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ANALYSE DU POLYMORPHISME DES GENOMES NUCLEAIRE

ET MITOCHONDRIAL

L3 BCP GR 1B
TIAN YIRAN
XI JIALE
I Introduction

Le polymorphisme est un phénomène commun. La variabilité du génome consiste


en polymorphisme de séquence(mutatioin ponctuelle par analyse de RFLP par exemple)
ou polymorphsime de longueur. De plus, la source fondamentale de la variabilité
génétique existe non seulement au niveau des séquences d’ADN nucléaire mais
également au niveau des séquences extracellulaires(mitochondrie ou chloroplaste).
Pendant ce TP, nous allons étudier 2 polymorphismes chez un invertébré marin,
l’huître creuse Crassostrea gigas. Le premier est le polymorphisme de longeur de l’intron
3 d’un gène nucléaire la métallothionéine, et le deuxième est le polymorphisme de
longueur des fragments de restriction du gène mitochondrial de la cytochrome Oxydase I
(COI).

II Matériel et Méthodes

1)Extraction de l’ADN
-Prélever 0,1g de l’huître qui était dans un tube Eppendorf contenant de l’éthanol
70°. Quand à 0,1g de branchies, c’est suffisant pour donner la bonne concentration
d’ADN pour faire le PCR.
-Mettre le tissu dans un Eppendorf contenant 800 ul de tampon Tris/EDTA/NaCl dont
le tampon sert à stabiliser le pH pour le bon fonctionnement de l’enzyme. Le sel donne
une osmolarité proche du milieu intérieur pour la survie des cellules. De plus, Tris-EDTA
joue un rôle d’un inhibiteur de DNase pour éviter la destruction de l’ADN.
-Ajouter 125 ul de SDS et 10 ul de protéinase K. SDS est un détergant de
membrane ici pour dégrader les lipides membranaires(le membrane plasmique et
nucléaire) en libérant de l’ADN dans le tube et facilitant l’extraction de l’ADN. Le
protéinase K sert à la dégradation de protéine.
-Broyer le tissu complètement jusqu’à la dissolution absolue et incuber à 55°C
pendant environ 4h pour la destruction complète des cellules.
-Après les dégradations de tous les constituants de la cellule sauf l’ADN, on ajoute
300 ul de NaCl et centrifuger à 5000g pendant 5 min à 4°C. Le sel dont le sodium(Na+)
peut s’associer avec l’ADN chargé négativement(ADN-) pour la suite de la précipitation.
-Transférer 600 ul du surnageant dans un tube Eppendorf et ajouter un volume de
phénol/choloroforme/alcool isoamylique. Car le phénol/choloroforme/alcool isoamylique
est un solvant hydrophobe dont les composés hydrophobe peuvent solubiliser dans la
phase hydrophobe.Puisque l’ADN est hydrophile, il sera soluble dans la phase aqueuse
qui est au dessus de la phase hydrophobe. Bien agiter et centrifuger 10 min à 12000g à
4°C.
-Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube Eppendorf.
-Ajouter 2,5 volume d’éthanol pur froid à la phase aqueuse pour la précipitation de
l’ADN.
-Placer les tubes 20 min à -80°C puis centrifuger. Retirer l’éthanol et conserver le
culot.
-Ajouter 500 ul d’éthanol 70° pour déshydrater de l’eau dans la phase aqueuese et
puis centrifuger.
-Vider l’éthanol, sécher le culot et le reprendre dans 200 ul de l’eau ultra pure pour la
dissolution de nouveau d’ADN.

2) Amplification par PCR


-Préparer 3 tubes par couple d’amorces,dont 2 tubes avec l’ADN en parallèle et le
3e comme témoin sans ajouter de l’ADN.
NB : préparer un mélange pour 3 tubes au lieu de 3 tubes séparés pour que les tubes
aient les mêmes compositions pour PCR même ayant les erreurs de la manipulation.

Produits Volume Concentration finale


Tampon 10X 2.5 ul X
MgCl2 50mM 1.5 ul 3mM
dNTP(2mM de chaque) 2 ul 0.16mM
Amorce sens(10 pmol/ul) 1 ul 0.4 pmol/ul
Amorce antisens(10 pmol/ul) 1 ul 0.4 pmol/ul
Taq polymérase 5U/ul 0.2 ul 0.04 ul
H2O 16 ul
ADN 1 ul
Volume Final 25 ul

-Mettre les tubes dans le thermocycleur et appliquer le programme de PCR.


- 1 cycle de dénaturation 5 min 94°C
-30 cycles dénaturation 30s 94°C
hybridation 1 min 50°C
élongation 1min30 72°C
-élongation finale 5 min 72°C

Comment on chosit les 2 amorces ?


5’ 3’
3’ 5’

3’ 5’
5’ 3’

Les 2 amorces sont dans le sens 5’ vers 3’ et toujours commencent par l’extrémité libre
de 3’ de 2 brins d’ADN.
L’incubation à 94°C pendant 5min, c’est pour la dénaturation de l’ADN db en ADN sb. La
température d’hybridation est déterminée par les nombres des paires de bases A=T et
G≡C dans l’amorce. Température totale=nb(AT)×2+nb(GC) ×4
T(COI HCO)=68°C T(COI LCO)=66°C
T(MT2 F)=62°C T(MT2 R)=68°C
Ces températures sont convenables pour réaliser la hybridation même qu’ils sont
légèrement supérieur que la température théorique 50°C.

3) Digestion enzymatiques des produits de PCR du gène mitochondrial COI


-Les produits de PCR du gène mitochondrial subissent une digestion enzymatique
par l’enzyme de restriction HhaI. On prépare le mélange des 3 tubes comme avant.
Produits Volume Concentration finale
Produit PCR 10 ul
Tampon 10X 2 ul X
Eau 7.5 ul
Enzyme 20000U/ml 0.5 ul 500U/ml

4) Visualisation du polymorphisme de longueur par électrophorèse


-Couler un gel d’agarose à 1,5%(COI) et 5%(M) dans du TBE 0,5X pour la migration
des produits metallothionéine et COI.
-Ajouter une goutte de tampon de charge dans les produits de PCR pour une dilution
de 6 fois du tampon de charge(3ul pour COI et 4ul pour M). Puis déposer 15ul
d’échantillon dans les puits de gel et aussi un marqueur de taille(4ul) et faire migrer
40min à 130V.
-Visualisation sous UV.
NB : Le pourcentage d’agarose dépend de la taille d’ADN pour que la migration et la
séparation des bandes soient les plus résolutifs. Par exemple, la taille de séquence avec
le couple d’amorce HCO et LCO est environ 710 pb, donc on choisit un gel d’agarose à
1,5%. On peut aussi utiliser un gel de polyacrylamide qui sont utilisée pour les molécules
de plus petites tailles. Le bleu de dépôt contient une substance qui peut supprimer
l’influence de forme et de charge. La migration ne se fait qu’en fonction de la taille du
fragment.

III Résultats et Discussion

1) COI
Pour tous les groupes, on n’observe pas la restriction des fragments, on déduit donc
que c’est l’enzyme de restriction COI ne fonctionne plus pour la coupure des fragments
d’ADN.
Pour nos résultats, on observe aucun fragments, ce qui peut être causée soit par
l’échappe de l’amplification de PCR, soit par la dégradation de l’ADN après l’amplification
de PCR. On ne peut pas savoir si l’échantillion que l’on a utilisé est un homozygote ou un
hétérozygote. Pour l’autre groupe, on observe une bande de taille 710pb qui correspond
le longeur du fragment bien amplifié mais pas coupé par l’enzyme de restriction.
En théorie avec la présence du polymorphisme, si on observe que deux bandes,
c’est le cas d’un homozygote ; si on observe plus de deux bandes( 3 ou 4 bandes), c’est
le cas d’un hétérozytote avec les 2 allèles possédant les différents points de restriction.

2) Métallothionéine
Le polymorphisme de métallothionéine varie sur le longueur de l’intron 3 du gène
nucléaire. Sans la digesion d’enzyme, on fait donc diretement la migration
d’électrophorèse. On observe 2 bandes de différents tailles(environ 470pb et 430pb) qui
présentent les 2 différents d’allèles du gène M. Cependant les 2 bandes ont l’intensité
différente , ce qui peut dû à la mauvaise migration des différents bandes(SMEAR) , ou
les différents niveaux de PCR des 2 allèles. L’échantillon que l’on a analysé est dans le
cas d’un hétérozygote avec 2 allèles différents présents. De plus, si on observe qu’une
seule bande, c’est dans le cas d’un homozygote.

IV Conclusion

Pendant le TP, on a bien observé le polymorphisme des 2 gènes dont un gène


nucléaire(métallothionéine) et un autre gène mitochondrial de COI. En effet, c’est un
phénomène courant dans la nuture pour prèsque tous les gènes nucléaires et
extranucléaires. Les différents allèles d’un même gène vont directement avoir un effet
sur les différents caractères des organismes.
Le polymorhisme a également un effet important sur la variabilité génétique et
l’evolution des populations. Le choix des différents allèles dans les différents conditions
de l’environnement permet l’adapation et l’evolution des organismes.