PANDUAN PRAKTIKUM ISOLASI DNA

MAHASISWA FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI

DEPARTEMEN BIOKIMA
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

PROTOKOL ISOLASI ”GENOMIC DNA” DARI ”WHOLE BLOOD”

1. Tabung microcentrifuge 1,5 μl steril (pertama) diisi dengan zat anti coagulan (EDTA,
Heparin atau Citrat) dan masukan 1 μl darah (whole Blood) kedalamnya.
2. Tabung microcentrifuge tersebut digoyangkan perlahan-lahan agar darah dan zat
anticoagulan nya bercampur dengan baik.
3. Dengan menggunakan micropipette, kedalam tabung microcentrifuge steril yang lain
(kedua) diisikan sebanyak 900 μl ”Cell Lysis Solution”.
4. Pipetkan 300 μl darah dari tabung microcentrifuge pertama, masukan kedalam tabung
kedua yang berisi ”cell lysis solution”. Tabung dibolak-balikan 5-6 kali supaya larutannya
bercampur.
5. Tabung tersbut diinkubasikan selama 10 menit pada temperatur ruang dan tabung dibolak-
balikan 2-3 kali selama masa inkubasi agar lysis sel darah merah berlangsung lebih baik.
6. Tabung microcentrifuge tersebut dicentrifugasi pada 13.000 rpm (13.000-16.000 x g)
selama 20 detik pada temperatur ruang.
7. Supernatant dibuang sebanyak mungkin tanpa mengganggu pellet putih yang tampak.
Lebih kurang 10-20 μl cairan akan tertinggal dalam tabung tersebut.
8. Tabung di-vortex dengan kuat, sebentar (10-15 detik) agar endapan sel-sel darah putih
tersuspensi kembali.
9. Sebanya 300 μl ”Nuclei Lysis Solution” ditambahkan kedalam suspensi diatas. Larutan
dibuat bercampur dengan cara di-pipetkan berulang-ulang sampai 5-6 kali untuk me-lysis
sel-sel darah putih. Solution akan menjadi ”viscous”.
10. Jika terlihat gumpalan, maka inkubasikan tabung pada 37oC sampai gumpalan tersebut
larut. Tabung didinginkan pada temperatur ruangan. Setelah dingin barulah ditambahkan
kedalam ”Nuclear Lysate” ini 100 μl ”Protein Precipitation Solution”.
11. Optional : tambahkan larutan RNA-ase 1,5 μl kedalam ”Nuclear Lysate” dan bolak
balikan tabung 2-5 kali untuk mencampurkannya. Inkubasikan pada 37oC selama 15 menit
dan kemudian dinginkan pada temperatur ruanagan.
12. Ditambahkan sebanyak 100 μl ”Protein Precipitation Solution” kedalam larutan ”Nuclear
Lysate” dan tabung divortex dengan kuat selama 10-20 detik. Gumpalan protein yang kecil
mungkin akan terlihat.
13. tabung disentrifugasi 13.500 rpm (13.000-16.000 x g) selama 3 menit, pada temperatur
ruangan. Pellet protein yang berwarna coklat tua akan terlihat.
14. Supernatant dipindahkan kedalam tabung microcentrifuge bersih dan steril yang telah diisi
dengan 300 μl isopropanol (temperatur ruang).
15. Tabung dibalikan perlahan-lahan beberapa kali supaya larutan bercampur hingga terlihat
DNA strands seperti benang-benang putih.
16. Setelah itu tabung disentrifugasi pada 13.500 rpm (13.000-16.000 x g) selam 1 menit pada
temperatur ruangan. DNA akan terlihat sebagai pellet kecil yang putih.
17. Supernatant dibuang dan ditambahkan 300 μl ethanol 70 % temperatur ruang) kedalam
DNA tersebut. Bolak-balikan tabung perlahan beberapa kali untuk mencuci pellet DNA,
tabung disentrifugasi lagi seperti pada langkah 15 diatas.
18. Dengan hati-hati aspirasikan ethanol (menggunakan micropipette), jangan sampai
pelletnya terbuang. Kemudian tabung diletakan secara terbalik diatas kertas absorbent dan
keringkan diudara selama 10-15 menit.
19. Terakhir tambahkan 100 μl ”DNA Rehydration Solution” kedalam tabung tersebut dan
rehidrasi DNA dengan menginkubasikan larutan dengan cara menepuk tabung perlahan
atau boleh juga dengan cara membiarkannya pada 4oC selama satu malam.
20. Larutan DNA dapat disimpan pada temperatur 2-8oC atau pada temperatur -20oC untuk
waktu yang cukup lama.
TUGAS PRAKTIKUM ISOLASI DNA
1. Sebutkan syarat spesimen yang akan di lakukan ekstraksi / isolasi DNA?

2. Jelaskan prinsip tahapan awal pada prosedur isolasi DNA ?

3. Sebutkan fungsi masing-masing reagen pada isolasi DNA diatas dan hasil dari tahapan
dengan penmabahan reagensia ini

No Reagen Fungsi * Hasil**

1 Cell Lysis Solution
2 Nuclei Lysis Solution
3 Protein Precipitation
Solution
4 Isopropanol
5 Ethanol 70 %
*BISA DITULISKAN DI BAWA TABEL
** BISA DITULISKAN DI BAWA TABEL
4. Jelaskan proses / tahapan percobaan lanjutan yang dapat dilakukan terhadap isolat yang di
dapat?