MAKALAH KLONING GEN

Disusun untuk memenuhi

Tugas mata kuliah Bioteknologi

Oleh :
Ghina Safarah
(1708103010024)

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SYIAH KUALA
DARUSSALAM, BANDA ACEH
Jurnal : Synthesis and moleculer cloning of antimicrobial peptide chromogranin A N-46 gene
using conventional PCR

1. Latar Belakang
Secara umum, sintesis gen dapat diperoleh dengan berbagai metode seperti ligasi, metode
FokI atau ekstensi PCR. Menurut Stemmer, dua langkah PCR dilakukan. Langkah pertama
tergantung pada perakitan oligonukleotida dan langkah kedua adalah pengamplasan gen panjang
penuh menggunakan primer amplifikasi luar. Namun, satu langkah sintesis gen dipengaruhi oleh
konsentrasi oligonukleotida dan jenis DNA polymerase. Antimikroba peptida (AMP) adalah
polipeptida endogen yang dibentuk oleh organisme multiseluler untuk melindungi inang dari
mikroba patogen. Kromatogranin A adalah protein larut yang ditemukan dalam sel endokrin dan
neuron. Vasostatin-I, catestatin dan kromatogranin endogen yang diturunkan peptida A
merupakan hambatan defensif alami bagi tubuh manusia.
Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis dan mengkloning molekuler gen yang
mengkode CGA-N46. Chromogranin A N-46 (CGA-N46) adalah antimikroba peptida AMP
yang terdiri dari sebagian N ujung dari kromatogranin manusia A. Urutan pengkodean gen CGA-
N46 disintesis menggunakan alat bioinformatika gratis (Gene2Oligo) yang memungkinkan
pengembangan sintesis gen in vitro. Penelitian ini menggunakan 2 metode yaitu metode PCR
bertahap dan One Step Simplified Gene Synthesis (SGS). Gen diperoleh dalam PCR bertahap
dengan 3 langkah: PCR pertama yaitu untuk menghasilkan fragmen DNA pendek menggunakan
oligonukleotida spesifik, langkah kedua yaitu PCR (OE-PCR) ekstensi tumpang tindih untuk
mengikat fragmen DNA pendek dan langkah ketiga yaitu seluruh perakitan gen menggunakan
primer amplifikasi.

2. Metode Kerja dan Bahan

Metode pertama yang digunakan adalah PCR bertahap. Untuk mendapatkan urutan gen
CGA-N46 yang lengkap, dilakukan 3 langkah PCR bertahap. PCR pertama yaitu produksi
fragment pendek, PCR kedua yaitu PCR ekstensi OVERLAP (OE-PCR). Fragmen pendek
produk PCR dideteksi menggunakan elektroforesis gel Agarosa 2%. PCR ketiga yaitu
amplifikasi produk lengkap. Campuran yang diperoleh dari OE-PCR (2 μl) menjadi sasaran
amplifikasi PCR dengan dua primer penguat yang mengandung kod awal dan stop tambahan
dengan 5 U pfu polimerase dalam volume akhir 50 μl, dengan kehadiran 1 × pfu meter dan 200
μM dNTPs. Kondisi PCR adalah 1 siklus 95 ° C selama 5 menit dan 30 siklus pada 95 ° C
selama 30 detik, suhu pendinginan selama 30 detik dan 72 ° C selama 30 detik. Produk PCR
terakhir dianalisis dengan elektroforesis gel Agarosa 2%.
Metode kedua yang dilakukan adalah One Step Simplified Gene Synthesis (SGS).
Campuran oligonukleotida disiapkan dengan menggabungkan 5 μl dari masing-masing primer
(100 μM), kemudian diencerkan sampai konsentrasi akhir 1 μM. Dengan menggunakan
campuran ini, sebuah pengenceran dilakukan untuk menghasilkan konsentrasi yang berbeda
(500, 250, 100, 50 dan 25 nM). Lima mikroliter dari setiap campuran digunakan dalam reaksi 50
μl oleh karena itu, konsentrasi akhir dari setiap oligonukleotida dalam campuran reaksi PCR
adalah 100, 50, 25, 10, 5 dan 2,5 nM, masing-masing. Primer amplifikasi digunakan pada
konsentrasi akhir 0,4 μM. Program PCR dirancang sebagai berikut: 1 siklus 95 ° C selama 2
menit dan 30 siklus pada 95 ° C selama 30 detik, suhu anil 52 ° C selama 30 detik dan 72 ° C
selama 90 detik. Produk PCR terakhir dianalisis dengan elektroforesis gel Agarosa 2%.
Untuk menjaga integritas kloning gen yang diperkuat dilakukan dengan menggunakan kit
vektor kloning pCR II TOPO TA (Thermo Fisher Scientific, USA) yang dirancang untuk
memudahkan kloning produk PCR yang dihasilkan menggunakan polimerase DNA TAQ non-
proofreading. Ekstraksi DNA plasmid telah dilakukan pada media kultur LB semalaman yang
mengandung koloni yang ditransformasi menggunakan kit GeneJET Plasmid Miniprep untuk
mempelajari kloning dan transformasi yang berhasil. Plasmid yang diekstraksi telah dideteksi
menggunakan elektroforesis gel Agarose 1%. Konfirmasi ligasi CGA-N46 ke pCR II TOPO TA
vektor cloning dilakukan dengan PCR menggunakan primer spesifik gen dan M13 vektor primer
universal. Pengenceran plasmid dilakukan dengan enzim restriksi yaitu Ncol dan Xhol dengan
tujuan memastikan keberadaan insert (gen CGA-N46) yang diklon dalam vector pCR II TOPO.
3. Hasil
3.1. Desain Primer

Primer luar dan belakang telah dirancang dengan penambahan 2 sisi restriksi yaitu Ncol
dan Xhol seperti yang ditunjukkan pada tabel 1. Enzim restriksi ini tidak memotong urutan gen
CGA-N46 seperti yang ditunjukkan pada gambar 1.

3.2. PCR bertahap

 Gambar. 2. Elektroforesis pada gel Agarose 2% dari produk PCR menggunakan lima set
primer. Jalur (1 dan 2): mewakili PCR menggunakan oligonukleotida F0 / R0. Jalur (3 dan 4):
mewakili PCR menggunakan oligonukleotida R17 / F37. Jalur (5 dan 6): menyajikan PCR
menggunakan oligonukleotida R55 / F75. Jalur (7 dan 8): mewakili PCR menggunakan
oligonukleotida R97 / F113. Jalur (9 dan 10): mewakili PCR menggunakan oligonukleotida
F129 / R145.

Fragmen PCR dimurnikan dengan aragose untuk digunakan pada PCR langkah ke-2
dengan tujuan merakit fragmen yang terpisah. Untuk mendapatkan urutan gen CGA-N4 panjang
penuh, sebuah amplifikasi PCR; menggunakan primer luar dan dua suhu anil (60 ° C dan 65 ° C),
dilakukan dengan menggunakan templat DNA yang diperoleh dari OE-PCR. Produk PCR
dengan MW ~ 150 bp telah terdeteksi menggunakan elektroforesis gel Agarose 2% seperti yang
ditunjukkan pada Gambar. 3.

Gambar 3. Elektroforesis gel agarosa 2% dari

produk PCR. Jalur (1): Tangga DNA 100 bp
dibeli dari Life Technologies Inc. (GIBCO
BRL). Jalur (2): kontrol negatif. Jalur (3):
Produk PCR menggunakan primer luar pada
suhu anil 60 ° C. Jalur (4): Produk PCR
menggunakan primer luar pada suhu anil 65 ° C.

3.3. One Step Simplified Gene Synthesis (SGS)

Hasil elektroforesis gel pada Gambar. 4 menunjukkan bahwa hanya satu konsentrasi
campuran perakitan oligonukleotida (1 μM) memberikan ikatan lemah pada MW yang
diharapkan.
Gambar 4. Elektroforesis gel agarosa 2% dari
produk PCR. Jalur (1): 100–1500 bp Penanda DNA,
Siap pakai dibeli dari BIO BASIC. Lane (2):
kontrol negatif dengan primer amplifikasi. Jalur (3
hingga 7): Produk PCR menggunakan konsentrasi
oligonukleotida yang berbeda (1 μM, 500 nM, 250
nM 100 nM dan 50 nM).
3.4. Isolasi DNA Plasmid
Setelah pembersihan gel PCR panjang penuh, ekstensi dicapai untuk mendapatkan A-tail
untuk memfasilitasi kloning langsung dalam vektor TOPO pCR II. Untuk mempelajari gen
CGA-N46 yang disintesis, vektor rekombinan diekstraksi dan dievaluasi dari 2 klon dengan
elektroforesis pada elektroforesis gel Agarose 1% (Gambar 5).

Gambar 5. Elektroforesis gel Agarose 1 dari

ekstraksi plasmid. Jalur (1): Tangga DNA 100 bp
dibeli dari Life Technologies Inc. (GIBCO BRL).
Lane (2) clone number 1 dan Lane (3): clone
number 2.

3.5. Analisis klon yang diubah

Pertama, konfirmasi ligasi CGA-N46 ke vektor kloning TOPO TA pCR II diakui oleh
PCR menggunakan primer amplifikasi spesifik gen (MW ~ 150 bp) dan primer primer vektor
M13 seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6 dari elektroforesis gel Agarose. Sebuah band MW
~ 150 bp terdeteksi dalam produk PCR menggunakan primer gen luar dan band MW ~ 200 bp
terdeteksi dalam produk PCR menggunakan primer gen amplifikasi maju dan M13 primer
universal.
Gambar. 6. 2% elektroforesis gel
Agarose dari amplifikasi PCR
menggunakan pelat DNA yang
diperoleh dari ekstraksi plasmid.
Jalur (1): Tangga DNA 100 bp
dibeli dari Life Technologies Inc.
(GIBCO BRL). Jalur (2): kontrol
negatif. Jalur (3): PCR
menggunakan DNA klon 1 dan
primer gen luar. Jalur (4): PCR
menggunakan DNA klon 1, primer
gen luar ke depan dan primer
3.6. Analisa Batasan
Pada analisa ini, dua pita diperoleh yang menunjukkan bahwa gen CGA-N46 telah
berhasil di cloning ke dalam vector pCR II TOPO, seperti yang terlihat pada gambar 7.

Gambar 7. Elektroforesis pada 1,5% gel Agarose menunjukkan plasmid pCRII TOPO yang
dicerna dengan enzim restriksi NcoI dan XhoI. Jalur (1): Tangga DNA 100 bp (Life
Technologies Inc. GIBCO BRL). Jalur (2 dan 3): Produk PCR menggunakan primer gen luar.
Jalur (4, 5 dan 6): produk pencernaan menunjukkan plasmid dan sisipan
 DAFTAR PUSTAKA

DT Subekti., WT Armata. 2008. Kloning dan analisis hasil cloning gen GRA 1 dari takizoit
toxoplasma gondi isolate lokal. Jurnal bioteknologi. 3(8) 12-23.
Okasha, H., Safia, S. 2020. Synthesis and moleculer cloning of antimicrobial peptide
chromogranin A N-46 gene using conventional PCR. Gene reports. 18, 100571.
https://doi.org/10.1016/j.genrep.2019.100571