Anda di halaman 1dari 23

PERCOBAAN 1

LARUTAN BUFFER

Dasar Teori
Buffer merupakan media yang sangat penting dalam berbagai percobaan biokimia.
Semua reaksi biokimia, terutama yang melibatkan enzim membutuhkan pH yang sangat
tertentu. Bila pH berubah sedikit saja maka reaksi akan terhenti atau menghasilkan produk
yang tidak diharapkan. Di dalam sel, jaringan atau organ, pH bervariasi dari suatu bagian kecil
ke bagian lainnya di dalam sel ataupun di dalam organel.
Kemampuan suatu larutan untuk mempertahankan pH disebabkan oleh campuran asam
lemah, seperti asam asetat dengan garamnya (garam natrium asetat), maka larutan tersebut
akan mengandung asam lemah (HA) dan basa konyugate (A-). Larutan ini kemudian disebut
larutan buffer. Bila ke dalam larutan buffer ditambahkan asam (H +), maka asam itu akan
dinetralkan oleh basa konyugatnya (A-).
H+ + A- HA
Bila basa (OH-) ditambahkan ke larutan bufer, maka basa tersebut akan dinetralkan oleh asam
lemah (AH).
OH- + HA A- + H2 O
Jadi, dalam kedua kasus penambahan di atas tidak terjadi penambahan konsentrasi H+ maupun
OH-. Akibatnya, pH larutan-pun tidak berubah.
Larutan buffer yang paling efektif adalah larutan yang mengandung asam (HA) dan
basa konyugate (A-) dalam konsentrasi yang sama. Secara umum, efektif pH berada diantara
pKa  1 unit pH.
Banyaknya senyawaan yang dibutuhkan untuk pembuatan larutan buffer dengan suatu
pH dan kekuatan ion tertentu dapat dihitung berdasarkan pada persamaan Henderson-
Hasselbalch:
[A  ]
pH  pKa  log
[HA]
Namun demikian, dalam praktek biokimia, hal ini dapat dilakukan dengan membuat
larutan stok dengan molaritas tertentu kemudian mencampurkannya sambil mengawasi

Penuntun Praktikum 2016 1


perubahan pH-nya dengan pH meter. Bila pH yang dikehendaki telah dicapai maka
penambahan salah satu larutan dapat dihentikan.

pH Meter
Pengukuran pH suatu larutan pada dasarnya adalah pengukuran perbedaan potensial
dari dua elektroda yang dimasukkan ke dalam larutan. Perbedaan potensial ini senantiasa
dipengaruhi oleh temperatur, sehingga pH juga dipengaruhi oleh temperatur.
Pada pH meter modern, kedua elektroda sudah digabungkan menjadi satu unit
(batang). Perhatian harus diberikan kepada larutan KCl pada bagian atas batangan tersebut
(elektroda referensi). Larutan tersebut harus ditambahkan bila sudah berkurang.
Elektroda harus selalu dibilas dengan air sesudah dan sebelum digunakan. Bila tidak
digunakan, elektroda harus dimasukkan ke dalam larutan buffer (pH netral). Bila digunakan
untuk mengukur cairan yang mengandung protein atau pati yang tinggi, maka pencucian
dengan air hangat akan mempermudah pembersihan.
Pengukuran pH dimulai dengan menghidupkan peralatan pH meter. Setelah elektroda
dibersihkan dengan menyemprotkan air destilasi, elektroda tersebut dapat dikeringkan dengan
kertas tissue. Selanjutnya pH meter harus dikalibrasi dengan larutan buffer standar sebelum
digunakan. Setelah elektroda dibenamkan ke dalam larutan maka larutan harus digerakkan
dengan batangan magnet dan stirer atau dengan mengaduk larutan dengan elektroda secara
teratur di dalam bejana. Setelah nilai pH sudah stabil pada pH meter, nilai pH dapat dicatat.

Tujuan Percobaan
1. Membuat larutan buffer asetat.
2. Mempelajari daya sanggah larutan buffer.

Prosedur Percobaan
Bahan dan Alat
Asam asetat (CH3COOH) 0,02 M; natrium asetat (CH3COONa) 0,02 M; asam klorida
(HCl) 0,1 M; narium hidroksida (NaOH) 0,1 M; aquades, pH-meter, gelas piala 100 mL dan
250 mL, labu takar 500 mL, tisue dan botol semprot.

Penuntun Praktikum 2016 2


Pembuatan Larutan Buffer
1. Buatlah masing-masing larutan 0,02 M asam asetat (CH3COOH) sebanyak 0,5 L dan
larutan 0,02 M natrium asetat (CH3COONa) sebanyak 0,5 L. Hitunglah dahulu berapa
banyak asam asetat (gram) dan natrium asetat (gram) yang dibutuhkan untuk membuat
masing-masing 0,5 L.
2. Dengan menggunakan persamaan Handerson-Hasselbalch, hitunglah berapa banyak
(mL) masing-masing larutan 0,02 M asam asetat dan 0,02 M natrium asetat yang
dibutuhkan untuk membuat 100 mL larutan buffer dengan pH: 3,5; 4,0; 4,5; dan 5,5.
3. Campurkan masing-masing larutan asam asetat dan natrium asetat sesuai perhitungan di
atas. Ukurlah pH larutan! Apakah sama dengan pH yang diharapkan? Bila tidak,
mengapa? Bacalah berbagai teori pH dan larutan buffer.

Daya Sanggah Larutan Buffer


a. Tuanglah ke dalam dua gelas piala (100 mL) masing-masing dengan 50 mL aquades dan
50 mL larutan buffer (pilih salah satu dari ke-4 larutan buffer yang sudah anda buat).
b. Ukurlah pH dari masing-masing larutan.
c. Tambahkanlah 10 mL larutan 0,1 M asam klorida (HCl) pada masing-masing gelas.
d. Ukur kembali pH masing-masing larutan.
e. Berapa selisih perubahan pH. Mengapa? (pKa asam asetat = 4,76).

Lakukan juga hal yang sama untuk no. a sampai e, dengan perbedaan pada no. c, yakni
tambahkan 10 mL larutan 0,1 M natrium hidroksida (NaOH).

Penuntun Praktikum 2016 3


Hasil Pengamatan
Percobaan 1. LARUTAN BUFFER

Pembuatan Larutan Buffer


100 mL Buffer pH Volume Larutan (mL) pH Hasil Pembacaan
CH3COOH CH3COONa pH-meter
3,5

4,0

4,5

5,5

Daya Sanggah Larutan Buffer


 Penambahan Asam
Larutan pH Awal pH Setelah  pH
Penambahan HCl
Buffer pH ……

Aquades

 Penambahan Basa
Larutan pH Awal pH Setelah  pH
Penambahan NaOH
Buffer pH ……

Aquades

Penuntun Praktikum 2016 4


PERCOBAAN 2
ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN

Dasar Teori
Protein adalah salah satu kelompok biomolekul di dalam sel yang mengatur sebagian
besar reaksi biokimia yang menyebabkan sel tersebut hidup. Diperkirakan ada lebih dari
30.000 jenis protein yang dapat dihasilkan oleh gen dalam tubuh manusia dan setiap protein
dapat kemudian diubah melalui “postranslation” menjadi beberapa jenis protein yang baru
dengan struktur molekul yang berbeda dan tugas biokimia yang berbeda.
Dari sekian banyak protein yang diduga disintesis dalam tubuh manusia, baru beberapa
yang diketahui struktur molekulnya serta rincian fungsi molekul protein tersebut. Pengetahuan
tentang struktur molekul serta rincian mekanisme fungsinya, sangat penting untuk dapat
memanipulasi serta mengeksploitasi fungsi setiap protein untuk kehidupan manusia secara
menyeluruh.
Masalah utama yang dihadapi dalam mempelajari protein dari mahluk hidup adalah
bagaimana mendapatkan protein dalam keadaan utuh dan dalam keadaan murni. Banyak
protein hanya disintesa pada waktu tertentu dalam kehidupan sel atau mahluk hidup dan
dalam jumlah yang sangat sedikit. Selanjutnya, banyak protein disintesa dan hanya terdapat
pada bagian tertentu dalam sel di jaringan tertentu. Diduga bahwa beberapa protein hanya
disintesa dalam jumlah beberapa molekul saja di dalam sel di bandingkan dengan protein atau
biomolekul yang lain yang disintesa dalam jumlah ribuan bahkan jutaan.
Langkah-langkah yang biasanya ditempuh untuk pemurnian protein adalah sebagai
berikut :
1. Mengembangkan suatu assay untuk protein yang diinginkan
2. Menentukan sel atau jaringan/organ sumber protein
3. Mengisolasi sel atau jaringan tersebut dengan sentrifugasi
4. Melepaskan protein dari sumber tersebut dan melarutkannya dalam cairan buffer
5. Mengisolasi seluruh atau sebagian protein dengan “salting out”.

Penuntun Praktikum 2016 5


6. Memurnikan protein dengan salah satu teknik atau kombinasi teknik pemurnian seperti
ion exchange, adsorption, size exclusion dan affinity chromatography dan isoelectric
focussing.
Protein adalah biomolekul yang sangat peka terhadap berbagai faktor yang dapat
merubah struktur molekul dan fungsinya. Untuk itu, isolasi protein dari dalam sel harus
dilakukan sedemikian rupa tanpa merubah struktur dan fungsinya. Untuk menghancurkan sel
tumbuhan dan hewan yang relatif mudah dihancurkan, umumnya dapat menggunakan osmotik
lisis, homogenizer dan ultrasonik. Untuk sel bakteri yang relatif kuat maka dapat digunakan
mortar dengan pasir khusus atau dengan enzim lisozim yaitu enzim yang dapat menghancurkan
karbohidrat pada dinding sel.
Protein yang akan diisolasi dari dalam sel harus langsung “dilarutkan” di dalam cairan
yang mampu mempertahankan struktur alami 3-D protein (tiga dimensi) tersebut. Oleh karena
struktur alami 3-D protein banyak ditopang oleh ikatan kimia yang lemah, maka pH dan “ionic
strength” dari cairan di atas haruslah diatur. Cairan buffer biasanya digunakan untuk
keperluan ini. Setiap protein menghendaki pH dan “ionic strength” tertentu.
Setiap sel mengandung protease yaitu enzim yang dapat menghidrolisa protein. Dalam
banyak hal, protease ini tidak dikehendaki selama isolasi dan pemurnian protein. Oleh karena
itu, protease harus dinonaktifkan. Hal ini biasanya dengan menambahkan senyawaan
antiprotease ke dalam cairan buffer.

Pemurnian Protein
Langkah pertama dalam pemurnian protein tertentu kebanyakan dilakukan dengan
teknik pengendapan. Teknik ini terutama ditujukan untuk memisahkan protein dari senyawaan
bukan protein yang terlarut. Protein dapat diendapkan dengan penambahan garam (salting
out), pengaturan pH, pengaturan suhu dan penambahan pelarut organik seperti alkohol atau
aseton. Beberapa jenis protein tidak dapat diendapkan dengan garam, bahkan penambahan
garam akan mempertinggi kelarutannya (salting in). Sifat protein yang seperti ini dapat juga
digunakan untuk pemurnian protein tersebut. Sentrifugasi banyak digunakan untuk
mempercepat pengendapan protein.
Protein dapat juga dipisahkan dari protein lainnya dengan menggunakan filter atau
membran dengan ukuran pori-pori yang sangat kecil. Proses ini dinamakan ultrafiltrasi.

Penuntun Praktikum 2016 6


Protein dapat dipisahkan dari larutan senyawaan bukan protein yang digunakan untuk
pemurnian sebelumnya (seperti garam pada “salting out”) atau digunakan untuk memisahkan
protein berdasarkan pada ukuran molekulnya.
Pemurnian lebih lanjut dilakukan dengan teknik kromatografi. “Ion exchange “, “size
exclusion”, dan “affinity chromatography” adalah teknik yang banyak digunakan.
Selanjutnya, untuk menentukan apakah protein sudah dalam keadaan murni, maka
teknik elektroforesis dapat digunakan. Dengan menggunakan SDS-PAGE (sodium
dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) dapat dilihat apakah protein yang telah
dimurnikan hanya terdiri dari satu rantai polipeptida atau tidak.

Protein Dalam Susu


Protein susu disintesa di endoplasmik reticulum dalam sel-sel yang menyusun
secretory glands yang kemudian diangkut dengan golgi apparatus ke sitoplasma untuk
dicampur dengan lemak. Selanjutnya cairan ini dikeluarkan dari dalam sel dan disimpan dalam
jaringan penyimpan untuk selanjutnya dikeluarkan dari tubuh hewan sebagai susu. Protein
susu terdiri dari berbagai jenis protein. Protein utama dalam susu sapi disintesa dari enam gen
yang menghasilkan s1-casein, s2-casein, -casein, -casein, -lactoglobulin dan -
lactoglobulin. Protein susu dapat dibedakan atas kasein dan serum (whey) protein. Kasein
merupakan bagian terbesar (80%) dari protein susu. Kasein mudah diendapkan karena
membentuk kompleks dengan kalsium-fosfat dan dapat dipercepat dengan penambahan garam
(salting out). Whey protein terutama terdiri dari -lactoglobulin dan -lactalbumin. -
Lactoglobulin tidak larut dalam cairan asam (pH<4,0), tetapi larut dalam cairan pH>6,0.

Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan mengisolasi dan memurnikan -lactoglobulin dari susu bubuk
komersial.

Prosedur Percobaan
Bahan dan Alat
Susu bubuk full cream komersial, aquades, amonium sulfat, HCl 1,0 M; NaOH 1,0 M,
kain kasa, gelas piala 100 mL, pH-meter, tabung sentrifusa dan sentrifusa.
Penuntun Praktikum 2016 7
Isolasi dan Pemurnian -Lactoglobulin Susu
1. Timbanglah 7,5 gram susu bubuk full cream dan larutkan menjadi 50 mL dengan air
hangat (40oC) di dalam 100 mL gelas piala.
2. Tambahkan perlahan-lahan sambil diaduk 10 gram garam amonium sulfat.
3. Biarkan selama beberapa menit sampai terjadi pengendapan.
4. Saring cairan tersebut dengan kain kasa.
5. Tuangkan filtrat ke dalam gelas piala (100 mL) dan teteskan 1,0 M HCl secara perlahan-
lahan sampai pH menjadi 3,0 ( 0,1).
6. Pindahkanlah cairan tersebut ke dalam 4 buah tabung sentrifugasi dengan volume yang
sama untuk masing-masing tabung.
7. Sentrifugasi sampai presipitat mengendap di dasar tabung ( 15 menit).
8. Buanglah supernatan secara perlahan-lahan.
9. Larutkan kembali presipitat dalam 5 mL air dan kumpulkan ke dalam satu tabung
sentrifugasi yang bersih, kemudian naikkan pH sampai 8,5-9,0 dengan meneteskan
secara perlahan-lahan 1,0 M NaOH sambil menggoyang-goyangkan tabung tersebut.
10. Sentrifugasi kembali cairan tersebut dan tuangkan dengan hati-hati “supernatant” ke
dalam gelas piala (50 mL).
11. -Lactalbumin yang relatif murni terdapat di dalam supernatan di atas.

Pertanyaan :
1. Bacalah hand out (Whey Protein) yang dapat dikopy dari laboran. Teknik purifikasi
mana lagi yang dapat dilakukan?
2. Bagaimana cara untuk menentukan bahwa -lactalbumin yang dimurnikan di atas telah
benar-benar murni?

Penuntun Praktikum 2016 8


Hasil Pengamatan
Percobaan 2. ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN

Penuntun Praktikum 2016 9


Percobaan 3
ENZIM PENCERNA KARBOHIDRAT

Dasar Teori
Karbohidrat berperan penting dalam proses metabolisme hewan (juga manusia) dan
tumbuhan. Kelebihan karbohidrat dalam tubuh dapat disimpan sebagai cadangan makanan.
Zat-zat simpanan ini berbentuk polisakarida, seperti pati dan glikogen. Polisakarida memiliki
sifat fisik dan kimia yang berbeda dengan sakarida-sakarida sederhana.
Pati adalah campuran dua polisakarida, yaitu amilosa dan amilopektin. Amilosa
terangkai dari D-glukosa dengan ikatan –1,4-glikosidik sehingga tidak bercabang.
Sedangkan amilopektin yang merupakan bagian terbesar (70-90%) dari pati, terdiri dari ikatan
-1,4-glikosidik dan -1,6-glikosidik, sehingga bentuknya bercabang-cabang. Glikogen
strukturnya mirip amilopektin, mengandung satu unit terminal glukosa untuk setiap 10-12 unit
glukosa, sedangkan amilopektin mengandung satu untuk setiap 25 unit. Glikogen, amilosa
dan amilopektin dapat dihidrolisis dengan asam-asam mineral atau enzim-enzim seperti
amilase, glikosidase, dan glikogen fosforilase.
Air liur atau saliva disekresikan oleh tiga pasang kelenjar air liur yaitu kelenjar parotis
dibawah telinga, kelenjar submaksilaris di bawah rahang bawah, dan kelenjar sublingual di
bawah lidah. Cairan ini terdiri dari kira-kira 99,5% air dan 0,5% benda padat. Dua pertiga
benda padat terdiri dari bahan organik terutama, ptialin dan musin. Benda padat lainnya ialah
ion-ion anorganik seperti SO42-, PO43-, HCO3-, Cl-, Ca2+, Na+ dan K+. Musin dalam air liur
berfungsi sebagai pelicin rongga mulut dan membasahi makanan sewaktu makanan dikunya
sehingga mudah ditelan. Ptialin ialah nama lain dari amilase saliva yang akan menghidrolisis
pati menjadi dekstrin-dekstrin dan maltosa. Amilase saliva ini tidak aktif pada pH 4 atau lebih
rendah lagi. Air liur biasanya ber-pH sekitar 6,8.
-Amilase saliva hanya mengkatalisa hidrolisis ikatan -1,4-glikosidik, baik yang
terdapat dalam molekul glikogen maupun pati. Hal ini dibuktikan dengan hanya didapatkan
20-30% hasil hidrolisis yang bergugus reduksi pada aktivitas total enzim, karena masih
terdapatnya fragmen-fragmen seperti dekstrin yang berikatan -1,6-glikosidik.

Penuntun Praktikum 2016 10


Tujuan Percobaan
1. Menghidrolisis pati dengan amilase air liur.
2. Mempelajari pengaruh pH pada aktivitas amilase air liur.

Prosedur Percobaan
Bahan dan Alat
Air liur, larutan pati 1%, pereaksi iodium, pereaksi Benedict, HCl 0,1 M, asam asetat
0,1%, aquades, Na2CO3 0,1%, papan uji, kain kasa, tabung reaksi dan erlenmeyer 250 mL.

Hidrolisis Pati oleh Amilase Air Liur


Untuk mendapatkan saliva yang banyak, mula-mula kumur dahulu, lalu letakkan
setetes larutan asam cuka encer (asam asetat encer) pada lidah. Kumpulkan saliva ke dalam
erlenmeyer melalui corong yang dilapisi kain kasa.
1. Siapkan papan uji (dapat menggunakan papan pencampur cat air untuk menggambar)
dan tetesi setiap lekukan dengan satu tetes pereaksi iodium.
2. Masukkan 15 mL larutan pati 1% dalam erlenmeyer 250 mL dan tambahkan ke
dalamnya 2 mL saliva. Segeralah kocok baik-baik sampai homogen.
3. Setiap selang waktu 0,5 menit pindahkan satu tetes larutan pati 1% + saliva ke papan uji.
Catat pada menit keberapa timbulnya warna biru, warna kecoklat-coklatan, dan kapan
tidak memperlihatkan perubahan warna lagi. Perhatikan: pereaksi iodium sendiri
berwarna kecoklat-coklatan. Saat pereaksi iodium tidak lagi positif disebut titik
akhromatik.
4. Selama no.3 dikerjakan, jangan lupa untuk memperhatikan perubahan kekentalan larutan
pati 1% + saliva. Apakah terlihat sebelum atau setelah reaksi positif iodium berhenti?

Pengaruh pH pada Aktivitas Amilase Air Liur


1. Sediakan 4 tabung reaksi dan masing-masing diisi dengan: a) 2 mL HCl 0,1 M; b) 2 mL
asam asetat 0,1%; c) 2 mL aquades dan d) 2 mL Na-karbonat (Na2CO3) 0,1 %. Masing-
masing pH dari setiap tabung ialah 1, 5, 7, dan 9.
2. Tambahkan pada setiap tabung 2 mL larutan pati 1% diikuti 2 mL air liur. Kocok
dengan air dan biarkan selama 15 menit.
Penuntun Praktikum 2016 11
3. Larutan dalam setiap tabung (a, b, c, d) dibagi menjadi dua bagian, bagian pertama uji
dengan pereaksi iodium. Caranya: tambahkan larutan dengan 1 mL pereaksi iodium.
Bagian ke-2 uji dengan pereaksi Benedict. Caranya: tambahkan 3 mL pereaksi
Benedict ke dalam tabung, aduk rata, dan masukkan ke dalam penangas air mendidih
selama 5 menit. Setelah dingin, amati warna dan endapan yang terbentuk. Bandingkan
ke-2 uji tersebut (uji iodium dan Benedict) dan terangkan hasil percobaan anda!

Penuntun Praktikum 2016 12


Hasil Pengamatan
Percobaan 3. ENZIM PENCERNA KARBOHIDRAT

Hidrolisis Pati dengan Amilase air Liur


Menit ke- Warna yang Timbul pada Uji dengan Iodium Perubahan Kekentalan
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0

Pengaruh pH pada Aktivitas Air Liur


Larutan pati 1% + saliva pH Warna Hasil Uji Pereaksi
Iodium Benedict
HCl 0,1 M 1
CH3COOH 0,1% 5
Aquades 7
Na2CO3 0,1% 9

Penuntun Praktikum 2016 13


Percobaan 4
LIPIDA

Dasar Teori
Istilah lipid digunakan untuk suatu kelompok bahan yang mempunyai sifat tidak larut
dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik seperti kloroform, dietileter, petroleum eter,
benzena, dan karbon tetraklorida. Umumnya, setiap bagian tumbuhan dan hewan jika
diekstraksi dengan pelarut organik dapat menghasilkan ekstrak yang bersifat lipid. Ekstrak
tersebut berupa campuran berbagai lipid, yang susunanya tergantung tipe jaringan yang
diambil.
Lipid sederhana mengacu kepada lipid yang tersusun oleh tiga molekul asam lemak
yang berikatan ester dengan gliserol. Lipid tersebut dibedakan atas lemak dan minyak.
Lemak adalah lipid yang berwujud padat pada suhu ruang dan banyak terkandung dalam
lemak hewani (sumber dari hewan), sebaliknya minyak berwujud cair pada suhu ruang dan
banyak terkandung dalam minyak nabati (sumber dari tanaman).
Lemak/minyak bila dicampur dan dikocok dalam air tidak akan melarut. Tapi, jika ke
dalamnya ditambahkan sabun, detergen atau empedu, maka akan terbentuk emulsi air dan
lemak/minyak. Zat-zat tersebut dikenal sebagai emulgator, yang bekerja dengan cara
menurunkan tegangan permukaan. Teknik pembentukan emulsi ini mempunyai peranan
penting dalam industri obat-obatan dan dalam proses pencernaan lemak/minyak di usus.
Beberapa reaksi dapat dilakukan untuk menentukan sifat fisika-kimia dari asam lemak
sebagai komponen penyusun lipid. Reaksi yang dapat dilakukan diantaranya uji kelarutan dan
penentuan bilangan penyabunan lemak/minyak. Bilangan penyabunan diperoleh melalui
reaksi penyabunan (saponifikasi) dengan cara mereaksikan lemak/minyak dengan suatu alkali
menghasilkan gliserol dan garam dari asam lemak (sabun). Bilangan penyabunan
didefinisikan sebagai jumlah miligram KOH yang diperlukan untuk menetralisir asam lemak
bebas atau terikat pada 1 gram lemak.

Penuntun Praktikum 2016 14


Tujuan Percobaan
1. Menguji kelarutan lemak dan minyak pada berbagai jenis pelarut.
2. Menguji sistem emulsi lemak/minyak dalam air dan larutan Na2CO3.
3. Menentukan bilangan penyabunan suatu lemak/minyak.

Prosedur Percobaan
Uji Kelarutan
Derajat kelarutan lemak/minyak dapat dilihat atau ditentukan dengan pengamatan
secara langsung pada bahan pelarut yang dipakai.
Bahan dan Alat
Minyak kelapa, lemak hewan, mentega, margarin, eter, alkali, kloroform, alkohol
panas, asam encer dan tabung reaksi.
Cara Kerja:
Masukkan 3 mL pereaksi ke dalam tabung reaksi yang bersih. Bubuhkan sedikit bahan
percobaan ke dalam tabung yang sudah berisi pelarut. Kocok isi tabung kuat-kuat dan amati
kelarutannya.

Emulsi
Minyak/lemak tidak dapat larut dalam air tetapi dapat membentuk emulsi yang stabil
bila ada bahan lain yang dapat berfungsi sebagai emulgator.
Bahan dan Alat
Minyak kelapa, lemak hewan, mentega, margarin, aquades, Na2CO3 1,0% dan tabung
reaksi, indikator kertas lakmus.
Cara Kerja:
A. Masukkan kira-kira 5 mL air ke dalam tabung reaksi yang bersih. Bubuhkan 3 tetes
bahan percobaan pada tabung reaksi berisi air. Kocok kuat-kuat selama 1-2 menit.
Amati dan catat hasilnya.
B. Masukkan 5 mL air ke dalam tabung reaksi yang bersih. Bubuhkan 2-3 tetes larutan
Na2CO3 1,0%. Kocok dan periksa dengan indikator hingga larutan bersifat basa. Bubuh
3 tetes bahan percobaan ke dalamnya dan kocok kuat-kuat selama 1-2 menit. Amati dan
catat hasilnya.
Penuntun Praktikum 2016 15
Penentuan Bilangan Penyabunan
Bahan dan Alat
Lemak atau minyak, aquades, KOH 0,1 M; HCl 0,5 M, indikator fenolftalein,
erlenmeyer 250 mL, tabung reaksi, biuret 50 mL, neraca, hot plate, statip dan klem.
Cara Kerja:
1. Dalam erlenmeyer 250 mL yang bersih masukkan 2,5 g bahan percobaan
(lemak/minyak) dan 25 mL KOH 0,1 M. Buatlah juga blankonya (pengerjaan yang sama
dari awal, tetapi tanpa menggunakan bahan percobaan). Baik bahan percobaan maupun
blanko dibuat duplo (2 kali ulangan).
2. Refluks di atas api kecil sampai penyabunan sempurna (kira-kira 30 menit). Untuk
mengetahui apakah proses penyabunan telah selesai/sempurna, teteskan hasil refulks
dalam tabung reaksi bersisi air. Bila bening berarti proses penyabunan telah selesai.
3. Setelah didinginkan, hasil refluks ditambah 2 tetes indikator fenolftalein dan dititrasi
dengan larutan HCl 0,5 M.
4. Hitunglah bilangan penyabunan.

Penentuan Bilangan Peroksida


1. Minyak sebanyak 5 g ditimbang dalam erlenmeyer 250 mL dan ditambahkan 30 mL
campuran pelarut yang terdiri dari 60 % CH3COOH dan 40 % CHCl3, lalu dikocok.
2. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan 0,5 mL larutan KI jenuh sambil dikocok dan
dibiarkan dalam ruangan gelap selama 2 menit.
3. Larutan ditambahkan 30 mL aquades dan 3 tetes indikator kanji lalu dititrasi dengan
Na2S2O3 0,01 M. Proses yang sama dilakukan juga terhadap blanko. Perhitunganya:
mL Na 2 S 2 O 3 x M Na 2 S 2 O 3 x 1000
Bilangan peroksida =
Berat sampel (g)

Penuntun Praktikum 2016 16


Penetuan Bilangan Asam
1. Minyak sebanyak 20 g ditimbang dalam erlenmeyer dan ditambahkan 50 mL etanol
95%.
2. Campuran kemudian dipanaskan selama 10 menit dalam pemanas air sambil diaduk,
kemudian ditambahkan 3 tetes indikator pp dan dititrasi dengan KOH 0,1 M.
Perhitungannya:
mL KOH x M KOH x 56,1
Bilangan asam  x 100%
berat sampel (g)

Penuntun Praktikum 2016 17


Hasil Pengamatan
Percobaan 4. L I P I D A

Uji Kelarutan

Bahan Percobaan Eter Kloroform Alkohol panas Asam encer Alkali

Minyak kelapa

Lemak hewan

Mentega

Margarin

Keterangan: (+) = larut (-) = tidak larut

Emulsi

Bahan Percobaan Emulsi A Emulsi B

Minyak kelapa

Lemak hewan

Mentega

Margarin

Keterangan: () = membentuk emulsi (-) = tidak membentuk emulsi

Penuntun Praktikum 2016 18


Penentuan Bilangan Penyabunan
Titrasi dengan HCl 0,5 M
Blanko Bahan Percobaan
Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 1 Ulangan 2
Meniskus akhir

Meniskus awal

Volume HCl

Rataan Vb = Rataan Vi =

Diketahui: berat bahan percobaan : ………………. gram


konsentrasi HCl : 0,5 M
volume HCl untuk blanko (Vb) : ………………. mL
volume HCl untuk bahan percobaan (Vi) : ………………. mL
massa molekul KOH : 56 g/mol

(V  V ) x M x MM KOH
Bilangan penyabunan  b i HCl
berat bahan percobaan

Penentuan Bilangan Peroksida


 Konsentrasi Na2S2O3 = ..................................
 Volume Na2S2O3 = .................................. mL
 Berat sampel = .............................. gram

mL Na 2 S 2 O 3 x M Na 2 S 2 O 3 x 1000
Bilangan peroksida =
Berat sampel (g)

Penuntun Praktikum 2016 19


Penentuan Bilangan Asam
 Konsentrasi KOH = ..................................
 Volume KOH = .................................. mL
 Berat sampel = .............................. gram

mL KOH x M KOH x 56,1


Bilangan asam  x 100%
berat sampel (g)

Penuntun Praktikum 2016 20


PERCOBAAN 5
ELEKTROFORESIS

Dasar Teori
Elektroforesis merupakan teknik yang banyak digunakan dalam penelitian biokimia.
Elektroforesis digunakan untuk pemisahan serta karakterisasi protein dan nukleotida
berdasarkan pada muatan dan ukuran molekulnya.
Pada prinsipnya, cara ini didasarkan pada kenyataan bahwa banyak senyawaan
mempunyai muatan yang khusus bagi senyawaan tersebut. Protein dan polinukleotida
merupakan molekul yang berukuran besar dan bermuatan sehingga ideal untuk elektroforesis.
Dengan menciptakan medan listrik, setiap molekul akan bergerak dari satu ke lain kutup
sesuai dengan total muatan bersihnya.
Ada beberapa teknik dalam elektroforesis. Dari segi medianya, maka elektroforesis
dapat dibedakan atas elektroforesis kertas dan gel. Pada saat ini, gel elektroforesis merupakan
cara yang banyak digunakan. Gel dapat dibuat dari acrylamida, pati atau agarose. Acrylamida
banyak digunakan untuk penelitian protein karena mempunyai pori-pori yang cukup kecil
untuk dilewati oleh protein.
Dari segi cara pemisahan protein, maka gel elektroforesis dapat dibedakan atas native
gel, SDS-gel dan isoelektrik fokusing gel. Pada native gel, pemisahan didasarkan pada
muatan protein dan ukuran molekulnya. Pada SDS-gel, pemisahan didasarkan pada ukuran
protein saja, sedangkan pada isoelektrik fokusing didasarkan pada pI dari protein.
SDS-Gel banyak digunakan untuk mengetahui kemurnian dan massa molekul relatif
(Mr) dari protein. Dalam teknik ini, buffer yang digunakan dicampur dengan SDS (sodium
dodecylsulfate) sebagai detergen untuk mendenaturasi protein dan menetralkan ionic group
dari protein. Dengan demikian protein akan menjadi rantai lurus yang dibungkus dengan ion
sulfat.

Tujuan Percobaan
1. Menentukan Mr protein dengan menggunakan metode animasi elektroforesis.
2. Mempelajari cara penentuan konsentrasi protein berdasarkan metode spektrofotometri.

Penuntun Praktikum 2016 21


Prosedur Percobaan
Bahan dan Alat
Sampel protein, coomassie briliant blue, bovin serum albumin (BSA), komputer,
program animasi elektroforesis, dan spektrofotometer.

Pengukuran Massa Molekul Relatif (Mr) dari Protein


1. Ikuti animasi proses elektroforesis di layar komputer.
2. Setiap kelompok mendapatkan fotokopi dari gel yang difoto.
3. Hitunglah Mr dari setiap protein dalam protein standar.
4. Ukurlah jarak yang ditempuh oleh setiap protein dan jarak yang ditempuh oleh
bromphenol blue.
5. Hitunglah Rf yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh protein dengan jarak yang
ditempuh oleh pewarna.
6. Plot Rf dari protein standard dengan log Mr-nya masing-masing.
7. Hitunglah Rf dari protein sampel.
8. Dari grafik di atas, Mr protein dapat dihitung sebagai antilog.

Penentuan Jumlah/Konsentrasi Protein


1. Sampel (sekitar 100 L) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Bila konsentrasi protein
sangat tinggi, maka protein harus diencerkan terlebih dahulu. Sebaliknya, bila terlalu
rendah, protein perlu dikonsentrasikan misalnya dengan ultrafiltrasi.
2. Ke dalam tabung ditambahkan cairan pewarna yang mengandung coomassie briliant
blue.
3. Diaduk, kemudian didiamkan selama kurang lebih 5 menit.
4. Cairan dipindahkan ke dalam kuvet dan diamati dengan spektrofotometer.
5. Sebagai blanko, cairan sampel (tidak mengandung protein) digunakan.
6. Untuk standard, gunakan cairan bovin serum albumin (BSA) dalam sedikitnya 6
pengenceran.

Penuntun Praktikum 2016 22


Hasil Pengamatan
Percobaan 5. ELEKTROFORESIS

Pengukuran Massa Molekul Relatif (Mr) Protein


Protein Mr Jarak Tempuh Rf
Standar Protein Bromphenol blue

 Rf protein sampel =

 Mr protein sampel =

Penentuan Jumlah/Konsentrasi Protein

Penuntun Praktikum 2016 23