Bacterial Population Counts (Jumlah Populasi Bakteri)

Banyak studi bakteriologis mengharuskan kita untuk dapat menentukan jumlah

organisme yang ada dalam satuan volume tertentu. Beberapa metode berbeda tersedia untuk
penghitungan populasi tersebut. Metode yang digunakan ditentukan oleh tujuan penelitian.

Untuk bertahan dengan peralatan minimum, dimungkinkan untuk melakukan

penghitungan populasi dengan mengencerkan or-ganisme dan menghitung organisme dalam
sejumlah bidang mikroskopis pada slide. Pemeriksaan langsung sampel dengan teknik ini dapat
dilakukan dengan sangat cepat, dan hasil yang diperoleh cukup andal. Teknik yang mirip dengan
ini dapat dilakukan pada ruang hitung Petrof-Hauser.

Jumlah bakteri pembentuk gas dapat dibuat dengan menginokulasi serangkaian tabung
kaldu laktosa dan menggunakan tabel probabilitas statistik untuk memperkirakan jumlah bakteri.
Metode ini, memperkirakan jumlah bakteri coliform dalam sampel air, mudah digunakan,
bekerja dengan baik dalam pengujian air, tetapi terbatas pada air, susu, dan pengujian makanan.

Metode yang dilakukan menggunakan pelapisan kuantitatif (Standard Plate Count, atau
SPC) dan pengukuran kekeruhan untuk menentukan jumlah bakteri dalam sampel kultur.
Meskipun kedua metode tersebut agak paralel dengan hasil yang mereka hasilkan, ada perbedaan
yang berbeda. Untuk satu hal, SPC mengungkapkan informasi hanya terkait dengan organisme
yang layak; yaitu, koloni yang terlihat di piring setelah inkubasi hanya mewakili organisme
hidup, bukan yang mati. Hasil Turbidimetri, di sisi lain, mencerminkan keberadaan semua
organisme dalam suatu budaya, mati dan hidup.

A. Metode Plating Kuantitatif (Jumlah Plat Standar)

Dalam menentukan jumlah organisme yang ada dalam air, susu, dan makanan,
jumlah plat standar (SPC) digunakan secara universal. Ini relatif mudah untuk dilakukan
dan memberikan hasil yang sangat baik. Kita juga dapat menggunakan teknik dasar ini
untuk menghitung jumlah organisme dalam biakan bakteri.
 Prosedur ini terdiri dari mengencerkan organisme dengan serangkaian
kekosongan air steril seperti digambarkan pada gambar 23.1. Secara umum, hanya tiga
botol yang dibutuhkan, tetapi lebih banyak dapat digunakan jika perlu. Dengan
menggunakan prosedur pengenceran yang ditunjukkan di sini, pengenceran akhir 1:
1.000.000 terjadi pada blanko C. Dari blanko B dan C, jumlah organisme yang
diencerkan ditransportasikan ke dalam cawan Petri yang kosong. Nutrient agar,
didinginkan hingga 50 ° C, kemudian dituangkan ke dalam setiap lempeng. Setelah agar
nutrisi memasuki, piring diinkubasi selama 24 hingga 48 jam dan diperiksa. Piring yang
memiliki antara 30 dan 300 koloni dipilih untuk penghitungan. Dari hitungan itu adalah
hal sederhana untuk menghitung jumlah organisme per mililiter dari budaya asli. Harus
ditunjukkan bahwa akurasi yang lebih besar dapat dicapai dengan menuangkan dua piring
untuk setiap pengenceran dan rata-rata hitungan. Pelapisan duplikat, bagaimanapun, telah
dihindari karena alasan ekonomi yang jelas.
1. Penanganan Pipet
Keberhasilan dalam percobaan ini sangat tergantung pada teknik
perpipaan yang tepat. Pipet mungkin tersedia untuk Anda dalam kaleng logam
atau dalam amplop individu; mereka dapat dibuang atau digunakan kembali.
Saat mengeluarkan pipet steril dari cannister, lakukan tanpa mencemari
ujung pipet lain dengan jari-jari Anda. Ini dapat dilakukan dengan menggerakkan
tabung dengan lembut dari sisi ke sisi dalam upaya mengisolasi satu pipet dari
yang lain.
Setelah mengeluarkan pipet Anda, pasang kembali penutup pada cannister
untuk menjaga sterilitas pipet yang tersisa. Jangan menyentuh badan pipet dengan
jari-jari Anda atau meletakkan pipet di atas meja sebelum atau setelah kamu
menggunakannya. Pertahankan pipet itu steril sampai Anda menggunakannya,
dan jangan mencemari meja atau diri Anda sendiri setelah menggunakannya.
2. Prosedur Pengenceran dan Pelapisan
Ketika sedang dipanaskan, beri label tiga 99 ml kosong air steril A, B, dan
C. Juga, beri label empat cawan Petri 1: 10.000, 1: 100.000, 1: 1.000.000, dan 1:
10.000.000. Selain itu, tunjukkan dengan label jumlah yang akan disalurkan ke
setiap pelat (0,1 ml atau 1,0 ml). Kocok kultur E. coli dan pindahkan 1 ml
organisme ke blanko A, menggunakan pipet 1,1 ml steril. Setelah menggunakan
pipet, letakkan di cannister dis-card. Kocok kosong A 25 kali dalam lengkungan 1
kaki selama 7 detik dengan siku Anda di atas meja.
Tuang seperempat agar nutrien (20 ml) ke dalam masing-masing 4 piring.
Putar piring dengan lembut untuk mendapatkan campuran media dan organisme
yang merata. Langkah ini sangat penting! Terlalu sedikit aksi akan menghasilkan
dispersi yang buruk dan terlalu banyak aksi dapat menurunkan media yang
diinokulasi ke tepi. Setelah media mendingin sepenuhnya, incu-bate pada suhu 35
° C selama 48 jam, terbalik.
3. Menghitung dan Perhitungan
 Letakkan piring di atas meja dalam urutan pengenceran dan bandingkan.
Pilih piring yang memiliki tidak kurang dari 30 atau lebih dari 300 koloni untuk
hitungan Anda. Pelat dengan kurang dari 30 atau lebih dari 300 koloni secara
statistik tidak dapat diandalkan. Tempatkan piring di meja koloni Quebec dengan
tutupnya dilepas. Lihat gambar 23.4. Mulai menghitung di bagian atas piring,
menggunakan garis kotak untuk mencegah penghitungan koloni yang sama dua
kali. Gunakan penghitung tangan mekanis. Hitung setiap koloni, terlepas dari
seberapa kecil atau tidak signifikannya. Catat jumlah pada tabel di bagian A dari
Laporan Laboratorium.
Metode Penghitungan Alternatif: Cara lain untuk melakukan penghitungan
adalah dengan melepaskan tutupnya dan menempatkan piring secara terbalik di
atas penghitung koloni. Alih-alih menggunakan kisi untuk melacak, gunakan pena
merasa untuk menandai setiap koloni saat Anda menghitung. Hitung jumlah
bakteri per ml kultur yang tidak tercemar menggunakan data yang dicatat di
bagian A dari Laporan Laboratorium. Lipat gandakan jumlah koloni yang
dihitung dengan faktor dilusi (resiprokal dari dilusi).
B. Turbidimetry Determinations (Penentuan Turbidimetri)
Ketika perlu untuk membuat jumlah bakteriologis pada sejumlah besar kultur,
metode penghitungan lempeng kuantitatif menjadi alat yang agak rumit. Tidak hanya
membutuhkan banyak gelas dan media, tetapi juga memakan waktu. Metode yang jauh
lebih cepat adalah mengukur kekeruhan kultur dengan spektrofotometer dan
menerjemahkannya ke dalam jumlah organisme. Untuk mencapai hal ini, bagaimanapun,
jumlah lempeng harus digunakan untuk menentukan jumlah satu budaya kekeruhan yang
diketahui.
Untuk memahami cara kerja spektrofotometer, pertama-tama, perlu diketahui
fakta bahwa kultur bakteri bertindak sebagai suspensi koloid, yang akan mencegat cahaya
ketika melewatinya. Dalam batas-batas tertentu jumlah cahaya yang diserap berbanding
lurus dengan konsentrasi sel.
 Perhatikan bahwa seberkas cahaya putih melewati dua lensa dan celah masuk ke
dalam kisi difraksi yang mendispersikan cahaya menjadi berkas hori-zontal dari semua
warna spektrum. Panjang gelombang pendek (violet dan ultraviolet) ada di satu ujung dan
panjang gelombang panjang (merah dan inframerah) ada di ujung lainnya. Spektrum
cahaya jatuh pada layar gelap dengan celah (celah keluar) memotongnya. Hanya bagian
spektrum yang jatuh pada celah masuk ke sampel. Itu akan menjadi berkas cahaya
monochro-matic. Dengan memutar kenop kontrol panjang gelombang pada instrumen,
kisi difraksi dapat diorientasikan untuk memungkinkan panjang gelombang yang berbeda
melewati celah. Cahaya yang melewati biakan mengaktifkan tabung foto, yang, pada
gilirannya, mentransmisikan persen yang terdaftar (% T) pada galvanom-ter. Semakin
tinggi persen transmitansi, semakin sedikit sel dalam suspensi.

Slide Culture: Autotrophs (ini juga gak to bil?)

Mungkin tidak ada media tunggal atau metode yang dapat digunakan untuk melakukan
penghitungan populasi yang komprehensif dari semua mikroorganisme hidup dalam biosfer
tertentu. Media yang kami kategorikan sebagai "tujuan umum" akan, karena berbagai alasan,
menghambat pertumbuhan banyak organisme. Untuk membuat studi perbandingan organisme
hidup bebas di danau air tawar, A. T. Henrici, pada tahun 1932, merancang teknik geser
terbenam yang menegaskan kembali keberadaan banyak organisme yang tidak muncul dengan
metode lain. Meskipun perhatian aslinya adalah pada populasi alga, teknik ini bekerja dengan
baik untuk bakteri dan mikroorganisme lainnya.

Metodenya terdiri dari menangguhkan kaca-lingkup slide mikro dalam tubuh air untuk jangka
waktu tertentu. Mikroorganisme di dalam air melekat pada gelas dan berkembang biak untuk
membentuk koloni kecil yang dapat digunakan di bawah mikroskop. Meskipun tidak ada
jaminan bahwa organisme yang tumbuh di kaca adalah autotrof, banyak dari mereka.