatu senyawa antimikroba, misalnya antibiotik, secara difusi sumuran dan difusi paper
disk. Uji animikroba ini menggunakan 2 metode uji yaitu Metode Sumuran dan Metode
Difusi Paper Disk. Mikroba yang digunakan pada uji antimikroba ini adalah E.Coli, Bakteri
Escherichia coli merupakan bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif yang bersifat
anaerob. Bakteri inidimasukkan ke dalam golongan Entero bacteriaceae. Bakteri ini biasanya
akan berkoloni yang menghasilkan bentuk sirkular, cembung dan licin pada saat dikultur
(Darmayasa, 2008). Media yang digunakan dalam praktikum ini adalah Media Nutrient Agar.

Berdasarkan hasil percobaan pada praktikum ini, telah didapatkan data untuk Luas
Zona Hambat tiap-tiap metode yaitu :

Luas Zona Hambat metode Sumuran :

1 1
Zona jernih 25mg/mL = x 3,14 x 4,82 − x 3,14 x 0,5 2=17,890cm
4 4

1 1
Zona jernih 12,5mg/mL = x 3,14 x 3,32− x 3,14 x 0,52=8,352 cm
4 4

1 1
Zona jernih 6,25mg/mL = x 3,14 x 3,12− x 3,14 x 0,52=7,348cm
4 4

1 1
Zona jernih 3,125mg/mL = x 3,14 x 32− x 3,14 x 0,52=6,869 cm
4 4

Luas Zona Hambat metode Paper Disk :

1 1
Zona jernih 25mg/mL = x 3,14 x 32− x 3,14 x 0,62=6,782cm
4 4
 1 1
Zona jernih 12,5mg/mL = x 3,14 x 2,82− x 3,14 x 0,62=5,872 cm
4 4

1 1
Zona jernih 6,25mg/mL = x 3,14 x 32− x 3,14 x 0,62=6,782 cm
4 4

1 1
Zona jernih 3,125mg/mL = x 3,14 x 2,52− x 3,14 x 0,62=4,624 cm
4 4

1 1
Ampicilin = x 3,14 x 22− x 3,14 x 0,62=2,857 cm
4 4

1 1
Aquadest = x 3,14 x 1,22− x 3,14 x 0,62=0,848 cm
4 4

Untuk metode sumuran, tingkatan luas zona hambatannya adalah

25mg/mL>12,5mg/mL>6,25mg/mL>3,125mg/mL. Hasil ini sesuai dengan literature karena
semakin tinggi konsentrasi maka semakin besar luas zona hambatan, hal ini juga didukung
dengan hasil kontrol pertumbuhan yang tidak menunjukkan adanya kontaminasi di dalam
media. Untuk metode paper disk, dengan tingkatan zona hambatannya
25mg/mL>12,5mg/mL<6,25mg/mL>3,125mg/mL>Ampicilin>Aquadest. Hal ini tentu saja
tidak sesuai dengan teori/literature karena seharusnya konsentrasi 12,5mg/mL lebih luas zona
hambatannya dari pada 6,25mg/mL tetapi data yang didapat bahwa 12,5mg/mL lebih kecil
dari pada 6,25. Kesalahan ini disebabkan fenomena overlapping yang dimana paper disk
diletakkan secara berdekatan dan menyebabkan zona hambat menjadi tercampur, lalu juga
faktor kontrol pertumbuhan yang tidak homogen menyebabkan data yang didapatkan tidak
sesuai.

Diskusi

Uji potensi antibiotik sumuran dan paper disc memiliki tujuan dan prinsip yg sama,
yaitu pengukuran potensi antibakteri/antimikroba berdasarkan pengamatan diameter daerah
hambat bakteri, yang disebabkan karena berdifusinya zat uji antibakteri. Metode difusi secara
umum dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu metode sumuran dan cakram/paper disc.
Perbedaan keduanya terletak pada metode juga alat yang digunakan. Pada metode sumuran,
dilakukan dg membuat sumuran mggunakan alat, sumuran dibuat dengan tertentu pada media
agar yang telah ditanami mikroba uji. Sedangkan pada paper disc, menggunakan kertas disc
yg mengandung antibiotik dan diletakkan di atas permukaan media agar yang telah ditanam
mikroba/bakteri. Berdasarkan video, metode paper disc dilakukan dg kertas bulat-bulat kecil,
itulah yangg kita sebut dengan kertas cakram/kertas disk/paper disc itu sendiri. Pada
praktikum uji potensi antibakteri, paper disc diberi larutan uji lalu diletakkan di atas media
agar yang sudah diberi bakteri. Hasil pengamatan yg diperoleh berupa data ada atau tidaknya
daerah bening/zona bening yg terbentuk disekeliling kertas cakram, yang menunjukkan zona
hambat pada pertumbuhan bakteri.

Variasi disk antibiotik yang digunakan bertujuan untuk melihat perbedaan daya
hambat antiobiotik satu dengan yang lain, mana yang lebih efektif dalam menghambat
pertumbuhan bakteri. Karena walaupun dalam konsentrasi yang sama, antibiotik yang berbeda
tidak selalu bisa menghasilkan daya hambat yang sama untuk pertumbuhan bakteri.

Kelebihan metode difusi sumuran yaitu senyawa antibiotik lebih mudah terdifusi,
cocok unutk senyawa nonpolar, dan lebih ekonomis jika dibandingkan dengan metode difusi
paperdisk. Sedangkan kelemahan dari metode ini yaitu kurang cocok untuk senyawa polar,
lebih sulit dilakukan, memerlukan ketelitian pada saat melubangi media agar supaya tidak
rusak, kemungkinan kontaminasi besar, karena pada saat pembuatan sumuran, tutup cawan
petri dibuka cukup lebar. Kelebihan metode difusi paperdisk yaitu mudah dilakukan dan
sederhana, cocok untuk senyawa polar, dan kemungkinan kontaminasi kecil. Sedangkan
kelemahan dari metode ini yaitu kurang cocok untuk senyawa nonpolar, kurang ekonomis,
karena paperdisk hanya dapat digunakan satu kali dan harus membeli paperdisk, senywa uji
lebih sulut berdifusi jika dibandingkan dengan metode sumuran.

Ada kemungkinan lain yg memyebabkan tidak terbentuknya zona hambat/inhibit zone.

Bakteri resisten merupakan salah satu faktor. Selain itu, adalah Konsentrasi Hambat
Minimum (KHM), suatu zat antibakteri memiliki nilai KHM dalam menghambat
pertumbuhan bakteri. Suatu zat antibakteri dikatakan mempunyai aktivitas yang tinggi apabila
konsentrasi hambat minimum terjadi pada kadar yg rendah tetapi memiliki daya
bunuh/hambat yang besar. kemudian, usia kultur bakteri, paling optimum berada pada kisaran
18-24 jam, meski beberapa penelitian ada yang sampai 36-48 jam.

Untuk yang metode difusi sumuran, antibiotiknya diletakan dalam lubang yang dibuat
pada media. Oleh karena itu harus dipreparasi. Pada praktikum di lab, senyawa uji yang
digunakan itu amoksisilin dengan konsentrasi bervariasi. Jadi preparasinya ya dilakukan
pengenceran seperti biasa, dihitung dengan rumus C1xV1=C2xV2.
 Pada preparasi mikroba uji, suspensi mikroba disetarakan terlebih dahulu
kekeruhannya dengan larutan standard Mac Farland II (konsentrasi mikroba 6x108 CFU/ml).
suspensinya bakteri yang ditambahkan dengan larutan BPW. Tujuannya adalah untuk
mengontrol konsentrasi mikroba uji, dan supaya mengetahui seberapa banyak koloni mikroba
yang terkandung pada suspensi bakteri uji.

Kemudian untuk kontrol kontaminasi media, seperti pada praktikum sebelumnya,

bahwa kontrol kontaminasi media digunakan untuk mengetahui apakah media yang
digunakan steril atau tidak. Kemudian untuk kontrol pertumbuhan bakteri uji, dibuat double
layer. Media yang menjadi base layer akan dibiarkan dulu hingga memadat, baru menuangkan
seed layer. Kemudian dibuat 1 lubang sumuran, dimana lubang sumuran ini tidak boleh
sampai menembus base layer. Kemudian pada saat pengamatan dapat dilihat bagaimana
pertumbuhan dari bakteri.

Selanjutnya untuk kontrol negatif dan pengujian potensi antibiotik. Dibuat 5 lubang
pada media. Pada lubang sumuran yang dibuat di tengah, diberi kontrol negatif (misalnya
aquadest). Hal tersebut berfungsi untuk memastikan bahwa pelarut yang digunakan benar-
benar tidak bisa menghambat pertumbuhan bakteri. Kemudian 4 lubang lainnya diberi
antibiotik dengan berbagai variasi konsentrasi. Setelah di inkubasi nanti, dan saat diamati,
maka akan terlihat zona hambat dari tiap-tiap konsentrasi. Menurut teori yang benar, bahwa
konsentrasi yang lebih besar akan menghasilkan zona hambat yang lebih besar.

Selanjutnya metode difusi paperdisk. Prinsip dari metode ini adalah terdifusinya
senyawa antimikroba kedalam media agar dimana mikroba uji sudah diinokulasikan
kepermukaan media dengan cara spread plate. Metode ini dilakukan dengan meletakkan disk
yang mengandung antibiotik yaitu Ampicillin pada media yang sudah diinokulasikan bakteri.
Disk blank ditetesi dengan berbagai macam konsentrasi antibiotik, dan jumlah/volume
antibiotik yang diteteskan pada setiap disk harus sama. Antimikroba yang digunakan untuk
pada metode paperdisk ini sama seperti yang digunakan pada metode sumuran yaitu
amoxicillin, namun pada metode ini digunakan disk yang sudah mengandung antibiotik
Ampicillin sebagai kontrol positif, serta digunakan aquadest steril sebagai kontrol negatif.

Kontrol negatif dibuat dengan cara menetesi aquadest steril pada paperdisk lalu
diletakkan pada media yang telah dibagi menjadi 5 kuadran. Kontrol negatif bertujuan untuk
mengetahui apakah pelarut (aquadest steril) yang digunakan mempunyai potensi antibiotik
atau tidak. Kontrol positif yang digunakan yaitu paperdisk yang mengandung Ampicillin.
Kontrol positif bertujuan untuk membandingkan kekuatan antara antibiotik gologan β-laktam
yang digunakan dalam penyembuhan infeksi karena bakteri (biasanya bakteri gram positif).

Overlapping terjadi karena luas zona jernih yang saling bercampur, dikarenakan
peletakkan paper disk yang terlalu dekat sehingga zonanya bercampur, dan tidak terlihat jelas.
Penentuan lubang/peletakan paper disc dilakukan searah jarum jam dari konsentrasi tinggi ke
konsentrasi rendah. Dengan harapan, peneliti/praktikan dapat membandingkan hasil uji secara
berurutan dari konsentrasi zat uji yg paling tinggi ke paling rendah. Bisa juga overlapping
terjadi karena daya difusi dari zat antibakteri uji sangat tinggi.

Fungsi kontrol untuk mengetahui apakah kita sudah menerapkan metode aseptis atau
belum, lalu apakah sudah steril atau belum alat dan bahan yang digunakan. Aplikasi uji
kepekaan mikrobia di bidang farmasi klinis adalah untuk mengetahui secara spesifik
konsentrasi optimal suatu antibiotic.

Daftar Pustaka

Anonim, 2019, Ampillin, https://medlineplus.gov/druginfo/meds/a685002.html diakses 25

april 2020

Durbin Kaci, 2019, Amoxicillin, https://www.drugs.com/amoxicillin.html diakses 25 april

2020
 Darmayasa, I. B. C. 2008. Daya Hambat Fraksinasi Ekstrak Sembung Delan
(Sphaerantus indicus L.) Terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Jurnal
Biologi. 11(2):74-77.

Jawetz, and Melnick, 1996, Mikrobiologi Kedokteran, EGC, Jakarta

Murray P.R., 1999, Manual of Clinical Mirobiology, ASM Press, Washington

Pratiwi Sylvia T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta

Susrama I. G. K, Irma S dan Suada S. I. K., 2012, Uji Aktivitas Antimikroba Beberapa
Ekstrak Bumbu Dapur terhadap Pertumbuhan Jamur Curvularia lunata (Wakk) Boed dan
Aspergillus flavus LINK, Jurnal Agroekoteknologi Tropika, Vol. 1, No. 2.