Anda di halaman 1dari 19

ISSN : 1693-9883

REVIEW ARTIKEL Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. I, No.3, Desember 2004, 117 - 135

PETUNJUK PELAKSANAAN VALIDASI


METODE DAN CARA PERHITUNGANNYA
Harmita
Departemen Farmasi FMIPA-UI

ABSTRACT
Each analysis method by some reason, must be validated. The parameters are
selectivity, accuracy, precision, linearity, LOD, LOQ, ruggedness, and robustness.
The parameters need to be calculated by assay methods.
This paper try to give some information above these methods base on some
literatures (USP 23rd, WHO, journal, etc).
Key words : Validation method, Parameter, Assay and calculation methods.

VALIDASI METODA ANALISIS analis dengan kadar analit yang


sebenarnya. Kecermatan dinyatakan
Validasi metoda analisis adalah sebagai persen perolehan kembali
suatu tindakan penilaian terhadap (recovery) analit yang ditambahkan.
parameter tertentu, berdasarkan Kecermatan hasil analis sangat ter-
percobaan laboratorium, untuk mem- gantung kepada sebaran galat siste-
buktikan bahwa parameter tersebut matik di dalam keseluruhan tahapan
memenuhi persyaratan untuk peng- analisis. Oleh karena itu untuk men-
gunaannya. capai kecermatan yang tinggi hanya
dapat dilakukan dengan cara mengu-
rangi galat sistematik tersebut seperti
PARAMETER PENAMPILAN menggunakan peralatan yang telah
ANALISIS dikalibrasi, menggunakan pereaksi
dan pelarut yang baik, pengontrolan
Beberapa parameter analisis suhu, dan pelaksanaannya yang
yang harus dipertimbangkan dalam cermat, taat asas sesuai prosedur.
validasi metode analisis diuraikan
dan didefinisikan sebagaimana cara Cara penentuan:
penentuannya. Kecermatan ditentukan dengan
dua cara yaitu metode simulasi
1. Kecermatan (accuracy) (spiked-placebo recovery) atau metode
Definisi: penambahan baku (standard addition
Kecermatan adalah ukuran yang method). Dalam metode simulasi, se-
menunjukkan derajat kedekatan hasil jumlah analit bahan murni (senyawa

Vol. I, No.3, Desember 2004 117


REVIEW ARTIKEL

pembanding kimia CRM atau SRM) analit yang ditambahkan tadi dapat
ditambahkan ke dalam campuran ditemukan.
bahan pembawa sediaan farmasi Kriteria kecermatan sangat
(plasebo) lalu campuran tersebut tergantung kepada konsentrasi analit
dianalisis dan hasilnya dibandingkan dalam matriks sampel dan pada
dengan kadar analit yang ditam- keseksamaan metode (RSD). Vander-
bahkan (kadar yang sebenarnya). wielen, dkk menyatakan bahwa se-
Dalam metode penambahan baku, lisih kadar pada berbagai penentuan
sampel dianalisis lalu sejumlah ter- (X d) harus 5% atau kurang pada
tentu analit yang diperiksa ditam- setiap konsentrasi analit pada mana
bahkan ke dalam sampel dicampur prosedur dilakukan. Harga rata-rata
dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil selisih secara statistik harus 1,5% atau
dibandingkan dengan kadar yang kurang. Kriteria tersebut dinyatakan
sebenarnya (hasil yang diharapkan). secara matematik sebagai berikut:
Dalam kedua metode tersebut, per-
sen peroleh kembali dinyatakan seba- Xd
gai rasio antara hasil yang diperoleh . 100 < 5%
dengan hasil yang sebenarnya. % X0
Perolehan kembali dapat ditentukan
dengan cara membuat sampel pla- Xd (S(0,95 n – I ))
sebo (eksepien obat, cairan biologis) . 100 -- < 1,5%
kemudian ditambah analit dengan X0 n
konsentrasi tertentu (biasanya 80%
sampai 120% dari kadar analit yang
diperkirakan), kemudian dianalisis Xd = Xi – X0
dengan metode yang akan divalidasi.
Tetapi bila tidak memungkinkan Xi = hasil analisis
membuat sampel plasebo karena X0 = hasil yang sebenarnya
matriksnya tidak diketahui seperti I = nilai t pada tabel t’ student pada
obat-obatan paten, atau karena ana- atas 95%
litnya berupa suatu senyawa endo- S = simpangan baku relatif dari
gen misalnya metabolit sekunder semua pengujian
pada kultur kalus, maka dapat di- n = jumlah sampel yang dianalisis
pakai metode adisi.
Metode adisi dapat dilakukan Kadar analit dalam metode
dengan menambahkan sejumlah penambahan baku dapat dihitung
analit dengan konsentrasi tertentu sebagai berikut:
pada sampel yang diperiksa, lalu
dianalisis dengan metode tersebut. C R1
Persen perolehan kembali ditentukan =
dengan menentukan berapa persen C+S R2

118 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

R1 RSD. Rentang kesalahan yang di-


C=S ijinkan pada setiap konsentrasi analit
R2 – R1 pada matriks dapat dilihat pada tabel
di bawah ini:
C = kadar analit dalam sampel
S = kadar analit yang ditambahkan Analit pd matrik Rata-rata yg
pada sampel sampel, % diperoleh , %
R1 = respon yang diberikan sampel
R2 = respon yang diberikan campuran 100 98-102
sampel dengan tambahan analit > 10 98-102
>1 97-103
Perhitungan perolehan kembali > 0,1 95-105
dapat juga ditetapkan dengan rumus 0,01 90-107
sebagai berikut: 0,001 90-107
(CF - CA) 0,000.1 (1 ppm) 80-110
% Perolehan kembali = x 100 0,000.01 (100 ppb) 80-110
C*A 0,000.001 (10 ppb) 60-115
CF = konsentrasi total sampel yang 0,000.000.1 (1 ppb) 40-120
diperoleh dari pengukuran
CA = konsentrasi sampel sebenarnya
C*A = konsentrasi analit yang di- Contoh perhitungan:
tambahkan
Perolehan kembali Analit
Pada metode penambahan baku,
Dianggap bobot tiap tablet 175 mg.
pengukuran blanko tidak diperlukan
lagi. Metode ini tidak dapat diguna- Penimbangan 20 tablet : 20 x 175 mg
kan jika penambahan analit dapat = 3500 mg.
mengganggu pengukuran, misalnya
analit yang ditambahkan menyebab- Komposisi tablet tdd :
kan kekurangan pereaksi, mengubah
pH atau kapasitas dapar, dll. Kriteria Zat aktif : 20 x 7,5 mg = 150 mg
kecermatan dilakukan sama seperti
pada metode simulasi. Berat zat tambahan :
Pada percobaan penetapan ke- 3500 mg – 150 mg = 3350 mg
cermatan, sedikitnya lima sampel Penimbangan serbuk plasebo:
yang mengandung analit dan plaseo 3.364,791 mg ditambahkan dengan
yang harus disiapkan dengan kadar Meloksikam: 151,043 mg = 3.515,834
antara 50% sampai 150% dari kan- mg
dungan yang diharapkan.
Persen perolehan kembali seha- Meloksikam yg ditambahkan:
rusnya tidak melebihi nilai presisi 151,043 x 99,34% = 150,046 mg

Vol. I, No.3, Desember 2004 119


REVIEW ARTIKEL

PEROLEHAN KEMBALI 80, 100 % Baku = 30/100 x 4,8 mg = 1,44


DAN 120 % mg
Penimbangan baku : 30,128 mg x
Perbandingan yang digunakan untuk
99,34 % = 29,929 mg, larutkan dalam
spike placebo : baku yang ditambah-
metanol 100 ml metanol. Pipet 5 ml
kan = 70:30
untuk sekali penambahan sebagai
baku.
Perolehan kembali 80% = 80% x 4 mg
= 3,2 mg
Terdiri dari serbuk plasebo = 70/100 Contoh perhitungan % Perolehan
x 3,2 mg = 2,24 mg kembali
% Penimbangan setara 2,24 mg Rata-rata area :
serbuk plasebo = 2,24/150,05 x 1712875 + 1718115
3515,83 mg = 52,49 mg = 1715495
2
% Baku = 30/100 x 3,2 mg = 0,96
mg Jumlah meloksikam total :
Penimbangan baku : 9,664 mg x 99,34 1715495 + 3282,9347 50
% = 0,96 mg, larutkan dalam metanol x
6569,9521 1000
20 ml. Pipet 2 ml untuk sekali penam-
bahan sebagai baku. = 3,234 mg (CF)

Rec 100% = 100% x 4 mg = 4 mg Penimbangan serbuk plasebo :


Terdiri dari serbuk plasebo = 70/100 53,215 mg
x 4 mg = 2,80 mg
Baku yang ditambahkan :
% Penimbangan setara 2,8 mg
0,96 mg (C*A)
serbuk plasebo = 2,80 /150,05
x 3515,83 mg = 65,608 mg
% Baku = 30/100 x 4 mg = 1,2 mg Dalam 53,215 mg serbuk plasebo
terdapat meloksikam sebanyak :
Penimbangan baku : 24,315 mg x
99,34 % = 24,1545 mg, larutkan dalam
53,215 / 3515,834 x 150,046 mg = 2,271
metanol 100 ml metanol. Pipet 5 ml
mg (CA)
untuk sekali penambahan sebagai
baku.
% Perolehan kembali =
Rec 120% = 120% x 4 mg = 4,8 mg (CF - CA)
x 100
Terdiri dari serbuk plasebo = 70/100 C*A
x 4,8 mg = 3,36 mg
% Penimbangan setara 3,36 mg % Perolehan kembali =
serbuk plasebo = 3,36 /150,05 3,234 – 2,271
x 100 % = 100,31 %
x 3515,83 mg = 78,73 mg 0,960

120 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

METODE SPIKED PLACEBO RE- Rata rata luas puncak piroksikam :


COVERY 1541890,5
Ratio M/P = 1,3499211
Penimbangan baku meloksikam :
79,615 mg (99,34%) meloksikam ! Kadar meloksikam =
labu tentukur 200ml. Larutkan dalam 1,3499211 - 0,01700 x 50 = 3,852mg
metanol. Ultrasonik selama 30 menit. 0,0173 1000

Serbuk plasebo yang ditimbang


Pipet 2, 4, 6, 10 dan 15 ml larutan ! 92,053 mg mengandung
labu tentukur 50 ml dan tambahkan
2 ml larutan baku dalam. Tambahkan 92,053
x 150,046 = 3,92857 mg
fase gerak s/d tanda. 3516,831

3,853 x 100%
Larutan baku dalam : % Perolehan Kembali =
3,929
81,212 mg ! labu tentukur 100 ml
= 98,06%
dilarutkan dalam metanol.
2. Keseksamaan (precision)
(lihat tabel 1 di bawah ini)
Definisi:
Keseksamaan adalah ukuran
Keterangan :
yang menunjukkan derajat kese-
Persamaan regresi : y = 0,0173 x +
suaian antara hasil uji individual,
0,01700; r = 0,9999
diukur melalui penyebaran hasil in-
dividual dari rata-rata jika prosedur
Contoh perhitungan :
diterapkan secara berulang pada
Rata rata luas puncak meloksikam :
sampel-sampel yang diambil dari
2081430,5
campuran yang homogen.

Tabel 1. Hasil pengukuran kurva kalibrasi meloksikam menggunakan baku dalam

Konsentrasi Luas krotamogram rata rata Angka banding luas


meloksikam mV.det kromatrogram
(µg/ml) meloksikam
Piroksikam Meloksikam dan piroksikam

15,818 1551193,0 449819,0 0,2900


31,636 1546303,5 868274,5 0,5615
47,454 1545185,0 1303159,0 0,8434
79,090 1554005,0 2149441,0 1,3832
118,634 1553935,5 3207326,5 2,0640

Vol. I, No.3, Desember 2004 121


REVIEW ARTIKEL

Cara penentuan: koefisien variasi meningkat seiring


Keseksamaan diukur sebagai dengan menurunnya konsentrasi
simpangan baku atau simpangan analit. Pada kadar 1% atau lebih,
baku relatif (koefisien variasi). Ke- standar deviasi relatif antara labo-
seksamaan dapat dinyatakan sebagai ratorium adalah sekitar 2,5% ada
keterulangan (repeatability) atau pada satu per seribu adalah 5%. Pada
ketertiruan (reproducibility). Keter- kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya
ulangan adalah keseksamaan metode adalah 16%, dan pada kadar part per
jika dilakukan berulang kali oleh bilion (ppb) adalah 32%. Pada me-
analis yang sama pada kondisi sama tode yang sangat kritis, secara umum
dan dalam interval waktu yang diterima bahwa RSD harus lebih dari
pendek. Keterulangan dinilai melalui 2%.
pelaksanaan penetapan terpisah leng- Karena metode presisi adalah
kap terhadap sampel-sampel identik fungsi penetapan kadar pada rentang
yang terpisah dari batch yang sama, yang dapat diterima menurut De-
jadi memberikan ukuran keseksama- besis et. al. pada analisa mengguna-
an pada kondisi yang normal. Keter- kan metode HPLC akan digunakan
tiruan adalah keseksamaan metode ketentuan presisi berikut: (lihat tabel
jika dikerjakan pada kondisi yang 2 di sebelah).
berbeda. Biasanya analisis dilakukan Untuk menetapkan presisi bahan
dalam laboratorium-laboratorium campuran dan bahan sisa pada artikel
yang berbeda menggunakan pera- obat, formula berikut ini harus di-
latan, pereaksi, pelarut, dan analis gunakan untuk menentukan metode
yang berbeda pula. Analis dilakukan ketertiruan yang tepat (interlabo-
terhadap sampel-sampel yang di- ratorium).
duga identik yang dicuplik dari batch
RSD < 2 (1-0,5 log c)
yang sama. Ketertiruan dapat juga
dilakukan dalam laboratorium yang dan untuk keterulangan :
sama dengan menggunakan pera- RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,67
latan, pereaksi, dan analis yang ber-
beda. Kriteria seksama diberikan jika c = konsentrasi analit sebagai fraksi
metode memberikan simpangan desimal (contoh: 0,1% = 0,001)
baku relatif atau koefisien variasi 2%
atau kurang. Akan tetapi kriteria ini Keseksamaan dapat dihitung
sangat fleksibel tergantung pada dengan cara sebagai berikut:
konsentrasi analit yang diperiksa, 1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,
jumlah sampel, dan kondisi labora- x
..................... n
torium. Dari penelitian dijumpai maka simpangan bakunya adalah
bahwa koefisien variasi meningkat
dengan menurunnya kadar analit ( Σ (x - x )2 )
SD =
yang dianalisis. Ditemukan bahwa n–1

122 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

Tabel 2. Rentang maksimum yang diperbolehkan (Perhitungan dibuat berdasarkan


atas kepercayaan 99%).
Rentang yang Penetapan tunggal Penetapan duplo
dapat diterima Metode RSD Sistem RSD Metode RSD Sistem RSD
(% klaim) (%) (%) (%) (%)
98,5 - 101,5 0,58 0,41 0,82 0,58
97 - 103 1,2 0,82 1,6 1,2
95 - 105 1,9 1,4 2,7 1,9
90 - 110 3,9 2,8 5,5 3,9
90 - 115 4,8 3,4 6,9 4,8
90 - 125 6,8 4,8 9,6 6,8
85 - 115 5,8 4,1 8,2 5,8
75 - 125 9,7 6,9
50 - 150 19,4 13,7

2. Simpangan baku relatif atau ml. Tambahkan air sampai 50,0 ml,
koefisien variasi (KV) adalah: kocok (lakukan triplo).
SD
KV = x 100% - Pipet 2,0 ml larutan diatas. Ma-
x
sukan ke dalam labu ukur 10,0 ml.
Percobaan keseksamaan dilaku-
Tambahkan air sampai 10,0 ml.
kan terhadap paling sedikit enam
Kocok (dibuat 10 labu).
replika sampel yang diambil dari
campuran sampel dengan matriks
Standar 1000 ppm
yang homogen. Sebaiknya kesek-
samaan ditentukan terhadap sampel
- Timbang 50,0 mg tetrasiklin HCl.
sebenarnya yaitu berupa campuran
Masukan ke dalam labu ukur 25,0
dengan bahan pembawa sediaan
ml. Tambahkan air sampai 10,0 ml,
farmasi (plasebo) untuk melihat
kocok (lakukan triplo)
pengaruh matriks pembawa terhadap
keseksamaan ini. Demikian juga
- Pipet 5,0 ml larutan diatas. Ma-
harus disiapkan sampel untuk meng-
sukan ke dalam labu ukur 10,0 ml.
analisis pengaruh pengotor dan hasil
Tambahkan air sampai 10,0 ml.
degradasi terhadap keseksamaan ini.
Kocok (dibuat 10 labu)
Contoh uji homogenitas
Cara kerja : Suntikan 20 µl standar 100 ppm dan
Standar 100 ppm standar 1000 ppm pada HPLC
- Timbang 25,0 mg tetrasiklin HCl. dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit
Masukan kedalam labu ukur 50,0 dan panjang gelombang 360 nm.

Vol. I, No.3, Desember 2004 123


REVIEW ARTIKEL

Tabel 3. Homogenitas dari Tetrasiklin HCl

Konsentrasi Konsentrasi
Tetrasiklin HCl Area Tetrasiklin Area
(ppm) (ppm)
100 1782560 1000 17824940
100 1784392 1000 17830710
100 1784506 1000 17831960
100 1784857 1000 17851970
100 1785275 1000 17853480
100 1807112 1000 17895130
100 1808175 1000 17899070
100 1809577 1000 17921150
100 1823930 1000 17933210
100 1853383 1000 17959770
Nilai F 4,31

S2N (terbesar) Σ (x – x )2 120 % sebesar 100,0 mg (masing-


F= S2 = masing 6, setiap 100 mg serbuk
S (terkecil)
2
N–1
l
obat mengandung tetrasiklin HCl
S = variansi
2
50 mg). Masukan ke dalam labu
F < F tabel ukur 100,0 ml. Maka akan diper-
oleh konsentrasi larutan berturut-
Contoh perhitungan uji keseksama-
turut sebesar 400, 500 dan 600 ppm.
an (presisi)
- Larutkan dengan air sampai 100,0
Cara kerja ml, kocok
a. Pembuatan larutan baku - Saring dengan kertas saring Dura-
- Timbang baku Tetrasiklin HCl pore membran filter 0,45 mm HV.
20,0; 30,0 mg masing-masing ma- - Suntikan 20 µl larutan uji pada
sukan ke dalam labu ukur 50,0 ml. HPLC. Hitung % kadarnya.
Maka diperoleh konsentrasi larut-
an berturut-turut sebesar 400, 500 Presisi dilakukan pada sediaan
dan 600 ppm. serbuk obat Tetrasiklin HCl dengan
- Larutkan dengan air sampai 50,0 konsentrasi 80 %, 100 %, 120 % kadar
ml, kocok. Tetrasiklin HCl, masing-masing
- Suntikkan µl larutan baku pada enam kali penimbangan yang dilaku-
HPLC. kan pada hari yang berbeda selama
b. Pembuatan larutan uji 3 hari. Hasil perhitungan tersebut
- Timbang serbuk obat Tetrasiklin dapat dilihat pada tabel-tabel berikut
HCl yang kadarnya 80 %, 100 %, ini.

124 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

Tabel 4. Presisi Tetrasiklin 80 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
400 7168141 80,34
400 7159952 80,26
400 7112864 79,79
400 7136432 80,03
400 7116750 79,83
400 7127785 79,94

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,23


6
RSD ( < 2 % ) 0,28

Tabel 5. Presisi Tetrasiklin HCl 100 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
500 9184380 100,39
500 9305120 101,59
500 9502175 103,65
500 9335870 101,89
500 9283175 101,47
500 9193470 100,48

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 1,18


6
RSD ( < 2 % ) 1,17

Tabel 6. Presisi Tetrasiklin HCl 120 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
600 11206510 120,50
600 11157635 120,01
600 11124382 119,68
600 11132680 119,76
600 11173120 120,16
600 11227365 120,70

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,41


6
RSD ( < 2 % ) 1,34

Vol. I, No.3, Desember 2004 125


REVIEW ARTIKEL

Tabel 7. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
400 7158750 80,25
400 7126435 79,93
400 7109690 79,76
400 7142460 80,09
400 7171155 80,37
400 7129140 79,96

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,22


6
RSD ( < 2 % ) 0,28

Tabel 8. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 100 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
500 9195010 100,50
500 9312420 101,66
500 9392500 102,46
500 9311795 101,66
500 9176435 100,31
500 9137890 99,93

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,98


6
RSD ( < 2 % ) 0,97

Tabel 9. Presisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 120 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
600 11216645 120,60
600 11134340 119,78
600 11231470 120,75
600 11175835 120,19
600 11149590 119,93
600 11197365 120,41

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,38


6
RSD ( < 2 % ) 0,32

126 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

Tabel 10. Persisi Serbuk Obat Tetrasiklin HCl 80 %


Konsentrasi Tetrasiklin Presentasi kadar
HCl (ppm) Area (%)
400 7114565 79,81
400 7188390 80,54
400 7132320 79,99
400 7157255 80,24
400 7168430 80,35
400 7125835 79,92

SD < ( Syarat kadar terbesar – terkecil ) = 3,33 0,28


6
RSD ( < 2 % ) 0,35

3. Selektivitas (Spesifisitas) Penyimpangan hasil jika ada meru-


Definisi pakan selisih dari hasil uji keduanya.
Selektivitas atau spesifisitas Jika cemaran dan hasil urai tidak
suatu metode adalah kemampuannya dapat diidentifikasi atau tidak dapat
yang hanya mengukur zat tertentu diperoleh, maka selektivitas dapat
saja secara cermat dan seksama ditunjukkan dengan cara menga-
dengan adanya komponen lain yang nalisis sampel yang mengandung
mungkin ada dalam matriks sampel. cemaran atau hasil uji urai dengan
Selektivitas seringkali dapat dinyata- metode yang hendak diuji lalu diban-
kan sebagai derajat penyimpangan dingkan dengan metode lain untuk
(degree of bias) metode yang dilakukan pengujian kemurnian seperti kroma-
terhadap sampel yang mengandung tografi, analisis kelarutan fase, dan
bahan yang ditambahkan berupa Differential Scanning Calorimetry.
cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, Derajat kesesuaian kedua hasil ana-
senyawa asing lainnya, dan diban- lisis tersebut merupakan ukuran
dingkan terhadap hasil analisis sam- selektivitas. Pada metode analisis
pel yang tidak mengandung bahan yang melibatkan kromatografi, selek-
lain yang ditambahkan. tivitas ditentukan melalui perhi-
tungan daya resolusinya (Rs).
Cara penentuan:
Selektivitas metode ditentukan Cara kerja :
dengan membandingkan hasil ana- Untuk uji selektifitas maka zat
lisis sampel yang mengandung cema- yang akan diuji harus ditentuka dulu
ran, hasil urai, senyawa sejenis, se- panjang gelombang maksimum.
nyawa asing lainnya atau pembawa Dalam hal ini larutan tetrasiklin HCl
plasebo dengan hasil analisis sampel mempunyai panjang gelombang
tanpa penambahan bahan-bahan tadi. maksimum 360 nm. Selanjutnya

Vol. I, No.3, Desember 2004 127


REVIEW ARTIKEL

dibuat larutan baku, larutan uji dan matik yang baik, proporsional ter-
larutan blanko. hadap konsentrasi analit dalam
a. Pembuatan larutan baku tetra- sampel. Rentang metode adalah
siklin HCl pernyataan batas terendah dan
- Timbang 25,0 mg baku Tetrasiklin tertinggi analit yang sudah ditun-
HCl, masukan kedalam labu ukur jukkan dapat ditetapkan dengan
50,0 ml. kecermatan, keseksamaan, dan
- Larutkan dengan air sampai 50,0 linearitas yang dapat diterima.
ml, kocok.
- Suntikkan 20 µl larutan uji pada Cara penentuan:
HPLC. Amati puncaknya pada Linearitas biasanya dinyatakan
kromatogram HPLC. dalam istilah variansi sekitar arah
garis regresi yang dihitung berda-
b. Pembuatan larutan uji tetrasiklin sarkan persamaan matematik data
HCl yang diperoleh dari hasil uji analit
- Timbang 100,0 mg serbuk obat dalam sampel dengan berbagai kon-
tetrasiklin HCl, masukan kedalam sentrasi analit. Perlakuan matematik
labu ukur 100,0 ml. dalam pengujian linearitas adalah
- Larutkan dengan air sampai 100,0 melalui persamaan garis lurus
ml, kocok. dengan metode kuadrat terkecil an-
- Saring dengan kertas saring tara hasil analisis terhadap konsen-
Durapore membrane filter 0,45 trasi analit. Dalam beberapa kasus,
µm HV untuk memperoleh hubungan pro-
- Suntikan 20 µl larutan uji pada porsional antara hasil pengukuran
HPLC. Amati puncaknya pada dengan konsentrasi analit, data yang
kromatogram HPLC. diperoleh diolah melalui transfor-
masi matematik dulu sebelum dibuat
Hasil kromatogram Tetrasiklin HCl analisis regresinya.
standar dan sampel harus menun- Dalam praktek, digunakan satu
jukkan waktu retensi yang sama dan seri larutan yang berbeda konsen-
pada daerah sekitar waktu retensi trasinya antara 50 – 150% kadar analit
tetrasiklin tersebut tidak boleh ada dalam sampel. Di dalam pustaka,
gangguan yang dapat dilihat dari sering ditemukan rentang konsen-
kromatogram larutam blanko. trasi yang digunakan antara 0 –
200%. Jumlah sampel yang dianalisis
4. Linearitas dan Rentang sekurang-kurangnya delapan buah
Definisi: sampel blanko.
Linearitas adalah kemampuan Sebagai parameter adanya hu-
metode analisis yang memberikan bungan linier digunakan koefisien
respon yang secara langsung atau korelasi r pada analisis regresi linier
dengan bantuan transformasi mate- Y = a + bX. Hubungan linier yang

128 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

ideal dicapai jika nilai b = 0 dan Standar 1 :


r = +1 atau –1 bergantung pada arah Pipet 1,0 ml larutan baku B 3.
garis. Sedangkan nilai a menun- Masukan kedalam labu ukur 10,0 ml.
jukkan kepekaan analisis terutama Tambahkan air sampai 10,0 ml,
instrumen yang digunakan. Param- kocok.
eter lain yang harus dihitung adalah Standar 2 :
simpangan baku residual (Sy). Pipet 5,0 ml larutan baku B 3.
Dengan menggunakan kalkulator Masukkan ke dalam labu ukur 25,0
atau perangkat lunak komputer, ml. Tambahkan air sampai 25,0 ml,
semua perhitungan matematik ter- kocok.
sebut dapat diukur Standar 3 :
Pipet 5,0 ml larutan baku B 4.
Σ ( y1 – ^y1)2 Masukkan kedalam labu ukur 10,0 ml.
Sy = Tambahkan air sampai 10,0 ml,
N–2
kocok.
di mana ^y1 = a + bx Standar 4 :
Sy Pipet 5,0 ml larutan baku B 1.
Sx0 = Masukkan kedalam labu ukur 10,0 ml.
b Tambahkan air sampai 10,0 ml,
Sx0 = standar deviasi dari fungsi kocok.
Sx0 Standar 5 :
Vx0 = Pipet 5,0 ml larutan baku B 3.
x
Masukkan kedalam labu ukur 10,0 ml.
Vx0 = koefisien variasi dari fungsi Tambahkan air sampai 10,0 ml,
kocok.
Standar 6 : Larutan baku B4
Contoh penentuan linearitas Standar 7 : Larutan baku B5
Cara kerja : Standar 8 : Larutan baku B1
a. - Timbang baku tetrasiklin HCl Standar 9 : Larutan baku B2
(B1, B2, B3) masing-masing Standar 10 : Larutan baku B3
sebesar 20,0; 22,5; 25,0 mg. Suntikkan 20 µl standar (sampai
Masukkan kedalam labu ukur dengan standar 10 pada HPLC pada
25,0 ml. λ : 352 nm dan kecepatan alir 1,0
- Larutkan dengan air sampai ml/menit. Hubungan linear antara
25,0 ml, kocok. konsentrasi (ppm) dan area Tetra-
b. - Timbang baku Tetrasiklin HCl siklin HCl dalam pelarut air pada 10
(B4, B5) masing-masing sebe- perbedaan tingkat konsentrasi antara
sar 30,0; 35,0 mg. Masukkan 100 – 1000 ppm ditunjukkan pada
kedalam labu ukur 50,0 ml. tabel 9. Hasil dari analisis regresi
- Larutkan dengan air sampai menggunakan model y = ax + b dapat
50,0 ml, kocok. dilihat pada tabel 11.

Vol. I, No.3, Desember 2004 129


REVIEW ARTIKEL

Tabel 11. Linearitas dari Tetrasiklin HCl

Konsentrasi Tetrasiklin HCl


Area
(ppm)
100 1791763
200 3583526
300 5375289
400 7167052
500 9078290
600 11190450
700 12542340
800 14334110
900 16125870
1000 17918670

Slop b 17937,62
Aksis Intersep a 45047,55
Koefisien Korelasi (r) 0.999
Proses Relatif Standar Deviasi (VxO) 1,504 %
ANOVA Lineariti testing 12063,95172

5. Batas Deteksi dan Batas Kuan- kan instrumen atau tidak. Pada
titasi analisis yang tidak menggunakan
Definisi: instrumen batas tersebut ditentukan
Batas deteksi adalah jumlah ter- dengan mendeteksi analit dalam
kecil analit dalam sampel yang dapat sampel pada pengenceran bertingkat.
dideteksi yang masih memberikan Pada analisis instrumen batas deteksi
respon signifikan dibandingkan dapat dihitung dengan mengukur
dengan blangko. Batas deteksi me- respon blangko beberapa kali lalu
rupakan parameter uji batas. Batas dihitung simpangan baku respon
kuantitasi merupakan parameter blangko dan formula di bawah ini
pada analisis renik dan diartikan dapat digunakan untuk perhitungan
sebagai kuantitas terkecil analit da-
lam sampel yang masih dapat meme- k x Sb
Q=
nuhi kriteria cermat dan seksama. Sl

Cara penentuan: Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ


Penentuan batas deteksi suatu (batas kuantitasi)
metode berbeda-beda tergantung k = 3 untuk batas deteksi atau 10
pada metode analisis itu mengguna- untuk batas kuantitasi

130 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

Sb = simpangan baku respon analitik a. Batas deteksi (Q)


dari blangko Karena k = 3 atau 10
Sl = arah garis linear (kepekaan Simpangan baku (Sb) = Sy/x,
arah) dari kurva antara respon maka
terhadap konsentrasi = slope (b
pada persamaan garis y = a+bx) 3 Sy/x
Q=
Sl
Batas deteksi dan kuantitasi
dapat dihitung secara statistik b. Batas kuantitasi (Q)
melalui garis regresi linier dari kurva
kalibrasi. Nilai pengukuran akan 10 Sy/x
sama dengan nilai b pada persamaan Q=
Sl
garis linier y = a + bx, sedangkan
simpangan baku blanko sama dengan
simpangan baku residual (Sy/x.) Perhitungan LOD dan LOQ

Tabel 12. Hasil pengukuran Kurva Kalibrasi Meloksikam

Konsentrasi meloksikam Luas kromotogram rata-rata


(mg/ml) Meloksikam (mV.det)

15,818 423452,5
31,636 832117
47,454 1252741
79,090 2101372,5
118,634 3149102

Persamaan regresi ; y = 26569,95 x – 3282,9347

No Kons.analit
Area (Yi) Yi (Yi – Yi)2
(µg/ml)

1. 15,818 423.452,5 417053,67 40945025,37


2. 31,636 832.117,0 837390,28 27807481,96
3. 47,454 1.252.741,0 1257461,19 22280193,64
4. 79,090 2.101.372,5 2098134,41 10485226,85
5. 118,634 31.49102,0 3148710,23 153483,73

Σ = 101671411,6

Vol. I, No.3, Desember 2004 131


REVIEW ARTIKEL

Y didapat dari pers regresi, misalnya: 6. Ketangguhan metode (rugged-


X = 15,82 maka ness)
Definisi:
y = 26569,95 x – 3282,9347
Ketangguhan metode adalah
= 417053,67 derajat ketertiruan hasil uji yang
diperoleh dari analisis sampel yang
S (y/x)2 = Variasi variabel respon (y), sama dalam berbagai kondisi uji nor-
didapat dari data-data yang dekat mal, seperti laboratorium, analisis,
dengan garis regresi instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari
yang berbeda, dll. Ketangguhan
Σ (yi – yi)2 biasanya dinyatakan sebagai tidak
=
N–2 adanya pengaruh perbedaan operasi
atau lingkungan kerja pada hasil uji.
101671411,60 Ketangguhan metode merupakan
= = 33890470,52
3 ukuran ketertiruan pada kondisi
operasi normal antara lab dan antar
S (y/x) = V 33890470,52 = 5821,55 analis.
Cara penentuan:
LOD= 3.SD/b LOQ= 10.SD/b Ketangguhan metode ditentukan
dengan menganalisis beningan suatu
3.5821,55 10.5821,55 lot sampel yang homogen dalam lab
= =
26569,95 26569,95 yang berbeda oleh analis yang ber-
beda menggunakan kondisi operasi
= 0,66 µg/ml = 2,19 µg/ml yang berbeda, dan lingkungan yang
berbeda tetapi menggunakan pro-
Cara lain untuk menentukan sedur dan parameter uji yang sama.
batas deteksi dan kuantitasi adalah Derajat ketertiruan hasil uji kemu-
melalui penentuan rasio S/N (signal dian ditentukan sebagai fungsi dari
to noise ratio). Nilai simpangan baku variabel penentuan. Ketertiruan
blanko ditentukan dengan cara dapat dibandingkan terhadap kesek-
menghitung tinggi derau pada peng- samaan penentuan di bawah kondisi
ukuran blanko sebanyak 20 kali pada normal untuk mendapatkan ukuran
titik analit memberikan respon. Sim- ketangguhan metode. Perhitung-
pangan baku blanko juga dihitung annya dilakukan secara statistik
dari tinggi derau puncak ke puncak, menggunakan ANOVA pada kajian
jika diambil dari tinggi puncak kolaboratif yang disusun oleh
derau atas dan bawah (Np-p) maka s0 Youden dan Stainer.
= Np-p/5 sedangkan kalau dari pun-
cak derau bawah saja (puncak negatif) 7. Kekuatan (Robustness)
maka s0 = Np/2, selanjutnya perhi- Untuk memvalidasi kekuatan
tungan seperti tersebut di atas. suatu metode perlu dibuat perubahan

132 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

metodologi yang kecil dan terus bergantung pada tipe prosedur ana-
menerus dan mengevaluasi respon litik. Metode yang digunakan untuk
analitik dan efek presisi dan akurasi. pemeriksaan produk farmasetika
Sebagai contoh, perubahan yang di- dapat diklasifikasikan seperti di
butuhkan untuk menunjukkan keku- bawah ini :
atan prosedur HPLC dapat mencakup ! Kategori I : metode analitikal un-
(tapi tidak dibatasi) perubahan tuk kuantitasi komponen maupun
komposisi organik fase gerak (1%), substansi bahan baku obat atau
pH fase gerak (± 0,2 unit), dan peru- bahan aktif (termasuk pengawet)
bahan temperatur kolom (± 2 - 3° C). pada hasil akhir farmasetika ter-
Perubahan lainnya dapat dilakukan masuk dalam kategori I.
bila sesuai dengan laboratorium.
Identifikasi sekurang-kurangnya ! Kategori II : Metode analitik untuk
3 faktor analisis yang dapat mem- menentukan campuran dalam
pengaruhi hasil bila diganti atau substansi bahan baku atau kompo-
diubah. Faktor orisinal ini dapat nen sisa pada produk akhir farma-
diidentifikasi sebagai A, B, dan C. setika dimasukkan dalam kategori
Perubahan nilai faktor-faktor ini II. Metode ini termasuk perhi-
dapat diidentifikasi dengan a, b, dan tungan kembali secara kuantitatif
c. Lakukan analisis pada kondisi dan batas tes.
yang telah disebutkan pada peme- ! Kategori III : Metode analitik ini
riksaan ketangguhan. untuk menentukan performa ka-
rakteristik (contoh: disolusi, pe-
Nilai
Penetapan lepasan obat) termasuk dalam
eksperimental kategori III.
faktor
#1 #2 #3 #4
A atau a A A a a Untuk masing-masing kategori
B atau b B b B b diperlukan informasi analitik yang
berbeda. Tabel 13 berikut mem-
C atau c C c c C
berikan langkah-langkah mengenai
Untuk menentukan efek peru- parameter analitik yang biasanya
bahan A, banding rata-rata hasil (#1 diperlukan untuk masing-masing
+ #2)/2 dengan (#3 + #4)/2, Untuk kategori.
efek perubahan B, bandingkan (#1 +
#3)/2 dengan (#2 +#4)/2 dan sete- Tes SST (system suitability tests)
rusnya. Dari validasi metode yang
dilakukan dapat diketahui apakah
SELEKSI PARAMETER suatu metode analisis (dalam hal ini
ANALITIK kromatografi) dapat dipakai pada
Parameter analitik yang diper- suatu kondisi tertentu. Untuk
lukan untuk validasi dapat bervariasi mengetahui apakah metode tadi

Vol. I, No.3, Desember 2004 133


REVIEW ARTIKEL

Tabel 13. Parameter analitik yang harus dipertimbangkan untuk tipe prosedur analitik
yang berbeda

Parameter Kualitatif Perhitungan Perhitungan kembali Perhitungan


Performa (ID) kembali Kategori II Kembali
Analitik Kategori I Kuantitatif Batas tes Kategori III
Akurasi tidak ya ya * *
Presisi tidak ya ya tidak ya
Spesifisitas ya ya ya ya *
Batas deteksi ya tidak tidak ya *
Batas
kuantitasi tidak tidak ya tidak *
Linearitas tidak ya ya tidak *
Rentang tidak ya ya * *
Ketangguhan ya ya ya ya ya
* mungkin dibutuhkan, bergantung pada sifat tes yang spesifik.

masih dapat dipakai, seyogyanya Fabre. H. et.al., Assay validation for


dilakukan uji SST, seperti yang dian- an active ingredient in a pharma-
jurkan oleh USP XXII/XXIII atau ceutical formulation: Practical
peneliti lainnya (Wahlich & Carr, approach using ultraviolet spec-
1990). Sebaiknya semua parameter trophotometry. Analyst, 1993.
validasi diuji SSTnya, sedangkan 118: 1061.
khusus untuk kromatografi param- Garfield, F.M. Quality Assurance
eter tailing factor dan column effi- Principles for Analytical Labora-
ciency/ plate count juga diuji. tories. AOAC International,
USA, 1991. p. 71
Ibrahim S. Penggunaan Statistika
dalam Validasi Metode Analitik
DAFTAR PUSTAKA dan Penerapannya. Dalam Pro-
siding temu ilmiah nasional
Carr, G.P., Wahlich, J.C., Journal of bidang Farmasi. VI – 15. 2001.
Pharmaceutical and Biomedical Indrayanto G, Seminar Sehari Instru-
Analysis 1990, 8: 612-618. mentasi PT Ditek Jaya, Surabaya,
Debesis, E. et al., Submitting HPLC 1994.
methodes to the compendia and Siregar, Mirawati., Penetapan Kadar
regulatory agencies. Pharm. Meloksikam dalam sediaan tab-
Tech., September 1982. p. 120 let dan Darah Manusia secara

134 MAJALAH ILMU KEFARMASIAN


REVIEW ARTIKEL

kromatografi Cair Kinerja Ting- Technical Report Series No. 823)


gi, Tesis S2 Ilmu Kefarmasian p. 117
Departemen Farmasi FMIPA-UI, Validation of Compendial Methods.
2004. United States Pharmacopoeia 23rd
Validation of analytical procedures revision, United States Pharma-
used in the examination of phar- copoeia Convention, Rockville,
maceutical materials. World MD, 1995. p. 1982.
Health Organization 1992 (WHO

Vol. I, No.3, Desember 2004 135