Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas protease dari probiotik Lactobacillus
bulgaricus dan pengaruh probiotik Lactobacillus bulgaricus dalam fermentasi pakan ampas
tahu untuk meningkatkan produktivitas cacing tanah. Metode yang digunakan untuk
penentuan aktivitas protease dalam hidrolisis substrat kasein adalah metode Bradford. Dari
hasil penelitian, probiotik Lactobacillus bulgaricus menghasilkan protease selama 18 jam
pertumbuhan, dengan aktivitas protease sebesar 131,04 U/mL. Probiotik Lactobacillus
bulgaricus OD 0,6 dapat menghidrolisis protein ampas tahu sebesar 1,48 µg/mL dalam 12
jam fermentasi. Produktivitas cacing tanah mengalami peningkatan berat cacing tanah
karena adanya pengaruh probiotik Lactobacillus bulgaricus pada pakan ampas tahu yang
ditunjukkan dengan persen kenaikan berat cacing tanah sebesar 32,13%.
Abstract
The aims of this study were to determine the protease activity of the Lactobacillus
bulgaricus probiotic and to know the effect of tofu dregs feed fermentation in increment of
the earthworms productivity. The Bradford method was used for determination of protease
activity in the hydrolysis of casein substrate. From the research, the Lactobacillus
bulgaricus probiotic released protease during 18 hours of growth and the protease activity
was 131,04 U/mL. Lactobacillus bulgaricus probiotic in 0.6 OD could hydrolyze protein of
tofu dregs as well as 1.48 µg/mL during 12 hours of fermentation. The earthworms
productivity could increase the weight of earthworms due to the influence of Lactobacillus
bulgaricus probiotic in tofu dregs feed, it was indicated by the increment of earthworms
weight up to 32.13%.
kasein dalam buffer fosfat pH 7). Larutan 4 jam diamati sifat fisik dari ampas tahu
diinkubasi kembali selama 10 menit pada yang meliputi perubahan tekstur, bau, dan
suhu 37oC. Kemudian larutan ditambahkan warna. Selain itu, pada interval tersebut
500 µL asam trikloroasetat (TCA) 0,4 M. juga dilakukan sentrifugasi untuk
Larutan yang sudah mengendap, memisahkan supernatan yang akan
disentrifuge untuk memisahkan endapan digunakan untuk penentuan kadar protein.
dan supernatan. Supernatan yang diperoleh
diukur nilai absorbansinya menggunakan Uji kinerja probiotik Lactobacillus
metode Bradford, yang selanjutnya dapat bulgaricus pada cacing tanah.
dihitung kadar proteinnya (Enggel et al., Kondisi optimum yang diperoleh dari
2004). konsentrasi probiotik dan waktu
fermentasi probiotik, digunakan untuk
(kadar enzim)(Vtot)
Unit/mL enzim = x Fp (1) melakukan uji kinerja probiotik
(𝑉)(𝑡)
Lactobacillus bulgaricus pada cacing
Keterangan: tanah. Cacing tanah ditentukan beratnya
Vtot = Volume total dalam analisis (ml) terlebih dahulu. Selanjutnya, cacing tanah
V = Volume enzim yang digunakan (ml) diberikan umpan berupa pakan ampas tahu
t = Waktu analisis (menit) yang dicampur dengan probiotik
Fp = Faktor pengenceran selama analisis Lactobacillus bulgaricus.
Pertumbuhannya diamati selama 16 hari.
Penentuan kadar protein. Setelah16 hari, cacing tanah ditimbang
Sebanyak 100 µL sampel di tambah kembali untuk mengetahui berat cacing
dengan 5 mL Bradford dan 3 mL akuades. tanah setelah diberikan umpan probiotik.
Larutan dihomogenkan hingga larut
sempurna. Selanjutnya larutan diinkubasi Hasil dan Pembahasan
pada suhu 37oC selama 5 menit. Kemudian Kurva Pertumbuhan Lactobacillus
larutan diukur nilai absorbansinya bulgaricus.
menggunakan spektrofotometer UV-VIS Pola pertumbuhan Lactobacillus
pada λ 595 nm. Kadar protein dalam suatu bulgaricus ditampilkan pada Gambar 1.
sampel ditentukan dengan memasukkan Pertumbuhan mikroorganisme
nilai absorbansi yang terbaca pada didefinisikan bertambahnya jumlah sel
spektrofotometer kedalam persamaan dari satu sel menjadi jutaan sel setelah
regresi liner hasil ekstrapolasi kurva terjadi pembelahan. Berdasarkan Gambar
standar BSA (Bradford, 1976). 1 dapat dijelaskan bahwa pola
pertumbuhan bakteri Lactobacillus
Uji kinerja probiotik Lactobacillus bulgaricus mengalami 4 fase yaitu fase
bulgaricus pada pakan ampas tahu. lag, fase log (fase eksponensial), fase
Uji kinerja probiotik dilakukan dengan stasioner dan fase kematian. Fase lag
cara memfermentasi pakan ampas tahu merupakan fase adaptasi bakteri untuk
dengan variasi optimasi konsentrasi dan mulai tumbuh pada media yang baru,
waktu fermentasi probiotik. Optimasi sehingga pada fase ini belum terjadi
konsentrasi probiotik dilakukan dengan peningkatan sel. Fase lag terjadi pada jam
cara menyiapkan 5 gelas beker yang berisi ke-0 sampai jam ke-8. Sedangkan pada
masing-masing 20g ampas tahu yang fase log, pertumbuhan bakteri sangat cepat
dilarutkan dalam 20 mL akuades. Masing- karena nutrisi yang tersedia masih
masing wadah ditambahkan 25 mL mencukupi. Selama fase ini bakteri
suspensi probiotik OD 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 tumbuh pada kecepatan maksimum. Fase
dan 1. Fermentasi dilakukan dengan log terjadi pada jam ke 12 sampai jam ke
menshaker masing-masing wadah pada 18. Setelah mengalami peningkatan
suhu kamar selama 20 jam. Setiap interval jumlah sel yang tinggi, maka kebutuhan
makanan bakteri akan berkurang. Oleh jam dapat dimungkinkan terjadi fase
karena itu, sebagian bakteri akan kematian. Karena setelah 48 jam, bakteri
mengalami kematian karena kekurangan yang mengalami fase kematian
nutrisi sehingga bakteri berada pada titik ditunjukkan dengan penurunan jumlah sel.
kejenuhan yang disebut fase statisoner. Hal ini dikarenakan nutrisi yang ada pada
Jumlah bakteri yang hidup dan mati akan media sangat rendah sehingga
sama sehingga jumlahnya terlihat konstan. mengakibatkan tidak ada pertumbuhan
Fase ini terjadi pada jam ke-20 hingga jam bakteri lagi (Waluyo, 2004). Waktu
ke-48. Pada Gambar.1 tidak terdapat fase pertumbuhan optimal dalam pertumbuhan
kematian Lactobacillus bulgaricus karena Lactobacillus bulgaricus yaitu selama 16
kurangnya waktu inkubasi. Namun, jika jam.
waktu inkubasi diperpanjang melebihi 48
0.4
Optical Density (OD)
0.35
0.3
0.25
λ 600 nm
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Waktu tumbuh (jam)
Gambar 1. Kurva pertumbuhan Lactobacillus bulgaricus
masing media biakan menjadi protein yang Sedangkan pada media biakan yang
lebih sederhana. mengandung pakan ampas tahu memiliki
Untuk mengecek ada tidaknya protease aktivitas protease sebesar 131,04 U/mL.
yang dihasilkan oleh probiotik, supernatan Protease adalah enzim penghidrolisis
pada waktu inkubasi 18 jam dilakukan uji protein menjadi senyawa-senyawa yang
aktivitas protease (Enggel et al., 2004). Uji lebih sederhana seperti peptide atau asam
aktivitas protease menggunakan metode amino (Bergman, 1942). Adanya protease
hidrolisis substrat (kasein) oleh protease tesebut dapat ditunjukkan dari besarnya
menggunakan metode Bradford. Substrat nilai aktivitas protease yang terdapat pada
yang ditambahkan, diukur nilai masing-masing media biakan. Aktivitas
absorbansinya terlebih dahulu protease pada media yang mengandung
menggunakan metode Bradford sehingga BSA hanya selisih 2,24 U/mL dari
diperoleh kadar protein sebesar 39,4 µg/ aktivitas protease pada media pakan ampas
mL. Aktivitas protease oleh probiotik tahu. Hal ini menunjukkan bahwa pakan
Lactobacillus bulgaricus, dapat ampas tahu yang dianggap limbah, jika
ditampilkan pada Tabel 2. dicampurkan probiotik Lactobacillus
Unit aktivitas protease didefinisikan bulgaricus memiliki aktivitas protease
banyaknya enzim yang dapat yang tidak jauh berbeda dengan tambahan
menghidrolisis 1 µg/mL protein per menit BSA. Sehingga Lactobacillus bulgaricus
pada kondisi percobaan. Berdasarkan dapat digunakan sebagai probiotik dalam
Gambar 3 dapat dijelaskan bahwa media tambahan pakan ampas tahu karena
biakan yang mengandung BSA memiliki mampu menghasilkan protease.
aktivitas protease sebesar 133,28 U/mL.
3,18
4
Kadar protein (µg/mL)
3
1,76
3
2
2
1
1
0
+ BSA 1 µg/mL + ampas tahu 1 gram
Optimasi konsentrasi dan waktu negatif yang berarti telah terjadi degradasi
fermentasi optimum probiotik protein kompleks yang terdapat pada
Lactobacillus bulgaricus pada pakan pakan ampas tahu menjadi asam-asam
ampas tahu. amino yang lebih sederhana dengan
Data masing-masing hasil optimasi adanya protease. Konsentrasi optimum
dapat ditampilkan pada Gambar 4. Grafik probiotik Lactobacillus bulgaricus
variasi konsentrasi menunjukkan adanya ditentukan berdasarkan hasil regresi yang
penurunan kadar protein terhadap waktu memiliki nilai slope paling besar yang
fermentasi dari jam ke-0 sampai jam ke- menunjukkan adanya laju penurunan kadar
20. Hasil regresi dari masing-masing protein. Dari kelima variasi OD probiotik
variasi konsentrasi juga menunjukkan nilai Lactobacilus bulgaricus, probiotik OD 0,6
yang memiliki kriteria yang sesuai yakni warna. Tekstur pakan ampas tahu sebelum
memiliki regresi sebesar y = -0.413x + fermentasi yaitu kasar dan sedikit padat.
6.568. Sehingga probiotik OD 0,6 Sedangkan selama fermentasi pakan
dianggap sebagai konsentrasi probiotik ampas tahu menjadi lunak dan berair. Dari
optimum. Sedangkan waktu fermentasi segi bau, pakan ampas tahu awalnya
optimum pada pakan ampas tahu, juga berbau tidak sedap ditunjukkan dengan pH
ditentukan berdasarkan Gambar 4 yakni 7,setelah difermentasi pH nya turun
terjadi penurunan kadar protein sisa menjadi 5 dan tidak menghasilkan bau
berturut-turut dari waktu ke waktu. yang menyengat karena danya senyawa
Fermentasi pakan ampas tahu yang metabolit sekunder yang dihasilkan oleh
optimum berada pada jam ke-16. Pada jam probiotik. Sedangkan warna pakan ampas
tersebut terjadi penurunan yang signifikan tahu sebelum fermentasi berwarna putih
Selama fermentasi, pakan ampas tahu pucat, namun selama proses fermentasi
yang dicampur dengan probiotik pakan ampas tahu menjadi putih
Lactobacillus bulgaricus juga dianalisis kekuningan.
sifat fisiknya yang meliputi tektur, bau dan
133,28 131,04
135
Aktivitas protease (U/mL)
120
105
90
75
60
45
30
15
0
+BSA 1 µg/mL +ampas tahu 1 gram
Gambar 3. Aktivitas protease Lactobacillus bulgaricus
Uji Kinerja Probiotik Pada Cacing Tanah. Lactobacillus bulgaricus OD 0,6 dan
Uji ini dilakukan berdasarkan kondisi waktu fermentasi 12 jam. Pertumbuhan
optimasi konsentrasi dan waktu fermentasi cacing tanah, diamati selama 16 hari.
pada pakan ampas tahu, yaitu probiotik Setelah 16 hari,cacing tanah ditimbang
kembali beratnya untuk mengetahui efek Persen kenaikan berat cacing tanah dapat
probiotik Lactobacillus bulgaricus dalam ditunjukkan pada Gambar 6.
peningkatan produktivitas cacing tanah.
7 7
Kadar protein sisa
4 4
(µg/mL)
3 3
2 2
1 A 1 B
0 0
0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20
Waktu fermentasi (jam) Waktu fermentasi (jam)
7 7
Kadar protein sisa
(µg/mL)
4 R² = 0.9895 4
3 3
2 2
1
C D
1
0 0
0 4 8 12 16 20 0 4 8 12 16 20
Waktu fermentasi (jam) Waktu fermentasi (jam)
7
Kadar protein sisa
6 y = -0.293x + 6.528
5
R² = 0.9944
(µg/mL)
4
3
2
1 E
0
0 4 8 12 16 20
Waktu fermentasi (jam)
Gambar 4. Grafik pengaruh jumlah Lactobacillus bulgaricus (diwakili dengan OD)
terhadap degradasi protein ampas pada berbagai waktu fermentasi. A (OD 0,2); B (OD 0,4);
C (OD 0,6); D (OD 0,8); E (OD 1)
Gambar 5. Kondisi pakan ampas tahu sebelum fermentasi (kiri) dan kondisi pakan ampas
tahu setelah fermentasi (kanan).
Pertambahan berat cacing tanah dapat probiotik lebih tinggi daripada berat cacing
terlihat dari selisih antara berat cacing tanah yang hanya diberikan umpan pakan
tanah pada hari ke-0 sebelum pemberian ampas tahu.
pakan hingga 16 hari setelah pemberian Selama proses fermentasi, kondisi
pakan. Pada Gambar 6 dan 7 menunjukkan pakan ampas tahu juga diamati yang
bahwa kenaikan berat cacing tanah pada meliputi bau. Bau pakan ampas tahu yang
pakan ampas tahu yang mengandung dicampur dengan probiotik Lactobacillus
bulgaricus yang umumnya berbau tidak dengan hanya diberikan pakan ampas tahu.
sedap, namun selama fermentasi pakan Enzim protease yang dihasilkan oleh
ampas tahu tidak berbau sehingga ramah probiotik mampu memecah molekul
lingkungan. Hal ini dikarenakan kompleks pakan ampas tahu menjadi
Lactobacillus bulgaricus mampu molekul yang sederhana sehingga mudah
menghasilkan senyawa metabolit sekunder dicerna oleh usus cacing tanah. Dengan
sehingga kemungkinan adanya bakteri demikian, pakan ampas tahu selain sebagai
pathogen lain menjadi sedikit. Selain itu, limbah juga sebagai sumber protein dan
pakan ampas tahu yang dicampur probiotik dapat dimanfaatkan sebagai pakan cacing
Lactobacillus bulgaricus lebih cepat habis tanah yang berkualitas dengan tambahan
dimakan cacing tanah dibandingkan probiotik Lactobacillus bulgaricu
350
300 Cacing tanah
250 dengan pakan
200 ampas tahu
150
100 Cacing tanah
50 dengan pakan
ampas
0
0 16 0 16 tahu+probiotik
Hari ke-
Gambar 6. Grafik kenaikan berat cacing tanah setelah diberikan pakan ampas tahu yang
dicampur dengan probiotik Lactobacillus bulgaricus
32,13%
35%
%Kenaikan berat
30%
25%
14%
20%
15%
10%
5%
0%
pakan ampas tahu pakan ampas
tahu+probiotik
Daftar Pustaka
Bradford, M., M., 1976. A rapid and FAO/WHO. 2001. Joint FAO/WHO
sensitive method for quantitation of Expert Consultation on Evaluation of
protein utilization. The principle of Health and Nutritional Properties of
protein-dye binding. Anal. Biochem. Probiotics in Food Including Powder
72, 248-254 Milk with Live Lactic Acid Bacteria.
Bergman, M., 1942. A classification of Amerian Córdoba Park Hotel,
proteolytic enzymes. Adv. Enzimol Córdoba, Argentina
Effendi, I. 2002. Probiotics for Marine Kompiang, I., P., 2009. Pemanfaatan
Organism Disease Protection. Mikroorganisme sebagai Probiotik
Pekanbaru: Fakultas Perikanan dan untuk Meningkatkan Produksi Ternak
Ilmu Kelautan Universitas Riau. Unggas di Indonesia. Pengembangan
Enggel, J., Meriandini, A. and Natalia, L., Inovasi Pertanian : Bogor. Hal 188
2004. Karakterisasi Protease Waluyo, 2004, Mikrobiologi Umum.
Ekstraseluler Clostridiun bifermentans Universitas Muhammadiyah Press,
R14-1-b. Jurnal Mikrobiologi Malang
Indonesia, 9, 9 - 12.